顺序在体内成骨干/祖细胞在骨折修复的影像学
2014年5月23日
在骨折愈合的骨祖细胞功能的定量测量需要高分辨率串行成像技术。这里，提供了用于使用活体显微镜和骨谱系追踪以顺序图像和量化修复骨骨折的处理内源性骨干/祖细胞的迁移，增殖和分化的协议。
该程序的总体目标是依次跟踪和量化骨折修复中内源性成骨干细胞和祖细胞的迁移、增殖和分化。这是通过首先通过多细胞多胞症 ILIC 酸注射液标记 mixo 病毒、流感病毒耐药性、体内 1 或 MX 1 阳性细胞，然后通过照射消除常驻的 MX 1 阳性造血细胞来实现的。在第二步中，将野生型骨髓细胞系统地施用给受照射的小鼠。
接下来，通过针钻在小鼠 Cal 区域产生微裂缝。最后，进行微骨折修复的序贯小瓶内成像。最终，这些活体图像可用于评估成骨干细胞和祖细胞流入和扩展到骨折部位的动力学。
因此，该技术的主要优点是允许在骨折愈合过程中对成骨干细胞和祖细胞进行体内重复成像。这项技术的影响延伸到骨折愈合和骨质疏松症的治疗。由于这种方法为监测骨再生和修复中的内源性成骨干细胞祖细胞提供了一种新工具。
这种方法的视觉演示至关重要，因为产生组织损伤最小的微骨折，并且在不诱导严重疤痕形成的情况下对骨折损伤进行重复体内成像对于该方法很重要，并且在技术上具有挑战性要在体内标记 MX one 阳性细胞，首先每 20 克 MX one Cree 报告小鼠体重腹膜内注射 200 微升多酸性多胞细胞伊利酸，每隔一天注射一次10 天。然后，为了消除常驻的 MX one阳性造血细胞，用单剂量的 9.5 gras 照射注射的小鼠。24 小时后，每只小鼠静脉内移植 1 次 10 至第 6 野生型骨髓细胞。
4 至 6 周后，腹膜内注射 50 微升氯胺酮甲苯噻嗪麻醉小鼠 捏脚趾确认镇静后，夹住骨髓细胞移植小鼠的头皮对，然后用 70% 酒精棉签对暴露的皮肤进行消毒。涂抹泪液凝胶以防止角膜脱水，然后在头皮上做一个不到一厘米长的横向切口，从一只耳朵开始，到另一只耳朵结束。接下来，使用镊子将动物旋转约 60 度并继续切口，直到它从鼻子达到约 2 到 3 毫米。
将组织瓣拉向动物侧面以分离皮肤，额骨以及矢状线和冠状缝线的交点现在都应该清楚地暴露出来。用无菌 PBS 冲洗开放表面，然后用棉签轻轻擦去残留的毛发。然后要在犊牛上产生微骨折，一只手握住鼠标头，另一只手握住 30 号针头。
使用 30 号针尖在矢状缝和冠状缝交界处附近的额骨一侧轻轻钻孔。为避免穿透大脑，切换到更大的规格并扭转新针头，将穿刺孔扩大到直径约 0.5 毫米。在对侧额骨上产生第二次穿刺后，将 PBS 连续滴入每个擦拭点，直到出血停止。
然后为避免干燥，在颅骨上滴入足量的无菌生理盐水溶液，以完全覆盖该区域以获取 Vidal 图像。首先打开基于多边形的激光扫描仪，以允许以每秒 30 帧的视频速率同时进行多通道图像采集。接下来，打开飞秒钛蓝宝石激光器进行多光子成像。
将功率和波长设置为 880 纳米，以便在 440 纳米处对颅骨进行二次谐波生成成像，用于 GFP 和 TD 番茄激发，打开 491 纳米和 561 纳米固态激光器。然后为每个信号打开光电倍增管检测器：一个用于二次谐波产生的 435 正负 20 纳米带通滤波器，一个用于 GFP 的 528 正负 19 纳米带通滤波器和一个用于 TD 番茄的 590 正负 20 纳米带通滤波器。现在，将动物放在 XYZ 轴电动显微镜载物台上，放在设置为 37 摄氏度的电加热垫顶部。
使用胶带将鼠标固定到位，然后将一滴温热的 2% 甲基纤维素基凝胶滴在颅骨上。为避免干燥，请在成像区域放置盖玻片。然后使用具有 0.9 数值孔径的 30 倍水浸物镜和 XY、Z 轴控制器来检测来自骨骼的 SHG 信号。
要找到犊牛的表面，请确定一个关键的地标位置，例如矢状缝合线和冠状缝线之间的交点，并获取图像。标记标志的 XY、Z 坐标，然后使用 SHG 和荧光信号作为指导继续搜索受伤位置。找到每个感兴趣的区域后，获取包含来自感兴趣细胞的 SHG 和荧光信号的最佳焦平面的图像。
保存 XY、Z 坐标和到矢状缝和冠状缝交点的距离，以定义它们为下一轮成像的精确位置。然后收集骨折损伤的 3D 细胞和骨骼结构。以大约 2 到 5 微米的 Z 堆栈间隔记录图像，距离内膜骨表面约 100 微米的深度。
最后，在对两个损伤部位进行成像后，使用多滴无菌盐水从颅骨中去除 2% 甲基纤维素凝胶。现在用抗生素涂覆表面，用皮瓣覆盖颅骨，用低过敏性缝合线重新闭合头皮，并将动物放在温暖的恢复室中，直到它恢复足够的意识。三到五天后，重复活体成像步骤以跟踪骨折愈合过程中的细胞变化。
在这个具有代表性的实验中，在基因 MX 的额骨上产生了两个微骨折，一个番茄骨钙素，GFP 小鼠在照射和骨髓置换后微骨折的连续 3D 活体内成像显示番茄阳性成骨茎和祖细胞在骨折部位的重新定位在第二天， 以及他们在第 5 天的扩张。虽然此时未检测到 GFP 阳性成骨细胞，但在第 12 天，骨折表面附近的一部分骨祖细胞启动了番茄阳性 GFP 阳性成骨细胞的分化，如箭头所示，第 21 天新成骨细胞的积累和新骨形成表明成骨祖细胞的迁移和增殖是提供新成骨细胞以治愈骨折的主要机制。为了测试该方法在骨折愈合过程中是否提供一致和定量的骨祖细胞数量输出，在受伤后 14 天跟踪 MX one YFP 阳性成骨干细胞和祖细胞。
到 3 天时，在损伤部位持续检测到少量祖细胞。细胞数量在第 7 天持续增加，在第 10 天达到峰值，持续 14 天。通过测量 YFP 信号强度随时间的变化来量化骨祖细胞产生的动力学，并与活体显微镜观察到的动力学相关联。
祖细胞在第 3 天首次观察到，在第 10 天达到峰值，并在第 14 天保持类似的高强度。在尝试此程序时，重要的是要记住，熟练的缝合技术和最少的出血可以减少疤痕的形成并降低背景自发荧光。看完这个视频，你应该对骨折修复过程中如何成像和追踪内源性成骨干细胞的迁移、增殖和分化有很好的了解。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本研究介绍了一种使用活体显微镜定量测量骨前体细胞在骨折愈合过程中功能的方法。所概述的协议能够跟踪和成像内源性成骨干/祖细胞，当它们在响应骨损伤时迁移、增殖和分化。
研究的关键组成部分
科学领域
- 神经科学
- 骨生物学
- 成像技术
背景
- 骨折需要涉及干/祖细胞的有效愈合过程。
- 活体显微镜允许实时成像细胞动态。
- 理解这些过程可以为骨折和骨质疏松的治疗提供信息。
- 现有方法缺乏在体内反复可视化这些细胞的能力。
研究目的
- 开发一种在骨折修复过程中跟踪成骨干/祖细胞的技术。
- 评估骨折部位细胞流入和扩展的动态。
- 为可重复性提供该方法的视觉演示。
使用的方法
- 使用聚胞苷酸酸注射标记特定细胞类型。
- 通过辐射消除驻留造血细胞。
- 通过针刺钻孔在颅骨诱导微骨折。
- 使用先进显微技术对骨折修复过程进行连续成像。
主要结果
- 成功在体内跟踪内源性成骨干/祖细胞。
- 展示了在骨折部位的细胞迁移和分化。
- 建立了一种无显著组织损伤的重复成像方法。
- 对骨再生所涉及的细胞机制的洞察。
结论
- 该技术提供了一种研究骨愈合动态的新方法。
- 它对改进骨折愈合治疗具有潜在意义。
- 未来的应用可能扩展到理解骨质疏松治疗。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables direct visualization and quantification of endogenous osteogenic stem/progenitor cell dynamics during fracture repair, providing mechanistic insights into bone regeneration. By tracking cell migration, proliferation, and differentiation in vivo, it supports target validation and de-risking in osteoporosis and fracture healing therapeutic development. The approach offers a reproducible platform for evaluating stem cell-intrinsic and extrinsic regulators, enhancing predictive confidence in preclinical decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracking osteogenic stem/progenitor cell relocation and expansion at injury sites.
- Operational Value: Provides quantitative readouts of cell influx and proliferation kinetics for functional target validation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by linking cellular dynamics to bone formation outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, reproducible imaging outputs for assessing compound effects on stem cell behavior.
- Operational Value: Establishes a scalable intravital imaging workflow for longitudinal monitoring of cellular responses.
- Assay Readiness: Produces quantifiable YFP signal intensity metrics correlated with progenitor cell kinetics over time.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects early cellular events to late-stage bone formation, supporting mechanistic de-risking.
- Operational Value: Enables continuity from discovery through preclinical validation by tracking progenitor differentiation into osteoblasts.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions based on validated cellular mechanisms of repair.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through preclinical research by providing dynamic, quantitative cellular readouts that inform therapeutic strategy.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing stem cell responses to injury in real time.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible imaging data for evaluating modulator effects on progenitor cell migration and proliferation.
- Analytics: Generates quantitative YFP signal intensity measurements over time, enabling correlation with histological endpoints.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical stages by linking progenitor cell dynamics to osteoblast differentiation and bone formation.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable intravital imaging platform for multiple bone regeneration studies across therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in bone repair pathways.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through sequential intravital imaging protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of osteoporosis and fracture healing candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization based on validated stem cell-mediated mechanisms of action.
Implementation Considerations
- Requires expertise in intravital microscopy, mouse surgery, and fluorescent cell labeling techniques.
- Depends on multiphoton laser scanning infrastructure with specific wavelength and filter sets for SHG and fluorescence detection.
- Necessitates cross-team standardization for consistent microfracture induction and imaging interval execution.
- Involves adaptation considerations when applying the model to different bone sites or disease contexts.
- Limited by the technical challenge of minimizing tissue damage and scar formation during repeated imaging sessions.
