乳腺癌细胞侵袭定量使用三维（3D）模型
2014年6月11日
本文提供的详细方法为使用三维（3D）测定法来量化乳腺癌细胞的侵袭。具体来说，我们将讨论建立这样的检测要求的程序，量化和数据分析，以及方法来探讨及细胞膜的完整性，当细胞侵入发生的损失。
以下程序的总体目标是使用 3 维侵袭测定评估癌细胞的侵袭能力。这是通过首先在基底膜基质中培养癌细胞来实现的。然后通过光学显微镜观察基质的细胞侵袭 5 天或更长时间。
在最后一步中，用荧光抗体标记细胞以定位目标蛋白质。最终，可以通过免疫荧光显微镜分析癌细胞侵袭的速率和由此产生的蛋白质表达变化。与现有技术（如 Transwell 室浸润测定）相比，该技术的主要优点是 3D 主要凝胶侵袭测定更好地模拟了癌症解决生长的体内环境。
该技术对癌症治疗的影响，可以在研究中鉴定出参与癌症侵袭和转移的新蛋白质。在开始培养程序之前，将基底膜基质、P 200 移液器和移液器吸头置于 4 摄氏度的冰上过夜。第二天，使用冰冷的 200 微升移液管的尖端将 50 微升基质以螺旋状铺在共聚焦 1 号玻璃底培养皿的底部。
然后将培养皿放入 37 摄氏度、含 5% 二氧化碳的细胞培养箱中至少 30 分钟，同时基质正在固化胰蛋白酶眼，一旦细胞开始分离，就会成为 70% 至 80% 汇合的 100 毫米细胞板。用 10 mL 培养基灭活胰蛋白酶，然后将细胞悬液转移到 15 mL 锥形管中。在细胞离心下降时，将细胞在 100 Gs 和 4 摄氏度下离心 3 分钟。
将 50 μL 基质分装到每皿基底膜基质的 1 ml 微量离心管中，并在细胞完成旋转后将试管置于冰上。吸出上清液而不干扰沉淀，然后复苏。将细胞悬浮在一毫升培养基中，然后计数。
将 2.5 乘以 10 转移到第四个细胞中，转移到新的微量离心管中，用培养基加满细胞悬液，最终体积为 50 μL。然后以 1：1 的比例将 50 μL 冰冷的基底膜基质加入细胞中，最终体积为 100 μL。将基质与细胞混合物轻轻铺板到固化的基底膜基质上，并让细胞嵌入细胞培养箱的基质中。
30 分钟后，用 2 毫升培养基覆盖基质，然后将培养皿放回培养箱中，在实验期间每天更换培养基，在实验期间每天使用一次光学显微镜的 10 倍物镜，以采集 20 次差分干扰。悬浮在基底膜基质中的菌落的对比图像。盲目分析图像以确定细胞集落星状形成。
如果观察到细胞类固醇的一个或多个投射，则认为菌落是星状的。要检查 3D 集落的形态发生特征，请从培养箱中取出细胞并将它们放在冰盘上。吸出培养基，然后用 2 毫升冷 PBS 洗涤菌落 3 次。
最后一次洗涤后，将细胞在 2 毫升 20% 丙酮、80% 甲醇溶液中在 4 摄氏度下固定 20 分钟，然后将培养皿放回室温。一旦基底膜基质处于室温，吸出固定剂并用 PBS 洗涤板 3 次，如刚才所示。最后一次洗涤后，在室温下用 2 mL 3% BSA 阻断细胞上的任何非特异性结合至少 30 分钟。
然后在室温下将细胞置于用 3% BSA 稀释的目标一抗中孵育。一小时后，用 PBS 洗去未结合的一抗 3 次后去除一抗溶液，加入适当稀释度的溶于 3% BSA 的二抗，并在室温下避光孵育细胞 1 小时。用 PBS 洗去未结合的二抗后，在 PBS 中用 2 毫升十六进制 3、3、2、5、8 对细胞核进行黑暗染色 5 分钟。
然后用 PBS 从细胞中洗涤未结合的 heext 五次。第五次洗涤后，将封固剂直接添加到基质上到细胞混合物中，并用玻璃盖玻片小心地覆盖封固剂，以防止破坏基底膜基质与细胞混合物的完整性。在室温下将培养皿干燥过夜，然后用荧光显微镜以适合这些图像中使用的抗体的激光波长获取图像。
说明了侵入 3D 基质的 MDA MB 2 3 1 细胞。细胞在第 1 天嵌入基质中，到第 3 天开始形成侵袭性星状结构。到第 5 天，可以观察到基质的完全侵入。
然后计算形成的星状菌落的数量，并表示为每个培养皿的侵袭性和非侵袭性菌落总数的百分比。此外，由于测量每天完成 5 天，因此也可以在这些免疫荧光图像中评估侵袭率。MDA MB 2 3 1 细胞的代表性侵袭性星状集落显示膜完整性丧失和基底膜蛋白层粘连蛋白 5 的弥漫定位，这与在 MDA MB 2 31 乳腺癌细胞中观察到的情况形成鲜明对比。
层粘连蛋白 5 定位于完整的基底膜层，该膜层包围了未经处理的非恶性 MCF 10 A 细胞的记忆 asinine。在此程序之后，可以进行与基质细胞的共培养以回答其他问题，例如癌细胞在发育后是否与微环境中的基质细胞串扰。这项技术为肿瘤学领域的研究人员探索癌症侵袭和迁移铺平了道路，这两者都是癌细胞转移扩散所必需的。
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概述
本文提供了三维（3D）检测方法来量化乳腺癌细胞侵袭。这些程序包括建立检测、定量和数据分析，以及检查细胞侵袭过程中膜完整性的损失。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 癌症研究
背景
- 癌细胞的侵袭能力对于理解转移至关重要。
- 3D检测比传统方法更好地模拟体内环境。
- 荧光标记允许进行详细的蛋白质定位研究。
- 光学显微镜用于观察细胞侵袭随时间的变化。
研究目的
- 评估乳腺癌细胞的侵袭能力。
- 分析侵袭过程中蛋白表达的变化。
- 改进研究癌细胞行为的方法。
使用的方法
- 在基膜基质中培养癌细胞。
- 通过光学显微镜观察细胞侵袭五天或更长时间。
- 用荧光抗体标记细胞以进行蛋白质定位。
- 使用免疫荧光显微镜分析侵袭率和蛋白表达变化。
主要结果
- 3D侵袭检测有效地模拟了体内环境。
- 在侵袭过程中观察到显著的蛋白表达变化。
- 该方法提供了癌细胞侵袭的可靠定量。
- 结果表明对癌细胞行为的理解得到增强。
结论
- 3D大凝胶侵袭检测优于传统技术。
- 该方法可以为癌症转移研究提供更好的见解。
- 未来的研究可以在这些方法基础上进行进一步研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantifying breast cancer cell invasiveness in a physiologically relevant 3D microenvironment enables mechanistic de-risking of invasion pathways and supports target validation in oncology drug discovery. This approach improves predictive confidence by modeling cell-ECM interactions that drive metastatic potential, informing early go/no-go decisions. The method aligns with discovery-stage efforts to identify regulators of epithelial-mesenchymal transition and stromal crosstalk.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by assessing how genetic or pharmacological perturbations affect invasive stellate colony formation in a basement membrane model.
- Operational Value: Enables functional validation of candidate invasion regulators through quantitative imaging of membrane integrity loss and protein mislocalization.
- Scientific Value: Supports phenotypic screening of compounds that modulate cytoskeletal dynamics or ECM remodeling in a disease-relevant system.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, quantitative readouts of invasion kinetics and stellate formation for reproducible compound evaluation across screening campaigns.
- Operational Value: Establishes a scalable 3D culture platform compatible with immunofluorescent readouts, enabling multiplexed analysis of invasion and biomarker expression.
- Scientific Value: Facilitates assay readiness for target de-risking by linking invasive behavior to changes in key proteins such as laminin five.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models disease-relevant cell-microenvironment interactions to study stromal co-culture effects on invasion, supporting mechanistic continuity from discovery to preclinical validation.
- Operational Value: Provides a quantitative framework to assess how microenvironmental cues modulate invasive potential, informing risk-adjusted advancement decisions.
- Scientific Value: Enables evaluation of translational biomarkers associated with loss of epithelial integrity during invasion, aligning with preclinical mechanism-of-action studies.
Pipeline & Workflow Integration
The 3D invasion assay integrates into the oncology discovery continuum from target hypothesis testing through lead optimization, providing functional validation of targets implicated in metastasis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying how gene knockdown or overexpression alters invasive capacity in a 3D ECM context.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs such as stellate colony percentage and invasion rate over time, enabling reliable compound screening.
- Analytics: Generates measurable endpoints including invasive colony counts and protein localization patterns that allow side-by-side comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects invasion phenotypes to microenvironmental signaling, supporting biomarker alignment when stromal interactions are tested.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for evaluating invasion across multiple breast cancer models and therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing reliance on artificial 2D systems that fail to capture invasion-relevant signaling.
- Operational Value: Promotes standardization and reproducibility through defined matrix preparation, embedding protocols, and blinded image analysis.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of metastasis-associated targets, reducing late-stage attrition due to poor predictive models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of invasion-modulating candidates based on functional evidence from a physiologically relevant assay.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D cell culture, fluorescent microscopy, and image analysis for stellate colony quantification.
- Dependent on access to basement membrane matrix, confocal glass-bottom dishes, and fluorescent antibody panels for protein localization.
- Necessitates standardization across teams for consistent matrix solidification, cell embedding, and daily imaging protocols.
- Involves adaptation considerations when extending to different cancer types or stromal co-culture systems.
- Limited by the need for manual image analysis and the semi-quantitative nature of stellate scoring without automated image processing pipelines.
