利用大鼠离体阻力动脉视频显微技术评估血管调控机制

本实验的总体目标是利用分离出的阻力血管来检测其对血管活性刺激的反应性。同时还将展示如何评估平滑肌调控机制及血管被动力学特性的变化。该方法有助于回答血管生物学领域中关于在不同条件下小阻力动脉内皮细胞和血管平滑肌调控机制的关键问题。

该技术的主要优势在于，可将小阻力动脉从实质细胞环境中分离出来，并在维持其正常压力的同时，检测其对血管活性刺激的反应。该技术的应用意义延伸至血管功能障碍的治疗与诊断。此类操作在体内无法实现。

尽管该方法可用于研究外周血管疾病，也可应用于冠状动脉疾病。由于操作精细且需避免损伤动脉，因此该方法的显微套管步骤难以掌握，对其进行直观演示至关重要。在实验当天，用一个两升的锥形瓶配制两升生理盐溶液。

加入20倍浓度缓冲液原液时，需确保溶液持续与气体混合物平衡，并使用磁力搅拌子不断搅拌。接着，在向混合物中加入0.28克磷酸二氢钠时，注意监测pH值。必要时，用巴斯德移液管滴加6 N盐酸或6.5 N氢氧化钠溶液，调节pH值，使其保持在7.4。

然后，向生理盐溶液中加入 1.98 克葡萄糖。接着，通过将 20X 储存液用去离子水稀释，制备 500 毫升无钙生理盐溶液。然后，将 25 毫升 20X 缓冲液原液加入锥形瓶中，并在监测和调节溶液 pH 值的同时，向溶液中加入 0.07 克磷酸二氢钠。

使用四氟乙烯管将装有适当气体混合物的气罐连接到器官浴槽。以足以确保流入血管腔的溶液持续但不剧烈冒泡的速率，持续向溶液中通气。同时，在血管腔内放置一个连接至平衡气体混合物的小型砂芯通气头，以帮助维持生理盐溶液的气体成分。

将生理盐溶液置于一个两升的马里奥特瓶中。在瓶塞中插入一根中央玻璃管，作为储液装置，持续向药理器官浴槽供给生理盐溶液，以供应血管腔室。将马里奥特瓶内中央玻璃管的开口端置于与器官浴槽内生理盐溶液液面相同的高度。

这将确保向器官浴中输送生理盐溶液时保持恒定的静水压力。使用连接至J形玻璃管的聚乙烯管，将马里奥特瓶中的生理盐溶液导入器官浴。对于管腔灌流，使用聚乙烯管将进液移液管连接至由一个66 mL塑料注射器构成的生理盐溶液储液器，该注射器需抬升至可维持所需进液压力的位置。

通过三通阀将压力传感器连接到系统，以监测压力。然后，将流出端移液管连接至一段聚乙烯管，再连接至一个类似于进流端储液器的储液装置，以便生理盐溶液在压力梯度作用下流经血管。同时，使用类似的三通阀和压力传感器连接方式来监测流出端压力。

取出Sprague Dawley大鼠的脑组织，将其置于盛有冰冻生理盐溶液的玻璃培养皿中，保持仰卧位。随后将培养皿置于体视显微镜下。使用Vannas剪刀和Dumont No.5精细镊子从脑组织中分离出大脑中动脉。

然后，使用镊子清除大脑中动脉上残留的脑组织。轻轻夹住切除段的一端，将动脉转移至血管腔室，并小心地将其放入腔室内。接下来，将大脑中动脉穿入流入端微移液管，朝微移液管底部方向轻拉，直至管尖进入动脉管腔内。

用从10-0缝合线中分离出的单股纤维预先制备的环结扎动脉，将动脉固定在流入端移液管上。然后，通过在血管周围收紧第二个缝合环，将大脑中动脉的另一端固定在流出端移液管上，并使用连接在流入端移液管支架上的千分尺将动脉拉伸至其原位长度。使用从10-0缝合线中分离出的单股纤维结扎所有侧支，以维持动脉内的恒定压力。

接下来，建立一个视频显微镜系统，该系统由连接在解剖显微镜上的视频摄像头组成，解剖显微镜再连接至视频测微计和电视监视器。使用此装置测量动脉的内径。在实验前，确保动脉具有适当水平的活性张力，以评估肌源性张力及血管对血管扩张刺激的反应。

除小肠系膜动脉等通常不表现主动静息张力的血管外，其余在静息状态下缺乏主动张力的动脉均应弃用。接下来，向血管腔内逐步增加乙酰胆碱的浓度，并测量血管直径，以检测灌注阻力动脉的内皮依赖性反应性。在此示例中，该动脉表现为内皮功能障碍，其特征是对乙酰胆碱刺激无舒张反应。

实验结束时，向灌注液和灌流液中加入无钙生理盐溶液，以测定动脉的最大直径。利用该测量值计算主动静息张力百分比。在无钙生理盐溶液中观察到动脉达到最大舒张，表明动脉对乙酰胆碱无舒张反应是由于内皮功能障碍所致，而非血管结构重塑导致动脉本身无法舒张。

该图展示了雄性Dahl盐敏感大鼠的三个近交系中分离出的中脑动脉对内皮依赖性血管舒张剂乙酰胆碱的反应。结果显示，在盐敏感亲本品系以及保留盐敏感Renan等位基因的两个近交系中，乙酰胆碱诱导的内皮依赖性舒张反应均缺失。而在盐敏感遗传背景下携带棕色挪威大鼠Renan等位基因的近交系中，血管舒张功能恢复正常，支持了以下假说：盐敏感大鼠的内皮功能障碍是由于Renan基因调控受损所致。

在本实验中，高盐饮食未能消除某一特定大鼠品系中由乙酰胆碱诱导的内皮依赖性舒张反应，研究结果揭示了在膳食盐摄入量升高期间导致血管氧化应激和内皮功能障碍的因素。一旦掌握该技术，若操作得当，可在三至三小时半内完成。在进行该操作时，必须注意小心处理分离的动脉，以避免损伤平滑肌，尤其是内皮层。

在完成该操作后，还可采用其他方法，例如加入血管收缩剂和血管舒张剂或受体拮抗剂，以探讨不同物质对血管反应性的影响机制以及药物对血管作用的机制。该技术建立后，为血管生物学和微循环生理学领域的研究人员提供了探索实验动物和人类不同血管床中小阻力动脉平滑肌及内皮功能的途径。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用该方法评估来自不同血管床的小阻力动脉中内皮和血管平滑肌的调控机制。