三维培养试验探索肿瘤细胞浸润和卫星肿瘤形成

该程序的总体目标是将胶原包埋的癌细胞夹在纤维蛋白凝胶中，以生成用于监测卫星肿瘤侵袭和形成的 3D 培养系统。我们的 3D 图片系统可以为研究癌细胞凋亡或迁移过程中的各种细胞和许多关键变异或评估抗癌细胞丢失的疗效提供新的途径。这种 3D 细胞培养模型的一个吸引人的特点是能够改变额外细胞基质的浓度或使用另一种额外细胞基质来组装 3D 系统。

演示该程序的是 Marie-France Cote。我的实验室研究助理，以及我指导下的研究生 Audrey Turcotte。首先将冻干大鼠尾筋 1 型胶原蛋白以高速设置混合 5 次 2 分钟混合，以均匀分散胶原蛋白。

当胶原蛋白被掺入时，用适当的酶分离溶液收获感兴趣的肿瘤细胞。后跟台盼蓝排除计数。在 DMEM 中将解离的细胞稀释至每栓浓度 50， 000 个细胞。

胶原蛋白准备好后，用移液快速将 1， 250， 000 个细胞添加到胶原蛋白溶液中，以均匀分散细胞。立即将 200 μL 单细胞悬液分配到 96 孔板的每个孔中。每次添加后，轻轻敲击工作区域表面的板，以去除任何气泡并将溶液均匀分布在孔内。

添加完所有细胞后，将板置于 37 摄氏度的培养箱中至少两小时，如果要培养细胞过夜，则在前两小时后向每个孔中加入 100 微升培养基。要制备第一个纤维蛋白凝胶层，请在打开小瓶之前将冻干纤维蛋白原加热至室温，以避免形成水合物晶体。然后将纤维蛋白原转移到玻璃烧杯中，向粉末中滴加 37 摄氏度的 HBSS 以溶解纤维蛋白原碎片。

接下来，用抹刀分解较大的蛋白质块，酌情不时搅拌烧杯以促进混合。吸取悬浮液数次以溶解剩余的蛋白质，并通过 22 微米过滤器过滤对溶液进行消毒。然后立即用 200 微升纤维蛋白原覆盖 24 孔板的每个孔的表面，注意避免气泡。

一旦所有孔都彻底包被，将板倾斜 45 度，然后将 1.5 微升凝血酶溶液滴入一个孔的中心，轻轻地水平旋转板 1 到 2 秒。以相同的方式用凝血酶处理另外 5 个孔后，将板置于层流罩下的稳定水平位置 5 到 10 分钟，直到溶液凝胶化。要立即放置胶原栓，请小心地倾斜板以确认纤维蛋白凝胶已完全聚合。

然后将 96 孔胶原凝胶塞板放在纤维蛋白凝胶 24 孔板旁边，并在每个胶原塞孔中加入一滴 HBSS。接下来，使用微勺将单个胶原蛋白塞转移到 24 孔板中每个第一个纤维蛋白凝胶层的中心。转移完所有塞子后，向每个孔中加入 300 微升纤维蛋白原溶液，然后加入 2.25 微升凝血酶，如刚才所示。

为了在放置胶原蛋白栓子之前用一层薄薄的生长因子还原基底膜包被胶原蛋白栓，请将每个栓子转移到含有 100 微升纯生长因子还原基底膜的冰上的 1.5 毫升离心管中。浸泡两分钟后，将单个涂层胶原蛋白栓转移到每个纤维蛋白层的中心，并在 37 摄氏度下孵育栓塞 5 分钟，以固化生长因子降低的基底膜。然后添加第二个纤维蛋白层，如刚才所示。

当凝胶完全聚合后，用 400 μL 适当的培养基和补充剂填充每个孔。接下来，向孔中添加抗纤维蛋白溶解剂。并在适合待测肿瘤细胞系的条件下孵育 3D 培养物。

在适当的细胞补料日，将板倾斜 30 至 35 度角，并将移液管靠在每个孔壁上倾斜，以吸出培养基而不干扰凝胶。然后向每种凝胶培养物中加入 400 μL 新鲜细胞培养基和抗纤维蛋白溶解剂。这种 3D 细胞培养测定可以直接观察癌细胞从胶原栓迁移到相邻纤维蛋白凝胶中以建立继发性肿瘤，从而将行为或已知转移细胞与非或弱转移细胞的行为进行比较。

例如，在该实验中，许多卫星肿瘤随机分散在含有转移性细胞系 B16 F10 的纤维蛋白凝胶中，而弱转移性 B16 F0 细胞系未观察到卫星肿瘤。相比之下，这些转移性差但局部侵袭性很强的小鼠乳腺癌细胞形成一个径向延伸到纤维蛋白凝胶中的迁移前沿。培养 14 天后，乳腺癌细胞从迁移前沿拉出，形成与乳腺结构非常相似的星状结构。

化疗药物可以在包埋的癌细胞上进行测试，就像在这个代表性实验中一样，其中观察到越来越多的 DNA 片段化伴随着化疗药物诱导的癌细胞凋亡事件的增加。掌握后，这项技术可以在大约 6 小时内完成，也可以分两天完成。取决于初始胶原栓潜伏期。

当我尝试这个程序时，重要的是要防止在中央凝胶和外周凝胶之间的界面上形成间隙，因为它们会降低癌细胞侵入纤维蛋白凝胶的能力。按照此程序，可以在卫星菌落、胶原栓或癌细胞中进行金相或蛋白质组学分析，以鉴定目标基因和蛋白质的差异表达。经过其发展，这项技术为癌症生物学领域的研究人员探索迁移凋亡、转移抑制基因表达铺平了道路，可以终止血管生成到多种癌细胞系。

看完这个视频，你应该对如何将癌细胞包埋在胶原凝胶中并将它们夹在纤维蛋白凝胶中以监测卫星肿瘤的侵袭性和形成有一个很好的了解。