Name: 顺序在体内成骨干/祖细胞在骨折修复的影像学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: 了解活体显微成像技术用于追踪骨折修复中内源性成骨干/祖细胞的迁移、增殖与分化动态。该方法为骨再生机制研究及骨折愈合治疗提供了重要的可视化工具。

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感谢 C. Park 对手稿的审阅。本工作由美国国立关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所（NIAMS）资助，资助编号为 K01AR061434，以及白血病与淋巴瘤学会（Leukemia & Lymphoma Society）博士后奖学金（5127-09）授予 D.P.，同时获得美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）对 C.P.L. 和 D.T.S. 的资助。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。

1. 小鼠与预处理
注意：所有小鼠均饲养于无病原体环境中，所有实验方案均经麻省总医院机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。所有手术操作均应使用经高压灭菌的无菌器械，在无菌条件下进行。 Mx1-Cre15, Rosa26-loxP-stop-loxP-EYFP （Rosa-YFP），以及 Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato （蔷薇-番茄）, 购自杰克逊实验室。 Osteocalcin-GFP 小鼠由Henry Kronenberg博士提供。用于OSPC迁移和增殖的定量分析 体内, Mx1-Cre+Rosa-YFP+ （单色报告基因）小鼠被用于更详细地追踪其向分化的过程 骨钙素+ 成熟的成骨细胞，我们使用了三重转基因 Mx1-Cre+Rosa-Tomato+Ocn-GFP+ 小鼠
<ol>
	<li>标记 Mx1+ 细胞 体内，用无菌PBS溶液配制聚胞苷酸-聚肌苷酸（pIpC，2.5 mg/ml），按每20 g体重注射200 μl Mx1-Cre+ 每两天一次，连续10天，通过腹腔注射将报告基因小鼠给药。</li>
	<li>为了消除常驻 Mx1+ 造血细胞，在单次照射剂量为9.5 Gy的条件下对小鼠进行照射。照射后24小时，移植野生型骨髓细胞（1×10⁶）6 细胞/小鼠，静脉注射16。注意：由于 Mx1可诱导细胞包括造血细胞和由造血细胞衍生的破骨细胞，其消除 Mx1+ 造血细胞提高了成像质量和定量分析的准确性 Mx1+ 成骨细胞</li>
	<li>骨髓移植后，需对动物进行四到六周的监测，以确保供体骨髓细胞成功重建造血。</li>
</ol>
2. 小鼠准备
<ol>
	<li>按照IACUC批准的操作规程，通过腹腔注射50 μl的氯胺酮/赛拉嗪（氯胺酮100 mg/kg，赛拉嗪12 mg/kg体重）对小鼠进行麻醉。注意：可通过追加一次氯胺酮/赛拉嗪剂量来延长麻醉作用时间。</li>
	<li>通过轻捏脚趾和/或尾巴无反应来判断小鼠是否已完全麻醉。（可选）小鼠麻醉后，用胶带将异氟烷气体面罩固定于鼻部，并调节异氟烷浓度以确保动物处于充分镇静状态。</li>
	<li>使用电动剪刀或小剪刀剪除头皮毛发。清除毛发碎屑，并用70%酒精棉片消毒暴露的皮肤。涂抹眼用凝胶以防止角膜脱水。</li>
</ol>
3. 微骨折损伤
<ol>
	<li>确认动物已完全镇静后，做一个倒L形切口以打开头皮皮肤。具体而言，先做一个横向切口（长度小于1 cm），从一侧耳部延伸至另一侧耳部。然后转向约60°，继续向鼻部方向切开，直至距离鼻部约2-3 mm处。注意：该切口可最大限度减少成像区域上方瘢痕组织的形成。</li>
	<li>用镊子将皮瓣向两侧拉开，充分暴露额骨以及矢状缝与冠状缝的交界处。</li>
	<li>用无菌PBS冲洗并用无菌纱布或棉签轻轻擦拭创面，直至彻底清除所有残留毛发。</li>
	<li>为在颅骨上制造微骨折，用一只手固定小鼠头部，另一只手持30 G针头。在左侧额骨靠近矢状缝与冠状缝交界处，以轻微压力并配合旋转动作，将30 G针头尖端刺入颅骨，形成一个微穿孔（直径约0.2 mm，深度&#60;1 mm）。注意：必须避免针头刺入脑组织，以最大限度减少出血和组织损伤。</li>
	<li>更换为较大针头（20 G或25 G），通过旋转针头扩大穿孔至约0.5 mm直径。</li>
	<li>重复步骤3.3–3.5，在对侧额骨上制造第二个穿孔。</li>
	<li>持续滴加PBS并擦拭损伤部位，直至出血停止。 
	注意：骨折部位出血会影响成像质量，并诱发瘢痕形成。</li>
	<li>在颅骨表面滴加一滴无菌生理盐水或2% Methocel，防止干燥。注意：切勿让颅骨表面干燥，否则会降低成像清晰度。应使用足量的凝胶或盐水完全覆盖成像区域。</li>
</ol>
4. 活体成像
<ol>
	<li>（可选）成像前，可对部分小鼠注射血管染料以可视化血管。通过眼眶后注射方式注入 80 ml PBS 中稀释的 20 μl 非靶向 Qtracker 705（50 mM 硼酸盐缓冲液中的 2 μM 溶液）。使用胰岛素注射器以尽量减少试剂浪费。若信号亮度不足，可能需要增加注射量。</li>
	<li>打开扫描仪。注意：基于多边形的激光扫描仪可实现多通道图像的同步采集，速率达视频帧率（每秒 30 帧）。视频速率扫描对活体动物成像至关重要。</li>
	<li>打开多光子激光器（飞秒钛：蓝宝石激光器）。将波长设为 880 nm，并调节功率以实现骨组织的二次谐波成像（440 nm）。对于 GFP 和 tdTomato 的激发，开启 491 nm 和 561 nm 的固态激光器。</li>
	<li>为每个信号开启光电倍增管（PMT）检测器（二次谐波信号使用 435 ± 20 nm 带通滤光片，GFP 使用 528 ± 19 nm 带通滤光片，tdTomato 使用 590 ± 20 nm 带通滤光片）。（可选）使用 638 nm 氦氖激光器及配备 695 ± 27.5 nm 带通滤光片的 PMT 检测 Qtracker 705 信号。</li>
	<li>将动物置于 XYZ 轴电动显微镜载物台上。使用电加热垫使小鼠保持最舒适的位置，以维持体温（降低动物丢失风险）。用胶带固定小鼠，以减少成像过程中的移动，并尽可能使成像区域保持水平。</li>
	<li>在颅骨上滴加一滴温热的 2% 甲基纤维素凝胶或生理盐水溶液，防止干燥。在成像区域覆盖盖玻片。使用低倍物镜（30 倍水浸物镜，NA 0.9）扫描颅顶骨。</li>
	<li>通过 XYZ 轴控制器，利用骨组织产生的 SHG 信号定位颅顶骨表面，并识别关键解剖标志位置，例如矢状缝与冠状缝的交点。获取图像并记录 XYZ 坐标。</li>
	<li>继续通过观察 SHG 和荧光信号，寻找损伤位置。</li>
	<li>当找到损伤部位或感兴趣区域时，获取包含目标细胞 SHG 和荧光信号的最佳焦平面图像。保存 XYZ 坐标以及距矢状缝与冠状缝交点的距离，以精确定义该位置，供后续成像轮次使用。</li>
	<li>为获取骨折损伤的三维细胞与骨结构图像，从骨内膜表面开始，以 Z 轴堆栈（Z-stacks）方式记录图像（间隔 2–5 μm），深度约 100 μm。完成一侧损伤区域成像后，重复成像流程以获取其他损伤部位图像。</li>
</ol>
5. 术后操作步骤
<ol>
	<li>成像完成后，用无菌生理盐水冲洗成像部位，以去除颅骨上的甲基纤维素凝胶。使用无菌棉签，在表面涂抹少量三联抗生素软膏。覆盖皮瓣并用外科缝合线重新缝合头皮。可使用低致敏性缝合线（可吸收聚乳酸-羟基乙酸共聚物缝合线）和5-0规格的缝合针进行操作。注意：良好的缝合技术可最大限度减少瘢痕形成。</li>
	<li>术后48小时内，每隔12小时对所有动物进行一次腹腔注射0.05–0.1 mg/kg的布托啡诺。将动物置于温暖的恢复室中，直至其恢复足够意识。术后3至5天，重新打开缝合处，并重复活体成像步骤，以追踪骨折愈合过程中的细胞变化。</li>
</ol>

<ol><li>Harada, S., Rodan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+osteoblast+function+and+regulation+of+bone+mass%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of osteoblast function and regulation of bone mass.</a> Nature. 423, 349-355 (2003).</li>
<li>Manolagas, S. C., Parfitt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+old+means+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">What old means to bone.</a> Trends Endocrinol Metab. 21, 369-374 (2010).</li>
<li>Khosla, S., Riggs, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+age-related+bone+loss+and+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinol+Metab+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of age-related bone loss and osteoporosis.</a> Endocrinol Metab Clin North Am. 34, 1015-1030 (2005).</li>
<li>Friedenstein, A. J., Chailakhyan, R. K., Latsinik, N. V., Panasyuk, A. F., Keiliss-Borok, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cells+responsible+for+transferring+the+microenvironment+of+the+hemopoietic+tissues.+Cloning+in+vitro+and+retransplantation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Stromal cells responsible for transferring the microenvironment of the hemopoietic tissues. Cloning in vitro and retransplantation in vivo.</a> Transplantation. 17, 331-340 (1974).</li>
<li>Mendez-Ferrer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+and+haematopoietic+stem+cells+form+a+unique+bone+marrow+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche.</a> Nature. 466, 829-834 (2010).</li>
<li>Park, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+Bone+Marrow+MSCs+Are+Dynamic%2C+Fate-Restricted+Participants+in+Bone+Maintenance+and+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Endogenous Bone Marrow MSCs Are Dynamic, Fate-Restricted Participants in Bone Maintenance and Regeneration.</a> Cell Stem Cell. 10, 259-272 (2012).</li>
<li>Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+remodeling+during+fracture+repair%3A+The+cellular+picture%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture.</a> Semin Cell Dev Biol. 19, 459-466 (2008).</li>
<li>Holstein, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapamycin+affects+early+fracture+healing+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Rapamycin affects early fracture healing in mice.</a> Br J Pharmacol. 154, 1055-1062 (2008).</li>
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<li>Kovar, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared-labeled+tetracycline+derivative+is+an+effective+marker+of+bone+deposition+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Near-infrared-labeled tetracycline derivative is an effective marker of bone deposition in mice.</a> Anal Biochem. 416, 167-173 (2011).</li>
<li>Mayer-Kuckuk, P., Boskey, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+promotes+progress+in+orthopedic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging promotes progress in orthopedic research.</a> Bone. 39, 965-977 (2006).</li>
<li>Lo Celso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-animal+tracking+of+individual+haematopoietic+stem%2Fprogenitor+cells+in+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche.</a> Nature. 457, 92-96 (2009).</li>
<li>Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+targeting+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Inducible gene targeting in mice.</a> Science. 269, 1427-1429 (1995).</li>
<li>Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+bone+marrow+transplantation+%28BMT%29%3A+providing+optimal+veterinary+and+husbandry+care+to+irradiated+mice+in+BMT+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%3A+JAALAS%22%5BJournal%5D)">Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 48, 11-22 (2009).</li>
<li>Tu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osterix+overexpression+in+mesenchymal+stem+cells+stimulates+healing+of+critical-sized+defects+in+murine+calvarial+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Osterix overexpression in mesenchymal stem cells stimulates healing of critical-sized defects in murine calvarial bone.</a> Tissue Eng. 13, 2431-2440 (2007).</li>
</ol>

作者声明不存在相互竞争的经济利益。

骨骼干细胞的调控对于确立更优的骨再生方法可能具有重要意义。在细胞水平上进行定量和连续成像在技术上一直具有挑战性。尽管小鼠长骨骨折模型已被广泛用于生物力学研究17，但其深部组织位置、骨折尺寸不均、软组织损伤以及需使用稳定固定装置等因素，限制了连续的活体成像。本文提供了一种结合共聚焦/双光子活体显微镜与小鼠颅骨骨折模型的方法，以克服上述局限。该方法结合成骨干细胞/前体细胞谱系示踪，展示了其在骨折修复过程中对成骨干细胞/前体细胞进行实时、体内成像的能力。
该方法中的一个主要技术挑战是随时间获得一致且高质量的图像。最大成像深度下的高质量图像取决于荧光报告分子的亮度以及成像区域的组织状态。此外，为实现长期连续成像，减少激光暴露以避免组织损伤和光漂白至关重要。使用视频速率平台进行快速扫描有助于实现这一目标。若单个视野无法覆盖整个损伤区域，可通过采集拼接图像来绘制区域图谱，以涵盖大部分骨折部位。在整个成像过程中，需在Z轴堆叠图像的质量与所获取信息量之间进行权衡。例如，切片数量较多的Z轴堆叠（例如 1-2 μm 的步长）和高分辨率图像更易于...

导致骨质疏松性骨折风险升高的退行性骨病及年龄相关性骨量丢失已成为公共卫生领域的主要挑战1。骨组织的维持由成骨细胞（骨形成细胞）和破骨细胞（骨吸收细胞）共同调控。成骨细胞功能缺陷是年龄相关性骨量丢失和退行性骨病的主要原因2,3。尽管已有大量研究致力于促进骨折愈合，但发现能够有效治疗退行性骨病并逆转骨质疏松性骨折脆弱性的可靠药物仍是当前的重要课题。因此，研究成骨细胞的来源及其在骨再生与修复过程中的调控机制，为增强骨骼再生能力及逆转骨丢失疾病提供了新的思路。
骨髓中存在多能间充质细胞，这一观点基于已鉴定出具有克隆形成能力的细胞群体，这些细胞可分化为成骨、成脂和成软骨谱系 离体4. 最近，多项研究报道，骨骼干细胞/间充质干细胞（SSCs/MSCs）是成骨细胞的天然来源，在骨转换、骨重塑及骨折修复过程中发挥关键作用5,6此外，我们的谱系示踪研究发现，成熟的成骨细胞具有出乎意料的短半衰期（约60天），在正常稳态和骨折修复条件下均持续由其干细胞/前体细胞补充。6。然而， 体内 干细胞的身份及其对骨折损伤的反应和提供成骨细胞的能力尚不明确。因此，建立一种能够在生理条件下分析内源性SSCs/MSCs迁移、增殖和分化的方法至关重要。
骨折修复是一个由多种复杂细胞因子和生长因子调控的多细胞动态过程7。目前骨折研究最常用的方法是采用长骨骨折的动物模型，并通过骨组织切片和免疫荧光技术对骨组织进行分析8-10。该修复过程可通过多种成像技术进行监测，包括显微CT11、近红外荧光成像12和化学发光成像13。然而，每种技术均存在一定的局限性，目前尚无有效方法可在活体（in vivo）水平上于细胞层面监测骨骼干细胞（SSCs）/间充质干细胞（MSCs）的功能。近年来，共聚焦/双光子活体显微成像技术已被开发并用于在活体动物中，以单细胞分辨率检测移植的癌细胞和造血干细胞在其骨髓微环境中的行为14。通过将该技术与一系列谱系示踪模型相结合，我们发现成骨干细胞/祖细胞可通过myxovirus resistance-1（Mx1）启动子的瞬时激活实现遗传标记，且Mx1诱导产生的祖细胞能够长期维持大部分成熟成骨细胞，但在成年小鼠中不参与软骨细胞的生成6。此外，我们还证明了在骨折愈合过程中，新生成的成骨细胞主要来源于Mx1标记的骨源性祖细胞（OSPCs）6。
此处利用骨系追踪模型和活体显微技术，提供了一种定义 体内 动力学 Mx1+&#160;骨折修复中的成骨干细胞/祖细胞。本方案提供连续成像技术，用于追踪成骨干细胞/祖细胞向骨折部位的迁移过程，并对早期修复阶段中成骨祖细胞的扩增进行定量测量。该方法可适用于多种研究场景，包括评估促进骨修复的潜在治疗候选物。

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J (H-2b)</td><td>杰克逊实验室（美国缅因州巴港）</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮注射液</td><td>Bionichepharma</td><td>67457-001-10</td><td>&amp;nbsp;西林瓶规格：10 ml (50 mg/ml)</td></tr><tr><td>无菌赛拉嗪溶液</td><td>Lloyd 公司</td><td>NADA# 139-236</td><td></td></tr><tr><td>盐酸丁丙诺啡</td><td>BEDFORD 实验室</td><td>NDC 55390-100-10</td><td>西林瓶：0.3 mg/ml，剂量：0.05–0.1 mg/kg</td></tr><tr><td>DPBS, 1X</td><td>CORNING cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>酒精消毒棉片（70% 异丙醇）</td><td>Kendall WEBCOL</td><td>5110</td><td></td></tr><tr><td>精细外科剪刀</td><td>F.S.T</td><td>14568-09</td><td></td></tr><tr><td>超细镊子</td><td>F.S.T</td><td>11150-10</td><td></td></tr><tr><td>VICRYL*Plus 缝合线</td><td>Ethicon</td><td>VCP490G</td><td></td></tr><tr><td>Qtracker 705 非靶向量子点</td><td>Invitrogen</td><td>Q21061</td><td></td></tr><tr><td>甲基纤维素 2%</td><td>OmmiVision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pIpC（聚肌苷酸-聚胞苷酸）&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P0913-50MG</td><td>每 10 g 小鼠给予 100 &amp;mu;l（PBS 中 2.5 mg/ml）</td></tr><tr><td>Mai Tai 可调谐超快激光器</td><td>Spectra Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dual Calypso 491 + 532 nm DPSS 激光器</td><td>Cobolt AB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Radius-635 HeNe 激光器</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

依次 体内 骨折修复过程中成骨干细胞/祖细胞的成像

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

骨骼不断更新，并在受伤后具有很强的再生能力。人们长期以来一直推测成骨干细胞/祖细胞可能存在，但 体内 此类细胞的展示直到最近才得以实现。此处， 体内 提供用于研究内源性成骨干细胞/祖细胞（OSPCs）及其子代细胞在骨修复中作用的成像技术。利用成骨细胞谱系示踪模型及对颅骨诱导微骨折进行活体成像，可在损伤后最初数天内直接观察OSPCs，此阶段正是骨修复早期关键事件发生的时期。通过连续成像可追踪损伤部位，揭示OSPCs向损伤区域迁移、数量增加并分化为成骨细胞的过程。这些方法为研究干细胞内在及外在分子调控因子在骨再生与修复中的作用提供了有效手段。

稳定的长骨骨折模型在骨折研究中被广泛应用。然而，长骨或大范围骨折模型会造成多种组织损伤，因此在骨细胞功能的定量测量方面存在局限性。我们采用针钻在颅骨额骨上建立了一种微创损伤模型（直径小于1 mm，对硬脑膜的侵入极小或无侵入）图1A-1C）。我们选择颅顶额骨的顶部视图进行观察 体内 活体成像微骨折，因为这种骨具有扁平且薄的骨结构并含有骨髓，可在无其他组织干扰的情况下清晰成像受损骨组织、骨细胞及血管系统（图1C我们观察到，这种微骨折重现了大骨折损伤的许多特征，包括软性骨痂形成，随后是矿物质沉积和新骨形成（数据未显示）。
对Mx1+成骨干细胞前体细胞进行连续的活体成像。 接下来，我们检测了该方法是否能够追踪骨折愈合过程中特定的成骨细胞群体。此前，我们通过将Mx1-Cre小鼠与Rosa26-Tomato报告小鼠及骨钙素-GFP小...

对骨折愈合过程中骨祖细胞功能进行定量测量，需要高分辨率的连续成像技术。本文提供了利用活体显微镜结合成骨谱系示踪技术，对内源性成骨干细胞/祖细胞在修复骨骨折过程中的迁移、增殖和分化进行连续成像与定量分析的实验方案。

骨骼不断进行更新，并在损伤后具有很强的再生能力。人们长期以来一直推测成骨干细胞/祖细胞的存在，但在……

本实验的总体目标是依次追踪并定量分析内源性成骨干细胞及其祖细胞在骨骨折修复过程中的迁移、增殖和分化。该目标首先通过向体内注射聚胞苷酸（poly-cytidylic acid）标记混合病毒、流感病毒抗性基因1（MX1）阳性细胞，随后利用照射清除体内原有的MX1阳性造血细胞来实现。第二步，系统性地将野生型骨髓细胞注入经照射的小鼠体内。接下来，通过针头钻孔在小鼠Cal区域诱导产生微骨折。最后，对微骨折修复过程进行连续的活体成像。最终，这些活体图像可用于评估成骨干细胞及其前体细胞向骨折部位迁移和扩增的动力学过程。因此，该技术的主要优势在于能够在骨折愈合过程中对成骨干细胞及其祖细胞进行活体重复成像。该技术的应用前景可拓展至骨折愈合及骨质疏松症的治疗，因为该方法为监测骨骼再生与修复过程中内源性的成骨干细胞及其祖细胞提供了一种新工具。该方法的可视化演示至关重要，因为产生微骨折时需尽量减少组织损伤，同时在体内反复成像骨折损伤过程又不引起严重瘢痕形成，这对该方法的成功实施具有重要意义，但在技术上具有挑战性。为了在活体内标记MX1阳性细胞，首先每两天一次、连续10天，按每20克MX1-Cre报告小鼠体重腹腔注射200微升多聚酸性多聚胞苷酸。随后，为清除体内原有的MX1阳性造血细胞，对注射过的小鼠进行单次9.5 Gy剂量的照射。照射24小时后，每只小鼠静脉移植1×10⁶个野生型骨髓细胞。四周至六周后，通过腹腔注射 50 微升氯胺酮-赛拉嗪混合液使小鼠麻醉。通过脚趾夹捏确认麻醉成功后，剪除骨髓细胞移植小鼠头部的毛发，并用 70% 酒精棉片消毒暴露的皮肤。涂抹眼用凝胶以防止角膜脱水，然后从一侧耳朵开始至另一侧耳朵结束，在头皮上做一个长度小于一厘米的横向切口。接着，将动物体位旋转约 60 度，并使用镊子继续延长切口，直至距离鼻部约二至三毫米处为止。将组织瓣向动物两侧牵拉，以分离皮肤，此时额骨及矢状缝与冠状缝的交界处应清晰暴露。用无菌 PBS 冲洗暴露的表面，然后用棉签轻轻擦去残留的毛发。接着，为在颅骨上制造微骨折，用一只手固定小鼠头部，另一只手持30号针头。使用30号针头在额骨一侧靠近矢状缝与冠状缝交界处轻轻钻出一个微小穿刺孔。为避免刺入脑组织，更换为较粗的针头，并旋转新针头将穿刺孔扩大至直径约0.5毫米。在对侧额骨生成第二个穿刺孔后，持续向每个穿刺点滴加PBS，并擦拭直至出血停止。然后，为避免干燥，向颅骨表面滴加足量的无菌生理盐水，以完全覆盖用于获取Vidal图像的区域。首先启动基于多边形的激光扫描仪，以实现每秒30帧视频速率的多通道同步图像采集。接着打开飞秒钛宝石激光器，进行双光子成像。将功率和波长设置为880纳米，用于颅骨的二次谐波成像，以及在440纳米处激发GFP和TD番茄荧光蛋白；开启491纳米和561纳米的固态激光器。然后开启每个信号对应的光电倍增管探测器：二次谐波成像使用

sequential-vivo-imaging-osteogenic-stemprogenitor-cells-during

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

顺序<em&gt;在体内</em&gt;成骨干/祖细胞在骨折修复的影像学

人类血管周围干细胞（PSCs）是一类新型干细胞，可用于骨骼组织再生，其功能类似于间充质干细胞（MSCs）。PSCs可通过FACS（荧光激活细胞分选）从标准吸脂手术中获取的脂肪组织中分离，随后与成骨诱导性支架材料结合，以实现骨形成。 体内.

使用人血管周围干细胞进行骨再生

本文介绍了一种基于改良Ilizarov外固定器应用的长骨骨折稳定方法1-3。在安装固定器并制造骨损伤后，可对骨愈合过程进行评估，实施牵张成骨，或制造骨不连或临界尺寸缺损，用于研究治疗干预措施。...

创建刚性固定的骨折模型以评估膜内成骨、牵张成骨或临界尺寸缺损的愈合

造血干细胞与祖细胞（HSPCs）与骨髓微环境之间相互作用的性质尚不明确。通过定制的硬件改装和多步骤采集方案，可结合双光子显微镜与共聚焦显微镜进行成像 离体...

体内 成年小鼠颅骨骨髓中造血干细胞与祖细胞的四维追踪

本方案描述了马源间充质干细胞的放射性标记及其向马肌腱损伤部位的植入，以通过伽马闪烁显像技术确定细胞存活率和组织分布情况。...

体内成像与追踪锝-99m标记的马骨髓间充质干细胞治疗肌腱病

在软骨内骨愈合过程中，评估骨折愈合组织中组织发育情况对于监测愈合进程至关重要。本文报道了一种适用于小鼠股骨的磁共振成像（MRI）兼容外固定装置，可在小鼠骨再生过程中实现MRI扫描。...

体内评估小鼠股骨骨折愈合过程中骨痂发育：采用一种适用于小鼠股骨的磁共振成像兼容骨固定装置

小鼠闭合性股骨骨折模型是研究骨折愈合及加速骨再生新型治疗策略的有力平台。本手术方案的目标是通过使用髓内钢针固定股骨，在小鼠体内建立单侧闭合性股骨骨折。...

小鼠闭合性股骨骨折的建立：一种用于研究骨愈合的模型

骨细胞外基质（BEM）骨肉瘤（OS）模型已得到充分建立，如图所示。该模型可作为模拟原发性肿瘤生长的合适支架 体外...

三维骨细胞外基质骨肉瘤模型

本方案描述了利用活体动物活细胞显微镜实时检测CCL5介导的骨膜骨骼干细胞迁移的方法。...

实时成像小鼠骨膜骨骼干细胞在CCL5诱导下的迁移

本方案描述了一种在小鼠股骨上建立骨干骨折并用髓内钢针固定的外科手术方法，用于骨折愈合研究。...

建立小鼠股骨骨干骨折模型

小鼠骨髓损伤模型是研究出生后通过膜内成骨进行骨形成的有效工具。该简化的手术方案描述了骨髓消融操作，可用于后续评估损伤后新骨形成及细胞反应。...

通过小鼠骨髓损伤模型研究出生后膜内成骨的改进方法

了解活体显微成像技术用于追踪骨折修复中内源性成骨干/祖细胞的迁移、增殖与分化动态。该方法为骨再生机制研究及骨折愈合治疗提供了重要的可视化工具。

依次体内骨折修复过程中成骨干细胞/祖细胞的成像

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依次 体内 骨折修复过程中成骨干细胞/祖细胞的成像

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