骨肉瘤的三维骨细胞外基质模型
April 12th, 2019
骨肉瘤 (OS) 的骨细胞外基质 (BEM) 模型已经建立, 并在此进行了展示。它可作为模拟原发肿瘤体外生长的合适支架, 为研究 os 的组织学和细胞生成异质性提供了理想的模型。
该方法为骨肿瘤研究准备功能支架提供了有效的策略。去细胞化骨外结基质，显示骨肉瘤细胞生存和活动的可变血清相容性。该技术的主要优点是骨源基质中骨肉瘤细胞培养表现出与临床骨肉瘤组织病理学类似的高异质形态。
该方法为研究骨肉瘤、尤因肉瘤等骨肿瘤的药物敏感性的发展、进展和其他恶性肿瘤转移到骨骼提供了理想的模型。首先，获得四到六周大的BALB/c小鼠，使用无菌手术剪刀对小鼠实施安乐死后，从后肢上切掉新鲜的纤维、头骨和股骨。在钳子的帮助下，剥离上皮组织，然后去除尽可能多的软组织。
用无菌的 10 mM PBS 溶液冲洗腿骨两次，以去除六厘米培养皿中的血液。用75%乙醇将骨头浸入盘中三分钟，然后用PBS冲洗两次。将干净的骨头存放在无菌的 50 毫升离心管中，并配有无菌 PBS 管，温度为 80 摄氏度。
在室温下解冻冷冻的骨头，然后在80摄氏度下再次冻结一小时。使骨骼接受两个多的冷冻循环，用于细胞分解和组织分解。然后，将骨骼放在充满0.5个正常HCl的无菌50毫升离心管中，并在室温下在轨道摇床上孵育过夜，轻轻摇晃，以确保骨骼的完整甚至覆盖。
去钙化后，将盐酸溶液完全解毒，并在自来水下冲洗骨骼一小时。然后，使用蒸馏水在轨道摇床上每次洗涤骨骼两次，洗涤 15 分钟。完全删除解决方案。
要提取脱华骨骼中的脂质，请将骨骼放入50毫升离心管中，并含有甲醇和氯仿的1:1混合物。用锡箔包裹管子，避免光线，防止氯仿分解。把管子放在轨道摇床上一个小时。
然后，用钳子将骨头转移到另一管用锡箔的甲醇中，30分钟。完全去除甲醇，用蒸馏水两次在轨道摇床上洗涤15分钟。去最后洗水，在无菌条件下继续。
用无菌 PBS 在六厘米的培养皿中冲洗骨骼三分钟。将 40 毫升无菌 0.05%TE 溶液加入 50 毫升离心管中，在 37 摄氏度的二氧化碳培养箱中孵育骨骼 23 小时。丢弃TE溶液，用无菌PBS冲洗两次，辅以90 g/mL安西林和90克/mL卡纳霉素，在轨道摇床上冲洗15分钟。
完全洗涤后，再次补充40毫升无菌PBS抗生素。在室温下用轻轻的摇动彻底清洗24小时，实现多孔空间的有效灭菌。然后，将骨骼转移到充满无菌 PBS 的 50 毫升离心管中，并配有抗生素。
准备好的骨外细胞基质可以在四摄氏度下储存两个月。将 BEM 浸入 75%乙醇中，用手轻轻摇动盘子 30 秒。然后用 PBS 冲洗 30 秒，两次。
将 BEM 转移到干净的六井细胞培养板上。向每井添加两毫升完整的培养介质。在37摄氏度的二氧化碳培养箱中孵育一夜的 BEM。
在含有指标酚红色预加热PBS的100微升中获取人类OS细胞系。使用移液器将大约浓度为 1 倍 10 到 5 的 OS 细胞挂起。BEM完全浸泡在介质中后，从近近体或远近表皮，刺穿针头到 BEM 的乳膜腔，将OS细胞注入 BEM 中。
在37摄氏度的加湿5%二氧化碳大气中孵育OS-BEM模型至少两小时，以确保注射细胞牢固地粘附在 BEM 上。然后，从培养箱中取出盘子。在盘子上加入一毫升培养介质，并将其放在培养箱中过夜，以完全覆盖 BEM 培养物的表面。
轻轻将 OS-BEM 模型转移到六井板的新井中，并配有无菌钳子，然后重新喂养一毫升新鲜培养基。培养孵化器14天的模型。在14天的孵育期间，保持监测中等颜色。
如果介质变成橙色，甚至黄色，立即刷新介质，丢弃一半的旧介质并加入新介质，以维护操作系统细胞的健康环境。在倒荧光显微镜下保持监测细胞状态。当操作系统细胞膨胀到板，轻轻地转移OS-BEM模型到另一个新的井与无菌钳子。
培养 14 天后，使用 PBS 轻轻冲洗 OS-BEM 模型以去除培养介质。然后转移到15毫升离心管中，并加入10%缓冲的甲醛，用于组织学鉴定。去军事化和去细胞化后，BEM看起来半透明，与本地小鼠骨骼相比具有更强的弹性和韧性。
可以清楚地观察到肌肉腔空间中的一点肌肉残留物。原生骨和去细胞化 BEM 的亮场成像显示细胞核的彻底去除。胶原蛋白网络排列中的天然多孔结构在去细胞化的 BEM 中维护良好。
此外，胶原蛋白 I 和胶原蛋白 IV 的免疫组织化学染色表明，细胞外基质的主要成分在去细胞化后保留在小鼠头骨中。在14天的培养中，周一和内分都渗透在OS细胞的膨胀中。去细胞化 BEM 上的 OS 细胞显示高度异质形态，类似于 OS 部分的细胞病理学特征。
在 BEM 模型中培养 14 天后进行免疫组织化学分析，在长期培养中显示出巨大的优势。此外，OS细胞和 BEM 培养，高度表达骨基质蛋白，这是特定于骨质质的。这个体外三维模型已经被用来证明表型异质性和骨肉瘤去分化的调节机制，并取得了成功。
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概述
骨细胞外基质（BEM）模型用于骨肉瘤（OS）已经建立为模拟体外原发肿瘤生长的合适支架。该模型有助于研究OS的组织学和细胞源异质性。
关键研究组成部分
科学领域
- 骨肿瘤研究
- 骨肉瘤
- 组织病理学
背景
- BEM模型对于理解骨肉瘤至关重要。
- 去细胞化骨细胞外基质显示可变的血清相容性。
- 骨肉瘤细胞在该模型中表现出异质性形态。
- 该模型反映了临床骨肉瘤的组织病理学。
研究目的
- 研究骨肿瘤的发展和进展。
- 评估骨肉瘤和相关肿瘤的药物敏感性。
- 为体外研究提供功能性支架。
使用的方法
- 去细胞化骨细胞外基质的制备。
- 在骨源基质中培养骨肉瘤细胞。
- 利用BALB/c小鼠获取骨样本。
- 组织制备的手术技术。
主要结果
- 在BEM模型中培养的骨肉瘤细胞显示异质性形态。
- 该模型模拟了骨肉瘤的临床组织病理学。
- 可变的血清相容性支持细胞存活和活动。
- 提供了关于药物敏感性和肿瘤进展的见解。
结论
- BEM模型对于研究骨肉瘤是有效的。
- 它为体外研究提供了一个现实的环境。
- 该方法增强了对骨肿瘤生物学的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
The three-dimensional bone extracellular matrix (BEM) model provides a physiologically relevant scaffold for osteosarcoma (OS) research, enabling the study of tumor heterogeneity and phenotypic plasticity in vitro. By preserving the native bone microenvironment, this model supports mechanistic de-risking in target validation and preclinical evaluation of bone-tumor therapeutics. It offers translational continuity from discovery to lead identification by recapitulating clinical histopathology and genetic regulatory mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through phenotypic heterogeneity that mirrors clinical OS specimens.
- Operational Value: Supports biological de-risking by maintaining extracellular matrix components critical for tumor-stroma interactions.
- Predictive Value: Enhances target confidence by linking morphological diversity to genetic alterations and regulatory mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized, reproducible 3D culture system for consistent compound screening across OS phenotypes.
- Operational Value: Enables quantitative readouts via immunohistochemical staining for collagen I/IV and bone matrix glycoprotein to assess matrix deposition and osteoid formation.
- Scalability: Compatible with multi-well plate formats and long-term culture (14 days) for dose-response and time-course studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Maintains disease-relevant system fidelity by recapitulating the histologic complexity of human OS.
- Preclinical Continuity: Supports risk-adjusted advancement decisions by modeling OS cell infiltration into periosteal and endosteal compartments.
- Mechanistic De-risking: Allows visualization of dedifferentiation pathways and association with underlying regulatory networks.
Pipeline & Workflow Integration
The BEM model functions as a discovery-phase tool that bridges target validation and lead identification by providing a disease-relevant system for phenotypic screening and mechanistic interrogation of OS.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on tumor-stroma interactions and phenotypic plasticity in a native bone-derived matrix.
- Screening: Delivers assay-ready scaffolds with quantitative outputs for evaluating drug sensitivities and tumor progression.
- Analytics: Enables comparative analysis through immunohistochemical staining and bright-field imaging of morphological and molecular phenotypes.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by preserving collagen network architecture and supporting long-term OS cell culture.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable platform for studying primary bone tumors and bone metastases across multiple oncology programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through recapitulation of OS histopathology and heterogeneous morphology.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via decellularized bone matrix with preserved extracellular matrix composition.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by reducing biological ambiguity in bone-tumor models.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on phenotypic response in a clinically relevant 3D system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue decellularization, sterile cell culture, and histological processing.
- Dependent on access to animal bone sources and equipment for freeze-thaw cycles, decalcification, and lipid extraction.
- Necessitates cross-team standardization for BEM preparation, sterilization, and OS cell seeding protocols.
- Adaptation considerations include variability in bone source quality and potential residual marrow components affecting consistency.
- Practical limitations include the 24-hour antibiotic wash requirement and two-month storage constraint at 4°C.
