在离体血液灌注大鼠肺备量化单微血管通透性
2014年6月30日
孤立的血液灌注肺的准备，使可视化微血管网络上的肺表面是可行的。在这里，我们描述的方法用实时荧光成像量化单一微血管隔离肺的通透性。
该程序的总体目标是使用基于荧光的方法量化离体大鼠肺的单个微血管的通透性。这是通过首先隔离大鼠肺并用自体血液灌注它们来实现的。该程序的第二步是将左心房微导管插入肺部的一个小区域，以注入 flora four 标记的糊精。
然后在注入标记的糊精时，收集肺微血管的图像。最后一步是使用软件从图像中量化单个微血管的通透性。最终，结果可以显示不同条件下肺微血管通透性的程度，例如在 LPS 治疗后。
演示该程序的将是我实验室的博士后研究员 Kava Kasami 博士首先在确认的麻醉手术平面中对雄性大鼠进行气管切开术。使用 PE 90 气管插管并用缝合线固定。接下来，使用 100 号蝶形针向心脏注入 200 至 21 单位的肝素。
等待一分钟，然后放血。收集血液并用生理盐水放在一边。填充两个由三毫米长 4 厘米的 tigon 管制成的插管，一端呈喇叭形。
现在进行开胸手术。做一个刚好大的切口，让套管进入右心室，然后在一根套管的喇叭形窝中滑向肺动脉。用缝合线固定套管。
使用相同的技术将另一根套管插入左心室的心尖，朝左心房方向。用两毫米宽的脐带固定。现在去除阻碍结缔组织，去除长和心脏以及套管。
将它们转移到培养皿中，肺的膈膜表面向上，三个套管都对齐。将解剖的准备工作移至配备 18 号 Tigon 管的可调节载物台上，该管连接到用作入口和出口管的压力传感器。现在将收集的血液与等体积的 5% 白蛋白溶液混合。
将此混合物添加到加载容器中。以每分钟 14 毫升的速度启动泵。确保管路没有气泡。
在准备工作中。将肺动脉连接到肺入口管，将左心房插管连接到出口管。仔细检查管路中是否有空气，并检查分流器是否打开。
将气管插管连接到第三个压力传感器。通过气管插管用 30% 氧气给肺部充气。将肺部保持在 5 厘米的水压。
现在夹住分流器，以每分钟 14 毫升的速度启动泵。要在灌注期间开始肺灌注，请调整泵以将肺压保持在约 10 厘米水深，并将左心房压保持在 3 厘米水深。首先准备注入血液的肺。
首先，将 40 厘米长的 PE 10 管插入 30 厘米长的 PE 90 管中，构建一根输液管。将 PE 10 管的另一端连接到连接到 1 cc 注射器的 30 号针头上。将连接到肺部的管子末端放在制剂上方，并将输液导管连接到其上。
将输液导管引导至左心房，然后进入肺部，直至遇到阻力。过度用力会伤害肺部。微导管的正确切口至关重要，因为微导管对肺部的任何损害都会降低方案的成功率。
接下来，用环形器填充注射器并将其连接到泵上。以每分钟 10 微升的速度缓慢注入溶液。与肺的其他部分相比，输液部位会逐渐变得苍白，以保持塑料中的肺表面快速湿润，输液部位除外。
现在要观察肺部，通过将 O 形圈连接到 22 毫米盖玻片来创建一个观察窗。使用旋塞阀润滑脂，将 O 形圈固定到试管支架上。然后将窗口放在输注部位上。
通过在盖玻片上摆动 20 倍物镜并聚焦于肺部来完成设置。预计不会有视觉失真。现在用选择的解决方案注入肺部。
在这个例子中，在生理盐水之后，在 60 分钟内通过注射泵将 1 毫升 ZI 偶联的糊精注入肺部。使用成像软件在一小时的输注中每分钟记录一张图像，并在随后的冲洗步骤中继续记录 10 分钟 输注 Fitz 糊精后，以相同的流速再注入肺振铃液至少 10 分钟将其洗掉。后。在分析采集的图像时，对 fit e 输注期间感兴趣区域的最大荧光强度进行评分。
然后对 10 分钟冲洗后残留荧光的最大荧光强度进行评分。用细菌脂多糖处理后使用 fitzy 糊精输注研究血管通透性的变化，因为这是一种广泛使用的 LI 模型.残余拟合 e 荧光在用林格斯处理的微血管中低，但在用 LPS 处理的微血管中高。此外，与林格氏灌注相比，LPS 输注导致通透率指数显着降低，表明像场内所有血管的通透性整体增加。
此外，与林格氏灌注相比，LPS 输注导致通透率指数显着降低，表明像场内所有血管的通透性整体增加。看完这个视频，应该对如何准备离体鸟预防肺、插入左尾微导管和定义微孔渗透性有一个很好的了解。
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概述
本文描述了一种使用实时荧光成像来量化孤立大鼠肺单个微血管的通透性的方法。孤立的血液灌注肺准备允许在肺表面上可视化微血管网络。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 血管生物学
- 荧光成像
背景
- 理解微血管通透性对于研究肺功能至关重要。
- 孤立的肺准备为实验提供了一个受控的环境。
- 荧光成像允许实时观察微血管动态。
- 以往的研究已经显示了各种治疗对血管通透性的影响。
研究目的
- 量化孤立大鼠肺单个微血管的通透性。
- 利用基于荧光的方法进行准确测量。
- 评估诸如LPS处理等条件对微血管通透性的影响。
使用的方法
- 大鼠肺的分离和自体血液灌注。
- 将左心耳微导管插入肺中。
- 将荧光素标记的糊精注入微血管中。
- 在注入过程中收集图像以进行分析。
主要结果
- 实现了单个微血管通透性的量化。
- 结果显示在不同实验条件下通透性存在不同程度的变化。
- 荧光成像提供了微血管网络的清晰可视化。
- 数据支持对治疗对肺微血管影响的进一步研究。
结论
- 该方法有效地量化了孤立肺中的微血管通透性。
- 实时成像是血管研究的宝贵工具。
- 研究结果有助于理解肺对各种刺激的血管反应。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables direct quantification of permeability changes in individual pulmonary microvessels under inflammatory conditions, providing mechanistic insight into vascular leak pathways. By combining isolated lung perfusion with real-time fluorescence imaging, it supports target validation in pulmonary inflammation models and facilitates preclinical assessment of barrier-protective candidates. The approach reduces reliance on endpoint tissue processing, accelerating data acquisition for go/no-go decisions in early discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Measures real-time fluid leak across venular and capillary segments to interrogate therapeutic hypotheses in vascular inflammation.
- Operational Value: Enables side-by-side comparison of permeability responses across vascular beds within the same lung preparation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence intensity readouts to assess compound effects on microvessel permeability.
- Operational Value: Standardizes perfusion and imaging conditions for reproducible, high-content vascular screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links LPS-induced permeability changes to disease-relevant mechanisms of acute lung injury.
- Operational Value: Supports dose-response modeling and pharmacokinetic-pharmacodynamic correlation in preclinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through preclinical efficacy testing, particularly for pulmonary vascular modulators.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by quantifying vascular barrier function in response to inflammatory stimuli.
- Screening: Delivers assay-ready, quantifiable outputs for evaluating compound effects on single-vessel permeability.
- Analytics: Provides permeability index calculations from time-lapse imaging to enable comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects microvascular responses to preclinical models of lung injury via LPS challenge.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing vascular permeability across multiple compound classes and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in vascular leak pathways through direct, single-vessel resolution.
- Operational Value: Standardizes microcatheter infusion and imaging protocols for cross-laboratory reproducibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, quantitative vascular safety signals.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on pulmonary vascular effects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent surgery, vascular cannulation, and fluorescence microscopy.
- Depends on pressure-regulated perfusion systems and intravital imaging infrastructure.
- Necessitates standardization of infusion rates, fluorophore concentrations, and washout protocols across teams.
- Adaptation to other species or disease models may require validation of perfusion parameters and vascular accessibility.
- Practical limitations include technical complexity of microcatheter placement and potential lung trauma from cannulation.
