Name: 利用大鼠离体阻力动脉的视频显微镜对血管控制机制的评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 学习利用大鼠离体阻力动脉的视频显微镜技术评估血管反应性，研究内皮细胞与平滑肌调控机制。该方法可在体外维持正常压力条件下测试血管活性刺激反应，为血管功能障碍的诊断与治疗提供重要依据。

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作者对Katie Fink和Lynn Dondlinger在本文稿准备过程中提供的宝贵帮助表示诚挚感谢。
基金支持：NIH #R21-OD018309；#R56-HL065289；和 #R01-HL128242。

作者无竞争性财务利益。

如引言所述，本文介绍了利用电视显微镜和离体阻力血管技术来评估血管功能，不仅适用于标准的大鼠模型（如视频中所采用的），也适用于高度特化的基因工程大鼠品系，从而展示这些方法所能提供的新颖而强大的研究视角。利用这些强大技术评估小阻力血管的主动张力和被动力学特性，可为广泛的血管调控机制提供重要信息，包括阻力血管中内皮依赖性的主动张力调节、血管平滑肌在正常及病理生理条件下的功能，以及与血管重塑和血管壁力学变化相关的动脉被动特性。已有研究表明，内皮功能障碍是人类多种不良心血管事件（包括心血管相关死亡63）的强有力预后指标，而灌流阻力血管制备技术在检测内皮功能障碍、加深对其机制理解方面尤为宝贵。
为了说明其有效性 体外 采用离体阻力动脉的视频显微技术，我们展示了这些技术在Dahl盐敏感型（SS）大鼠以及新型同源染色体置换大鼠品系中的应用实例，后者相较于SS亲本品系表现出较低的血压盐敏感性24这些研究探讨了与两个染色体上基因相关的血管调控机制，这两个染色体在导致SS大鼠血压的盐敏感性及...

早期对动脉血管功能的研究主要利用传导动脉，许多情况下使用主动脉。大动脉中的力量生成通常通过将动脉环形片段连接到组织浴槽中的力传感器上来进行研究；对于主动脉，则通过切割血管成螺旋条状，使平滑肌纤维在其附着点与力传感器之间呈纵向排列，以最准确地估算平滑肌沿其长轴收缩所产生的力量。切割主动脉螺旋条的标准技术是将一根玻璃棒插入血管腔内，在血管壁上以所需角度做一切口，并在延伸切口以形成完整的螺旋条时握住暴露的血管壁边缘。随后，通常用吸水纸轻拭血管的内皮面以去除碎屑，再将血管条连接至力传感器，并将整个装置浸入充氧且温度可控的组织浴槽中。这种方法最终促成了生理学历史上最著名且最重要的发现之一——Furchgott 和 Zawadski1发现内皮源性舒张因子（EDRF，后被确认为一氧化氮）在调控血管功能中的关键作用。这一发现的关键事件是研究人员在实验中避免动脉内皮面接触外来表面，从而保持内皮完整，此时他们注意到主动脉条段并未如预期般对乙酰胆碱（ACh）产生收缩反应，反而出现了舒张。基于这一观察，研究人员开发出一种&#34;夹心&#34;制备方法，即将一段内皮完整的主动脉（本身无法产生收缩力）与标准的主动脉螺旋条连接，从而使原本由ACh引发的收缩反应转变为舒张反应。
目前广泛应用的该领域两项主要进展是：用于测量小阻力动脉（如肠系膜动脉3）主动收缩力的制备方法2,3 ，以及灌流阻力动脉的制备技术4,5,6。在最早期的报告之一中，Mulvany 和 Halpern3 描述了使用丝状肌动描记装置（wire myograph）来研究自发性高血压大鼠（SHR）和正常血压 WKY 对照大鼠肠系膜分离阻力动脉的主动收缩力。在丝状肌动描记系统发展之后，又开发了灌流阻力动脉制备方法，以使血管研究更接近于in vivo状态4,5,6。&#160; 尽管这两种方法均能提供有价值的结果，但灌流动脉制备具有额外优势，包括更有效地维持动脉内在的主动张力；并允许研究者考察血管对跨壁压力变化产生的主动肌源性反应，以及对血流速率变化和内皮剪切应力变化的反应（参见 Halpern 和 Kelley 的综述6）。
本文的主要目标是介绍如何采用经典的视频显微技术，利用分离并插管的阻力动脉，精确获取关于这些关键血管中调节主动张力机制的信息，且排除神经、体液或实质细胞影响的干扰。本文以标准大鼠模型为基础，并结合我们对新型基因工程大鼠品系的研究实例，向读者展示通过电视显微技术可获得的有关血管功能的各类深入认识。这些方法可广泛应用于研究者自主选择的任何对照组和实验组研究中，包括通过选择性近交繁殖和新近开发的基因工程技术所建立的强有力的新实验大鼠模型。
得益于电视显微技术的高精度，对灌流动脉标本的直径变化进行测量，可提供有关内皮依赖性和非内皮依赖性血管舒张机制的极具价值的信息，同时还能揭示高血压、高盐饮食及其他实验干预条件下血管调控机制的重要（有时是意料之外的）改变。此外，通过测定经钙离子螯合剂处理后达到最大程度舒张的离体灌流阻力动脉的压力-直径关系，2+无药物溶液或药理性血管扩张剂，可使研究者评估因血管重塑引起的动脉结构变化，并计算被动应力-应变关系7 可为动脉被动力学特性的变化提供重要见解，这些变化可能独立于（或叠加于）主动调节机制的变化而影响动脉功能。还需注意的是，对离体阻力动脉研究所得的信息，可与利用激光多普勒血流仪（LDF）获得的信息相互补充，后者是一种在整体动物水平评估组织灌注的实用方法8,9,10，并通过使用荧光标记的GS1凝集素评估微血管密度获得信息，该凝集素特异性结合小动脉和毛细血管基膜中的糖蛋白部分11,12后一种方法能够对微血管密度进行高度准确的估算，且不受传统计数法估算微血管密度时常见困难的影响。 体内例如，可识别因小动脉主动闭合导致血流停止的无灌注血管。联合使用这些方法，有助于将离体阻力动脉的功能性改变与微循环水平的组织灌注变化相关联；本文还将提供这些有价值的方法与套管动脉技术结合应用的一些实例。
本文重点介绍利用视频显微技术评估远交系Sprague-Dawley大鼠动脉中的血管变化。然而需要指出的是，这些技术在揭示通过选择性育种或基因编辑技术培育的高度特化转基因大鼠品系的表型改变方面也已被证明具有极高价值。在本论文中，我们举例说明了视频显微技术如何在多种重要的大鼠模型中提供有关血管功能的重要信息，包括Dahl盐敏感型（SS）大鼠——这是一种近交系大鼠品系，是研究盐敏感性高血压机制应用最广泛的实验模型18,19,20,21,22,23；以及通过将SS大鼠与盐不敏感的Brown Norway（BN）大鼠品系进行选择性育种所构建的同源染色体置换系（consomic）大鼠。在这些同源染色体置换系大鼠中，每条来自Brown Norway大鼠的染色体被逐一导入Dahl SS24,25,26遗传背景中。利用同源染色体置换系大鼠已为识别参与血压盐敏感性及其他表型（包括血管反应性）的特定染色体提供了宝贵线索24,25,26,27,28。
利用SS大鼠和携带单个BN染色体的同源染色体大鼠进行的选择性育种策略，也已成功培育出近交系 congenic 大鼠，其Dahl SS遗传背景中仅导入了单个Brown Norway大鼠的较小染色体片段22,29这些研究可为影响关键生理变量（如血压、肾脏损伤和血管反应性）的特定基因或染色体的特定区域提供极为宝贵的线索。22,29大鼠遗传学工具箱的另一项重要进展是利用先进的基因编辑技术（包括ZFNs、转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）以及最新的CRISPR-Cas9）开发出的大鼠基因敲除模型。13,14,15,16,17这些强大技术的出现使得大鼠基因敲除成为可能，这是一个极为重要的进展，因为迄今为止的基因敲除研究几乎全部依赖（并持续依赖）小鼠。本文的另一项实验部分展示了利用动脉插管技术和视频显微镜评估缺乏关键抗氧化及细胞保护性转录因子核因子（红系衍生2）样2（NRF2）的大鼠中生理调控机制的价值。30,31，这些品系是在Sprague-Dawley遗传背景下利用TALEN技术开发的17在这些实验中， 体外 采用视频显微技术对NRF2基因缺失的功能性效应进行验证，并评估一种基于直接上调NRF2介导的抗氧化防御机制的潜在有效治疗策略。鉴于维生素C和E等抗氧化剂在临床试验中效果不佳，NRF2在应对人类血管氧化应激方面具有重要的治疗意义。32.

<table><tbody><tr><td>SS 大鼠</td><td>威斯康星医学院</td><td>SS/JHsd/Mcwi 品系</td><td>联系 Aron Geurts 博士 (ageurts@mcw.edu)</td></tr><tr><td>SS.5&lt;sup&gt;BN&lt;/sup&gt; 同源染色体置换大鼠</td><td>威斯康星医学院</td><td>SS-Chr 5&lt;sup&gt;BN&lt;/sup&gt;/Mcwi 品系</td><td>联系 Aron Geurts 博士 (ageurts@mcw.edu)</td></tr><tr><td>SS.13&lt;sup&gt;BN&lt;/sup&gt; 同源染色体置换大鼠</td><td>威斯康星医学院</td><td>SS-Chr 13&lt;sup&gt;BN&lt;/sup&gt;/Mcwi 品系</td><td>联系 Aron Geurts 博士 (ageurts@mcw.edu)</td></tr><tr><td>Ren1-BN 近交系大鼠</td><td>威斯康星医学院</td><td>SS.BN-(D13hmgc41-D13)hmgc23/Mcwi 品系</td><td>联系 Aron Geurts 博士 (ageurts@mcw.edu)</td></tr><tr><td>Ren1-SSA 近交系大鼠</td><td>威斯康星医学院</td><td>SS.BN-(D13rat77-D13rat105/Mcwi 品系</td><td>联系 Aron Geurts 博士 (ageurts@mcw.edu)</td></tr><tr><td>Ren1-SSB 近交系大鼠</td><td>威斯康星医学院</td><td>SS.BN-(D13rat124-D13rat101/Mcwi 品系</td><td>联系 Aron Geurts 博士 (ageurts@mcw.edu)</td></tr><tr><td>Nrf2&lt;sup&gt;(-/-)&lt;/sup&gt; 基因敲除大鼠及其野生型同窝仔鼠</td><td>威斯康星医学院</td><td>SD-Nfe212&lt;sup&gt;em1Mcwi&lt;/sup&gt; 品系</td><td>联系 Aron Geurts 博士 (ageurts@mcw.edu)</td></tr><tr><td>低盐大鼠饲料 (0.4% NaCl)-AIN-76A</td><td>Dyets, Inc.</td><td>113755</td><td></td></tr><tr><td>高盐大鼠饲料 (4% NaCl)-AIN-76A</td><td>Dyets, Inc.</td><td>113756</td><td></td></tr><tr><td>科罗拉多视频测径仪</td><td>Colorado Video, Inc.</td><td>型号 308</td><td></td></tr><tr><td>视频摄像机</td><td>日立</td><td>KPM1AN</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>奥林巴斯生命科学</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>电视监视器</td><td>松下</td><td>WVBM1410</td><td></td></tr><tr><td>压力传感器</td><td>Stoelting</td><td>56360</td><td></td></tr><tr><td>血压显示单元</td><td>Stoelting</td><td>50115</td><td></td></tr><tr><td>插管动脉腔室</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>CH-1</td><td>通用单血管腔室</td></tr><tr><td>单腔室温度控制器</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>TC-09S</td><td></td></tr><tr><td>微型直型气体分散管</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>GD-MS</td><td>为血管浴提供通气</td></tr><tr><td>微型气体交换氧合器</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>OX</td><td>允许灌注液进行气体交换</td></tr><tr><td>激光多普勒血流仪</td><td>Perimed</td><td>PeriFlux 5000 LDPM</td><td></td></tr><tr><td>GS1 凝集素</td><td>Vector Labs</td><td>RL-1102</td><td></td></tr><tr><td>微移液管用玻璃毛细管</td><td>Fredrich Haer Co.</td><td>27-33-1</td><td>外径 2 mm，内径 1 mm</td></tr><tr><td>垂直移液管拉制仪</td><td>David Kopf Instruments</td><td>型号 700C</td><td></td></tr><tr><td>尼龙缝合线材料 (10/0)-3 股</td><td>Ashaway Line and Twine Manufacturing Co.</td><td>114-ANM-10</td><td>将 3 股尼龙缝合线拆分为单股用于血管操作</td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子-不锈钢</td><td>精细科学工具公司</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 剪刀</td><td>精细科学工具公司</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Protandim</td><td>Protandim</td><td></td><td>NRF2 诱导剂：联系 Joe McCord 博士 (JOE.MCCORD@UCDENVER.EDU)</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Fisher Chemical</td><td>S233-3</td><td></td></tr><tr><td>无水右旋糖（D-葡萄糖）</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁 (MgSO4-7H2O)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1880-500 G</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙 (CaCl2-2 H2O)</td><td>Sigma</td><td>C5080-500G</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠 (NaH2PO4)</td><td>Sigma</td><td>S0751-500G</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾 (KCl)</td><td>Fisher Chemical</td><td>P217-500G</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠盐二水合物 (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>ED255-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

利用大鼠离体阻力动脉视频显微技术评估血管调控机制

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

本方案描述了以下方法的使用 体外 利用电视显微镜评估离体脑阻力动脉（及其他血管）的血管功能，并介绍采用激光多普勒血流仪（LDF）评估组织灌注以及利用荧光标记评估微血管密度的技术 香单叶豆 (GS1)凝集素。目前研究在跨壁压条件下分离出的阻力血管的方法 体内 且在无实质细胞影响的情况下，提供了介于 体内 来自分子还原论方法的研究及其所获得的信息，对于理解整体动物水平上的整合性反应具有局限性。激光多普勒血流仪（LDF）以及利用荧光标记的GS1凝集素选择性识别微动脉和毛细血管的技术，为研究者提供了切实可行的解决方案，使其能够将从离体阻力血管研究中获得的知识进一步拓展。本文描述了这些技术的应用，以获取关于大鼠这一通用实验模型以及多种特异性基因工程模型中血管生理学与病理学的基本知识 &#34;设计者&#34; 能够为特定基因对重要血管表型的影响提供深入见解的大鼠品系。利用通过选择性育种策略培育的大鼠品系，以及新近建立的在大鼠中构建基因敲除模型的技术，将拓展在基因敲除小鼠模型中所获得科学结论的严谨性，并将相关知识延伸至更具生理相关性的动物模型。由于大鼠体型较大，其生理背景明确，更适合开展各类生理学研究。

体外 灌注式阻力血管的显微镜观察可用于研究在正常条件下影响小阻力血管（及较大微动脉）活性张力的因素 体内 跨壁压以及在无实质细胞影响条件下的血管反应性。除了评估血管在正常PSS中对各种血管舒张剂和收缩剂刺激以及跨壁压升高时的肌源性反应外，Ca2+在实验结束时，可将无钙PSS加入灌注液和 superfusate 中，以测定血管的最大直径和壁厚。后者对于评估血管重塑具有重要价值。 即，血管壁/管腔比率可能发生的变化，这些变化可能是对血压改变或药物干预的响应。在Ca2+-自由PSS可用于计算固有张力，公式为((D最大- D休息)/D最大) × 100，其中 D最大 和 D休息 最大（Ca2+-无钙PSS）和静息直径（PSS），分别在对照平衡压力下（通常为MCA的80 mmHg）测定。根据我们的经验，在跨壁压力为80 mmHg时，MCA的主动张力平均约为...

本文描述了 体外 用于评估大鼠脑小动脉血管功能的视频显微镜实验方案。本文还描述了利用荧光标记凝集素评估微血管密度以及采用激光多普勒血流仪检测组织灌注的技术。

本方案描述了使用体外电视显微镜技术评估离体脑阻力动脉（及其他...）血管功能的方法

本实验的总体目标是利用分离出的阻力血管来检测其对血管活性刺激的反应性。同时还将展示如何评估平滑肌调控机制及被动力学特性的变化。该方法有助于回答血管生物学领域中关于在不同条件下小阻力动脉内皮细胞和血管平滑肌调控机制的关键问题。该技术的主要优势在于，可将小阻力动脉从实质细胞环境中分离出来，并在正常压力下维持其状态，同时检测其对血管活性刺激的反应。该技术的应用意义延伸至血管功能障碍的治疗与诊断。此类操作在体内无法实现。尽管该方法可用于研究外周血管疾病，也可应用于冠状动脉疾病。由于操作精细且需避免损伤动脉，微套管步骤难以掌握，因此该方法的可视化演示至关重要。在实验当天，用一个两升的锥形瓶配制两升生理盐溶液。加入20倍浓缩缓冲液时，需确保溶液持续与气体混合物平衡，并用磁力搅拌子不断搅拌。接着，在向混合物中加入0.28克磷酸二氢钠时密切监测pH值。必要时，用巴斯德移液管滴加6 N盐酸或6.5 N氢氧化钠溶液，调节pH值，使其保持在7.4。然后向生理盐溶液中加入 1.98 克葡萄糖。接着，将 20X 储存液用去离子水稀释，配制 500 毫升无钙生理盐溶液。然后，将 25 毫升 20X 缓冲液原液加入锥形瓶中，并在监测和调节溶液 pH 值的同时，向溶液中加入 0.07 克磷酸二氢钠。使用四氟乙烯管将装有适当气体混合物的气瓶连接到器官浴槽。以足以确保流入血管腔的溶液持续但不剧烈冒泡的速率，对溶液进行连续通气。同时，在血管腔内放置一个连接至平衡气体混合物的小型砂芯通气头，以帮助维持生理盐溶液的气体成分。将生理盐溶液置于一个两升的马里奥特瓶中。在瓶塞中插入一根中央玻璃管，作为储液装置，持续向药理器官浴槽输送生理盐溶液，以供给血管腔室。将马里奥特瓶内中央玻璃管的开口端置于与器官浴槽中生理盐溶液液面相同的高度。这将确保向器官浴槽中输送生理盐溶液时保持恒定的静水压力。使用连接至J形玻璃管的聚乙烯管，将马里奥特瓶中的生理盐溶液导入器官浴槽。对于管腔灌流，使用聚乙烯管将进液移液管连接至由一支66 mL塑料注射器构成的生理盐溶液储液器，将储液器抬升至适当位置，以维持所需的进液压力。通过三通阀将压力传感器连接至系统，以监测压力。然后，将流出端移液管连接至一段聚乙烯管，再连接至一个类似于进流端储液器的储液装置，以便生理盐溶液在压力梯度作用下流经血管。同时，使用类似的三通阀和压力传感器连接方式来监测流出端压力。取出Sprague Dawley大鼠的脑组织，将其置于盛有冰冻生理盐溶液的玻璃培养皿中，保持仰卧位。随后将培养皿置于体视显微镜下。使用Vannas剪刀和Dumont 5号精细镊子从脑组织中分离出大脑中动脉。然后，使用镊子清除大脑中动脉上残留的脑组织。轻轻夹住切除段的一端，将动脉转移至血管腔室，并小心地将其放入腔室内。接下来，将大脑中动脉穿至流入端微移液管上，朝微移液管底部方向拉动，直至管尖进入动脉管腔内。用从10-0缝合线中分离出的单股纤维预先制备成环，将该环结扎在流入端移液管的动脉上以固定动脉。然后，用第二个缝合线环在远端结扎大脑中动脉的另一端，并使用连接在流入端移液管支架上的千分尺将动脉拉伸至其体内自然长度。使用从10-0缝合线中分离出的单股纤维逐一结扎所有侧支，以维持动脉内压力恒定。接下来，搭建一个视频显微镜系统，该系统由连接在解剖显微镜上的视频摄像机、视频测微计和电视监视器组成。使用该装置测量动脉的内径。在实验前，确保动脉具有适当水平的主动张力，以评估其肌源性张力及对血管舒张刺激的反应。除小肠系膜动脉等通常不表现出主动静息张力的血管外，其余在静息状态下缺乏主动张力的动脉均应弃用。接下来，向血管腔内逐步增加乙酰胆碱的浓度，并测量血管直径，以评估灌流阻力动脉的内皮依赖性反应性。在此示例中，该动脉表现为内皮功能障碍，其特征是对乙酰胆碱刺激无舒张反应。实验结束时，向灌流液和灌注液中加入无钙生理盐水，以测定动脉的最大直径。利用该测量值计算主动静息张力百分比。在无钙生理盐水中观察到动脉达到最大舒张，表明动脉对乙酰胆碱无舒张反应是由于内皮功能障碍，而非血管结构重塑导致的动脉舒张能力丧失。该图展示了雄性Dahl盐敏感大鼠的三个近交系中分离出的中脑动脉对内皮依赖性血管舒张剂乙酰胆碱的反应。结果显示，在盐敏感型亲本品系以及保留盐敏感型Renan等位基因的两个近交系中，乙酰胆碱诱导的内皮依赖性舒张反应缺失。而在盐敏感遗传背景下携带棕色挪威大鼠Renan等位基因的近交系中，血管舒张功能恢复正常，支持了以下假说：盐敏感型大鼠的内皮功能障碍源于Renan基因调控受损。在本实验中，高盐饮食未能消除某一特定大鼠品系中由乙酰胆碱引起的内皮依赖性舒张，该研究探讨了在膳食盐摄入量升高期间导致血管氧化应激和内皮功能障碍的因素。一旦掌握该技术，若操作得当，可在三至三小时半内完成。在进行该操作时，必须注意小心处理分离的动脉，以避免损伤平滑肌，尤其是内皮层。在完成该操作后，还可采用其他方法，例如添加血管收缩剂和血管舒张剂或受体拮抗剂，以探讨不同物质对血管反应性的影响机制以及药物对血管作用的机制。该技术建立后，为血管生物学和微循环生理学领域的研究人员提供了探索实验动物和人类不同血管床阻力动脉中平滑肌和内皮功能的途径。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用该方法评估来自不同血管床的小阻力动脉中的内皮和血管平滑肌调控机制。

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利用大鼠离体阻力动脉的视频显微镜对血管控制机制的评价

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利用压力肌动图评估肠系膜阻力动脉的肌源性反应和血管活性

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使用张力测定小体积腔室血管肌动描记法测量小鼠胸主动脉内皮依赖性血管舒张功能

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标准化大鼠冠状动脉环制备及血管直径动态张力变化的实时记录

双胎输血综合征和双胎贫血-红细胞增多序列征是围产期医学中两种可能具有毁灭性后果的疾病。这两种疾病均仅发生于单绒毛膜双胎，其病因是通过胎盘血管吻合支的血流不平衡所致。我们提供一种简单方案，通过出生后向胎盘血管注射彩色染料，以准确评估血管吻合支的存在情况。...

使用彩色染料对单绒毛膜胎盘中的血管吻合进行准确而简单的评估

学习利用大鼠离体阻力动脉的视频显微镜技术评估血管反应性，研究内皮细胞与平滑肌调控机制。该方法可在体外维持正常压力条件下测试血管活性刺激反应，为血管功能障碍的诊断与治疗提供重要依据。

利用大鼠离体阻力动脉视频显微技术评估血管调控机制

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