Name: 骨肉瘤的三维骨细胞外基质模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 了解利用脱细胞骨细胞外基质构建骨肉瘤三维模型的方法。该技术模拟原发性肿瘤生长，用于研究骨肉瘤的组织学和细胞遗传异质性，为骨肿瘤药物敏感性研究提供理想体外模型。

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作者感谢刘莹陈在骨细胞外基质支架构建过程中提供的行政支持，以及长赵提供的出色技术支持。本研究由国家自然科学基金（31871413）资助。

动物饲养和使用均在获得中山大学动物伦理委员会批准后，依照美国国立卫生研究院《实验动物饲养和使用指南》（NIH出版物第80-23号，1996年修订版）进行。
1. 骨组织准备
<ol>
	<li>取4至6周龄的BALB/c小鼠（无性别要求）。通过颈椎脱位法无菌处死小鼠，并用无菌手术剪从后肢剪下新鲜的腓骨、胫骨和股骨。剥离表皮组织，然后使用剪刀和镊子尽可能去除大部分软组织。</li>
	<li>在6 cm培养皿中，用无菌的10 mM磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗腿骨两次，以去除血液。将骨骼浸入75%乙醇中3分钟，然后用PBS冲洗两次。清洁后的骨骼可置于无菌的50 mL离心管中，加入无菌PBS，在-80 °C下保存数月，直至使用。
	 
	注意：后续所有步骤中使用的PBS均含有10 mM PO43−。</li>
</ol>
2. 骨组织脱矿质与脱细胞化
<ol>
	<li>将冷冻的骨骼在室温下解冻，然后于 -80 °C 再次冷冻 1 小时。对骨骼进行 2–3 次以上的冻融循环，以实现细胞裂解和组织破坏。</li>
	<li>将骨骼置于无菌的 50 mL 离心管中，加入 0.5 N HCl，在室温下于摇床或轨道振荡器上轻轻摇动过夜，确保骨骼被完全且均匀地浸润。 
	注意：确保在振荡过程中骨骼始终完全浸没在酸液中，不发生沉降。HCl 溶液体积应超过骨骼体积的十倍以上。</li>
	<li>脱钙后，彻底倾去 HCl 溶液，并用流动水冲洗 1 小时。随后，在摇床或轨道振荡器上用蒸馏水洗涤两次，每次 15 分钟。 
	注意：每次洗涤之间以及最后一次蒸馏水洗涤后，必须彻底去除残留溶液或水。</li>
	<li>用甲醇与氯仿按 1:1 比例配制的混合液，在包裹锡箔的 50 mL 离心管中室温处理 1 小时，以提取脱矿骨骼中的脂质10。</li>
	<li>然后将骨骼转移至另一含有甲醇并包裹锡箔的离心管中，室温处理 30 分钟。彻底去除甲醇后，用蒸馏水轻轻振荡洗涤两次，每次 15 分钟。倾去最后一次洗涤的水，并在无菌条件下进行后续操作。 
	注意：在提取过程中必须避光，以防止氯仿分解。混合液可储存于避光容器或包裹锡箔的离心管中。所有处理和洗涤步骤均应在轻柔旋转或摇动条件下进行。</li>
	<li>将骨骼置于 6 cm 培养皿中，用无菌 PBS 冲洗 3 分钟，然后转移至新的 50 mL 离心管中。&#160;向管中加入 40 mL 无菌 0.05% 胰蛋白酶-EDTA（TE），在 37 °C 的 CO2 培养箱中孵育 23&#160;小时18。</li>
	<li>弃去 TE 溶液，用含 90 μg/mL 氨苄青霉素和 90 μg/mL 卡那霉素的无菌 PBS 洗涤两次。彻底倾去最后一次 PBS 洗涤液后，补充 40 mL 无菌 PBS。在室温下轻轻摇动或振荡，充分洗涤 24 小时，使抗生素充分渗透。 
	注意：本步骤及后续步骤中使用的所有无菌 PBS 均含有 90 μg/mL 氨苄青霉素和 90 μg/mL 卡那霉素。通过长时间旋转或摇动洗涤，确保抗生素充分浸润孔隙空间，实现有效灭菌。</li>
	<li>去除 PBS，将骨骼转移至装有无菌 PBS 的新鲜 50 mL 离心管中。制备完成的脱矿脱细胞骨骼称为骨细胞外基质（BEM），可在 4 °C 下保存 2 个月，直至使用。</li>
</ol>
3. 细胞接种与培养
<ol>
	<li>从4 °C冰箱中取出BEM，浸入75%乙醇中30秒，然后用PBS冲洗两次。将BEM转移至洁净的6孔细胞培养板中，加入2 mL完全培养基（含5%胎牛血清、90 μg/mL氨苄青霉素和90 μg/mL卡那霉素的Dulbecco改良Eagle培养基/F12（DF12））。在37 °C、CO2培养箱中孵育过夜。</li>
	<li>获取人骨肉瘤细胞系（MNNG/HOS和MG-63）。用含酚红作为指示剂的100 μL PBS重悬约1.0 × 105个骨肉瘤细胞。 
	注意：为了更有效地追踪和观察三维BEM模型中的多层细胞，MNNG/HOS和MG-63细胞已感染表达荧光mCherry和绿色荧光蛋白（GFP）的慢病毒载体。</li>
	<li>待BEM完全浸润于培养基后，从近端或远端骨骺处将骨肉瘤细胞注入BEM，直至针头到达BEM的髓腔。将骨肉瘤-BEM模型在37 °C、5% CO2湿化环境中孵育至少2小时，以确保注射的细胞牢固黏附于BEM上。 
	注意：所有用于细胞培养的培养基均需预先温育。细胞培养所用培养箱应维持在37 °C、5% CO2的湿化环境。</li>
	<li>向培养板中加入1 mL完全培养基，完全覆盖BEM表面，在37 °C CO2培养箱中过夜培养。</li>
	<li>用无菌镊子将骨肉瘤-BEM模型轻轻转移至新的6孔板孔中，并更换1 mL新鲜培养基。在37 °C CO2培养箱中继续培养14天，根据骨肉瘤细胞的增殖情况定期更换培养基。</li>
	<li>在培养过程中，定期在倒置荧光显微镜下观察培养基颜色及细胞状态。当骨肉瘤细胞扩增至培养板表面时，用无菌镊子将骨肉瘤-BEM模型轻轻转移至另一新孔中。 
	注意：培养基在pH 7.4时呈亮红色，这是大多数哺乳动物细胞培养的最适pH值。若培养基变为橙色甚至黄色，应立即更换，以维持骨肉瘤细胞的健康生长环境。</li>
	<li>用镊子将骨肉瘤-BEM模型转移至新孔中，用PBS轻轻冲洗以去除残留培养基，随后转移至15 mL离心管中，用10%中性缓冲福尔马林固定，用于组织学鉴定。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

通常，骨肉瘤（OS）可根据其主要的组织学成分分为成骨型、成软骨型和成纤维型亚型。其预后不仅取决于组织学参数，还与其解剖部位有关。骨肉瘤可发生于骨内（髓内或皮质内）、骨表面以及骨外部位19。骨肉瘤的发生及其异质性可被解释为致癌事件与适宜的微环境刺激共同作用的结果，随后导致肿瘤不断进展并向远处器官转移20,21,22,23。通过合适的模型描绘针对骨肉瘤微环境和生态位的临床意义，或可揭示骨肉瘤演化过程中的未解之谜。
在塑料培养皿或培养瓶中培养 体外 难以重现动态且复杂的生物微环境。多种模拟骨肉瘤的临床前模型（如小鼠、斑马鱼和犬）已取得显著进展，并被应用于发病机制研究和药物开发。4,<sup class...

骨肉瘤（OS）通常发生在青少年时期骨骼生长活跃的区域，即长骨的干骺端。超过80%的骨肉瘤病灶好发于胫骨近端、肱骨近端以及股骨远端和近端的干骺端，这些部位与生长板的位置相对应1。骨肉瘤包含多种具有间充质特性的细胞亚型，在组织学特征和分级上表现出显著的异质性。现有证据支持骨肉瘤起源于间充质干细胞（MSCs）、定向分化的成骨前体细胞以及壁细胞2,3,4,5。这些细胞可在特定骨微环境信号的影响下，积累&#160;遗传或表观遗传学改变，进而发展为骨肉瘤。内在和外在机制共同导致骨肉瘤基因组的不稳定性与异质性，从而产生多种形态学和临床表型6,7。为了实现个体化治疗或新药筛选，需要建立新的模型以应对肿瘤异质性或其他临床难题。
骨肉瘤（OS）是一种骨内恶性实体瘤。肿瘤周围微环境成分的复杂性和活性赋予了不同位置的OS细胞不同的表型和功能特征。骨细胞外基质（BEM）为矿物质沉积和骨重塑提供了结构和生化支架。细胞外基质（ECM）的有机部分主要由成骨细胞系细胞分泌的I型胶原构成，而其矿化部分则以羟基磷灰石形式存在的磷酸钙组成8。ECM网络的动态作用在于调控细胞黏附、分化、细胞间通讯以及组织功能的维持9。
脱矿质BEM和ECM水凝胶已成功应用于细胞培养，并可促进细胞增殖10,11。合成的类骨ECM可调控间充质干细胞（MSCs）的细胞池大小、命运决定及谱系进展12,13,14。此外，研究结果证实其具有临床意义，可通过在骨形成和再生过程中刺激细胞活动来提供成骨活性15,16,17。
本文中，本研究团队建立了一种改良的三维长期培养模型，提供了一种理想的替代方法。相较于传统的塑料二维培养，注射至组织来源的BEM中的骨肉瘤（OS）细胞迅速呈现出异质性的间充质表型。来源于部位特异性同源组织的BEM展现出显著优势，可作为骨肉瘤细胞的天然微环境。 体外 在骨肉瘤的理论与临床研究中具有巨大潜力。该特征明确的BEM平台简便高效，适用于 体外 研究，并可拓展用于多种癌症的建模。

<table><tbody><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Greiner</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Greiner</td><td>227270</td><td></td></tr><tr><td>6 cm 细胞培养皿</td><td>Greiner</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Greiner</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9393</td><td></td></tr><tr><td>C57-BL/6J 小鼠</td><td>中山大学实验动物中心</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>SHEL LAB</td><td>SCO5A</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>广州化学试剂厂</td><td>BE14-GR-500G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0547</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Hyclone</td><td>SH30084.03</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>BLAU</td><td>717805</td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1487</td><td></td></tr><tr><td>MG-63</td><td>中国科学院上海细胞库</td><td></td><td>人骨肉瘤细胞系</td></tr><tr><td>MNNG/HOS</td><td>中国科学院上海细胞库</td><td></td><td>人骨肉瘤细胞系</td></tr><tr><td>酚红</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4633</td><td>酚红溶液用作 pH 指示剂：其颜色在 pH 6.6 至 8.0 范围内由黄色逐渐变为红色。</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>生工生物</td><td>A100395</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>生工生物</td><td>A501211</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>生工生物</td><td>A501218</td><td></td></tr></tbody></table>

三维骨细胞外基质骨肉瘤模型

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

骨肉瘤（OS）是最常见且高度侵袭性的原发性骨肿瘤，具有解剖学和组织学上的异质性，同时伴随诊断和预后方面的困难。OS包含基因型和表型均呈异质性的癌细胞。研究表明，骨微环境成分在肿瘤异质性和疾病进展中起重要作用。骨细胞外基质（BEM）保留了天然细胞外基质的微结构支架和生化组分。这种组织特异性微环境为OS细胞的接种和增殖提供了有利且持久的支架。本文提供了一种BEM模型的制备方法及其进一步的实验应用方案。OS细胞可在该模型中生长并分化为多种表型，与临床OS标本的组织病理学复杂性一致。该模型还可用于观察不同形态学特征及其与基因改变和潜在调控机制之间的关联。由于与人类骨肉瘤具有同源性，该BEM-OS模型可用于骨肉瘤的病理学及临床研究。

脱矿质和脱细胞处理后，BEM 呈现半透明状，与天然小鼠骨相比具有更强的弹性和韧性。可清晰观察到少量肌肉残留物及骨髓腔空间（图 1A, B）。为确认 BEM 的有效脱细胞效果，将固定后的 BEM 包埋于石蜡中，切片为 3–5 μm 厚度，进行苏木精-伊红（H&amp;E）染色。通过明场成像显示细胞核被彻底清除。脱细胞后的 BEM 中天然的多孔结构和胶原网络排列得以良好保持（图 1C, D）。此外，对骨基质主要有机成分（如 I 型胶原和 IV 型胶原）进行免疫组织化学（IHC）染色，结果显示，与天然骨相比，脱细胞 BEM 中的 ECM 成分未受损伤（图 1E）。因此，BEM 提供了一种具有良好生物相容性的理想且有前景的支架，适用于骨肉瘤细胞的接种与增殖。
MNNG/HOS 细胞表现出高度非典型的形态，胞质呈现...

骨细胞外基质（BEM）骨肉瘤（OS）模型已得到充分建立，如图所示。该模型可作为模拟原发性肿瘤生长的合适支架 体外 为研究骨肉瘤的组织学和细胞遗传学异质性提供了理想模型。

骨肉瘤（OS）是最常见且具有高度侵袭性的原发性骨肿瘤，其特征为解剖学和组织学上的异质性，以及……

该方法为骨肿瘤研究提供了制备功能性支架的有效策略。脱细胞骨细胞外基质对骨肉瘤细胞的存活和活性表现出不同的血清相容性。该技术的主要优势在于，骨源性基质中培养的骨肉瘤细胞呈现出高度异质性的形态，类似于临床骨肉瘤的组织病理学特征。该方法为研究骨肿瘤（如骨肉瘤、尤文肉瘤及其他转移至骨骼的恶性肿瘤）的药物敏感性发生与发展提供了理想的模型。首先，取4至6周龄的BALB/c小鼠，在使用无菌手术剪处死小鼠后，从后肢分离新鲜的腓骨、胫骨和股骨。借助镊子剥离表皮组织，然后尽可能去除全部软组织。用无菌的10 mM PBS溶液在6厘米培养皿中冲洗腿骨两次，以去除血液。将骨骼浸入盛有75%乙醇的培养皿中3分钟，然后用PBS冲洗两次。将清洁后的骨骼保存在无菌的50毫升离心管中，并加入无菌PBS，于-80摄氏度保存。将冷冻的骨骼在室温下解冻，然后在 -80 摄氏度下再次冷冻一小时。对骨骼进行两次以上的冻融循环，以实现细胞裂解和组织降解。随后，将骨骼放入装有 0.5 normal HCl 的无菌 50 毫升离心管中，在室温下置于旋转摇床上过夜孵育，并轻轻摇动，以确保骨骼被充分且均匀地覆盖。脱钙后，彻底倾去盐酸溶液，并用流水冲洗骨骼一小时。随后，使用蒸馏水在轨道摇床上洗涤骨骼两次，每次15分钟。每次洗涤后彻底倾去溶液。为了提取脱矿骨中的脂质，将骨组织置于含有甲醇与氯仿1:1混合液的50毫升离心管中。用锡箔纸包裹离心管以避光，防止氯仿分解。然后将离心管置于旋转摇床上震荡一小时。然后，使用镊子将骨骼转移至另一含有锡箔的甲醇管中，孵育30分钟。彻底去除甲醇，并在旋转摇床上用蒸馏水洗涤两次，每次15分钟。弃去最后一次洗涤的水，并在无菌条件下继续操作。在6厘米培养皿中用无菌PBS冲洗骨骼3分钟。向50毫升离心管中加入40毫升无菌0.05% TE溶液，将骨骼置于37摄氏度二氧化碳培养箱中孵育23小时。弃去TE溶液，随后在旋转摇床上用含90 g/mL氨苄青霉素和90 g/mL卡那霉素的无菌PBS洗涤两次，每次15分钟。最后一次洗涤液完全倾去后，再次加入40毫升含抗生素的无菌PBS。在室温下轻轻振荡彻底洗涤24小时，以实现对多孔空间的有效灭菌。然后，将骨骼转移至含有含抗生素无菌PBS的50毫升离心管中。制备好的骨细胞外基质可在4°C下保存两个月。将BEM放入盛有75%乙醇的培养皿中，手动轻轻摇晃30秒。随后用PBS冲洗两次，每次30秒。将BEM转移至洁净的六孔细胞培养板中，每孔加入2 mL完全培养基。将BEM置于37°C二氧化碳培养箱中过夜培养。在含有酚红指示剂的预热 PBS 100 微升中获取人骨肉瘤细胞系。使用移液器将骨肉瘤细胞悬浮，浓度约为 1 × 10⁵。待 BEM 完全浸润培养基后，从 BEM 的近端或远端骨骺处，将针头刺入骨髓腔，并将骨肉瘤细胞注入 BEM 中。将OS-BEM模型置于37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润环境中孵育至少两小时，以确保注射的细胞牢固黏附于BEM。随后从培养箱中取出培养板，在板上加入1毫升培养基，并将其置于培养箱中过夜，以完全包被BEM培养表面。用无菌镊子将OS-BEM模型轻轻转移至六孔板的新孔中，并加入1毫升新鲜培养基。将模型在培养箱中培养14天。在14天培养期间，持续观察培养基颜色变化。如果培养基变为橙色甚至黄色，应立即更换培养基，弃去一半旧培养基后加入新鲜培养基，以维持骨肉瘤细胞的健康生长环境。持续在倒置荧光显微镜下观察细胞状态。当骨肉瘤细胞扩展至整个培养板时，用无菌镊子轻轻将OS-BEM模型转移至另一个新的孔中。培养14天后，用PBS轻轻冲洗OS-BEM模型以去除培养基。然后将其转移至15毫升离心管中，加入10%缓冲福尔马林固定，用于组织学鉴定。经过脱矿和脱细胞处理后，BEM相较于天然小鼠骨呈现半透明状，且具有更强的弹性和韧性。在骨髓腔空间中可清晰观察到少量肌肉残留。天然骨组织与脱细胞骨基质的明场成像显示，细胞核已被彻底清除。脱细胞骨基质中胶原网络的天然多孔结构得到了良好保留。此外，I型胶原和IV型胶原的免疫组织化学染色显示，脱细胞后小鼠胫骨中细胞外基质的主要成分得以保留。在14天的培养过程中，骨膜和骨内膜均被OS细胞的扩增所浸润。脱细胞骨细胞外基质上的OS细胞表现出高度异质性的形态，类似于骨肉瘤组织切片的细胞病理学特征。在BEM模型中培养14天后进行免疫组织化学分析，显示出在长期培养中的显著优势。此外，OS细胞和BEM培养均高表达骨基质糖蛋白，该蛋白是类骨质基质的特异性标志物。这种体外三维模型已成功用于揭示骨肉瘤去分化的表型异质性及其调控机制。

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科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

骨肉瘤的三维骨细胞外基质模型

在标准培养方法中，细胞被从其生理环境中取出，并在培养皿的塑料表面进行生长。为了研究原代人骨髓细胞的行为，我们建立了一种三维培养系统，使细胞在能够模拟组织天然微环境的条件下生长。...

一种用于研究原代人骨髓及其恶性病变的三维组织培养模型

将癌细胞嵌入胶原凝胶中，然后夹在无细胞的纤维蛋白凝胶内，以构建一种三维培养系统，在该系统中可监测癌细胞的侵袭性及卫星肿瘤的形成。...

三维培养实验用于探究癌细胞侵袭性及卫星肿瘤形成

直接注射癌源性细胞外囊泡（EVs）可导致骨髓重编程，从而促进肿瘤进展；然而，介导这一效应的具体细胞类型尚不明确。本文中，我们描述了一种逐步操作的实验方案，用于研究EV介导的肿瘤-间充质干细胞（MSC）相互作用。...

一种用于定义肿瘤细胞与间充质干细胞间由细胞外囊泡介导通讯的骨肉瘤小鼠临床前模型

本文介绍了一种从李-佛美尼综合征（Li-Fraumeni Syndrome, LFS）患者来源的成纤维细胞诱导生成诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs），通过间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）将iPSCs分化为成骨细胞，并建立疾病模型的方法 体内 使用LFS患者来源的成骨细胞研究肿瘤发生。...

利用Li-Fraumeni综合征患者来源的诱导性多能干细胞建立骨肉瘤模型

骨转移模型的转移发生并不均匀，且发生率并非100%。直接骨内注射肿瘤细胞可能导致肺栓塞。我们提出一种通过将实体瘤移植物植入骨骼来模拟原发性骨肿瘤和骨转移的技术，该方法可实现可重复的移植物植入与肿瘤生长。...

利用实体瘤移植物骨内植入建立原发性骨肿瘤与骨转移模型

本文列出了在先前描述的三维胶原基支架上接种神经母细胞瘤细胞系所需的步骤，包括在预定时间内维持细胞生长，并回收支架以进行多种细胞生长和细胞行为分析及后续应用，可根据不同的实验目的进行调整。...

三维 体外 基于胶原支架的神经母细胞瘤仿生模型

本实验方案描述了通过胫骨内注射骨肉瘤细胞，建立携带原位骨肉瘤及肺转移病灶的小鼠模型。...

胫骨内骨肉瘤细胞注射法建立原位骨肉瘤及肺转移小鼠模型

在此，我们介绍一种易于实施、标准化的微生理系统，该系统能够反映人类骨髓的复杂性 体内...

用于研究生理或肿瘤环境下骨髓内细胞动态及其相互作用的人类骨髓三维模型

本方案描述了利用人骨肉瘤组织建立患者来源的异种移植（PDX）小鼠模型的方法。...

建立人骨肉瘤组织来源的患者异种移植小鼠模型

我们提出了一种在多个层次水平上评估骨再生的实验方案。该多模态方法能够实现跨不同长度尺度的结构分析，有效解决了样本制备中的挑战，并为评价生物材料促进骨再生的效果提供了可靠的分析流程。...

评估骨再生与支架性能的多模态方法

本方案描述了利用嵌入甲基丙烯酰化明胶（GelMA）水凝胶并添加脱细胞外基质的人类成骨细胞构建三维骨组织的方法。该方法成本低、可扩展，并且兼容基础实验室设备，为研究肌肉骨骼疾病过程提供了一个具有转化潜力的平台。...

一种利用人成骨细胞和脱细胞细胞外基质建立骨骼肌肉疾病模型的三维骨培养平台

了解利用脱细胞骨细胞外基质构建骨肉瘤三维模型的方法。该技术模拟原发性肿瘤生长，用于研究骨肉瘤的组织学和细胞遗传异质性，为骨肿瘤药物敏感性研究提供理想体外模型。

三维骨细胞外基质骨肉瘤模型

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