利用大鼠离体阻力动脉的视频显微镜对血管控制机制的评价
2017年12月5日
这篇手稿描述了体外大鼠脑阻力动脉血管功能的视频显微术。该手稿还描述了用激光多普勒血荧光标记凝集素和组织灌注评价微血管密度的技术。
该程序的总体目标是利用孤立的阻力动脉来测试血管对血管活性刺激的反应性。它还将展示如何评估平滑肌控制机制和被动机械性能的变化。该方法可以帮助回答血管生物学领域中关于各种情况下小阻力动脉中内皮和血管平滑肌控制机制的关键问题。
该技术的主要优点是可以从实质细胞环境中分离出小阻力动脉，并在测试对血管活性刺激的反应时保持正常压力。该技术的意义延伸到血管功能障碍的治疗和诊断。这种类型的作在体内是不可能的。
虽然这种方法可以提供对外周血管疾病的了解，但它也可以应用于冠状动脉疾病。这种方法的视觉演示至关重要，因为由于手术的精细性和需要避免损伤动脉，显微插管步骤很难学习。实验当天，在 2 升锥形瓶中制备 2 升生理盐溶液。
在添加 20X 缓冲液储备液时，确保溶液与气体混合物持续平衡，并用磁力搅拌棒搅拌。接下来，在向混合物中加入 0.28 克磷酸一钠时观察 pH 值。必要时，从巴斯德移液管中加入 6 滴正常盐酸或 6.5 正常氢氧化钠溶液来降低 pH 值，以使 pH 值保持在 7.4。
然后在生理盐溶液中加入 1.98 克葡萄糖。接下来，通过在去离子水中稀释 20X 储备液来制备 500 毫升无钙生理盐溶液。然后，在 Erlenmeyer 培养瓶中加入 25 mL 20X 缓冲液储备液，并向溶液中加入 0.07 g 磷酸一钠，同时监测和调节溶液的 pH 值。
使用四氟乙烯管将装有适当气体混合物的气罐连接到器官浴。以足够的速率连续鼓泡溶液，以确保流入容器腔的溶液持续但不会产生湍流。此外，在容器腔中放置一个连接到平衡气体混合物的小空气石，以帮助维持生理盐溶液的气体成分。
将生理盐溶液放入 2 升 Mariotte 瓶中。在塞子上添加一根中央玻璃管作为储液器，它将不断将生理盐溶液输送到向容器腔室供应溶液的药理器官浴中。将 Mariotte 瓶中中央玻璃管的开口与器官浴中生理盐溶液的顶部放在同一水平。
这将确保恒定的静水压力头，用于将生理盐溶液输送到器官浴中。使用连接到 J 形玻璃管的聚乙烯管将生理盐溶液从 Mariotte 瓶输送到器官浴中。对于管腔充流，使用聚乙烯管将流入移液器连接到生理盐溶液储液器，该储液器由 66-CC 塑料注射器组成，该注射器升高到保持所需流入压力的位置。
通过旋塞阀将压力传感器连接到系统，以监测压力。然后，将流出移液管连接到聚乙烯管上，聚乙烯管连接到类似于流入储液器的储液器，以使生理盐溶液响应压力梯度流过容器。此外，使用类似的旋塞阀和压力传感器连接来监测流出压力。
取出 Sprague Dawley 大鼠的大脑，将其仰卧位放入装满冰冷生理盐溶液的玻璃培养皿中。然后，将培养皿放在立体镜下。使用一把 Vannas 剪刀和一把 Dumont 5 号细尖镊子从大脑中切除大脑中动脉。
然后，使用镊子清洁大脑中动脉上残留的脑组织。轻轻握住切除段的末端，将动脉转移到血管腔中，然后小心地将其放入腔室中。接下来，将脑动脉拧到流入微量移液器上，将其拉向移液管底座，直到尖端进入动脉腔。
通过系上一个由先前从动脉周围 10-0 缝合线中挑逗的单股纤维制备的环，将动脉固定在流入移液管上。然后，通过拧紧血管周围的第二个缝合环，将大脑中动脉的另一端固定到流出移液管上，并使用连接到流入移液管支架的千分尺将动脉拉伸至原位长度。使用从 10-0 缝合线中挑逗的单股线系紧所有侧支，以保持动脉中的恒定压力。
接下来，设置一个视频显微镜，该摄像机连接到连接到视频千分尺和电视监视器的解剖显微镜。使用此设置测量动脉的内径。通过确保动脉在实验前表现出适当的活跃张力水平，评估生肌张力和血管对血管扩张剂刺激的反应。
丢弃任何在静息时缺乏主动张力的动脉，但通常不表现出主动静息张力的血管（例如小肠系膜动脉）除外。接下来，将浓度递增的乙酰胆碱添加到血管腔中并测量血管直径以测试插管阻力动脉的内皮依赖性反应性。在这个例子中，动脉表现出内皮功能障碍，如它在乙酰胆碱下无法扩张所证明的那样。
在实验结束时，通过向灌注液和超级灌注液中加入无钙生理盐溶液来确定动脉的最大直径。使用此测量来计算主动静息音百分比。在无钙生理盐溶液中最大扩张的证明证实了动脉对乙酰胆碱的反应无法扩张是由于内皮功能障碍，而不是由于血管的结构重塑导致动脉无法舒张。
该图说明了三种狭窄同源菌株中雄性 Dahl 盐敏感大鼠离体大脑中动脉对内皮依赖性血管扩张剂乙酰胆碱的反应。这表明，在盐敏感的亲本菌株和保留盐敏感的 Renan 等位基因的两种同源菌株中都不存在乙酰胆碱的内皮依赖性扩张。在盐敏感遗传背景中携带棕色 Norway Renan 等位基因的同源菌株中恢复正常扩张，支持了 SS 大鼠内皮功能障碍是由于 Renan 基因调节受损的假设。
在本实验中，高盐饮食未能消除一种特定大鼠体内皮依赖性乙酰胆碱的扩张，关于膳食盐摄入量升高期间血管氧化应激和内皮功能障碍的发现。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 3 到 3 1/2 小时内完成。在尝试此程序时，重要的是要记住非常小心地处理离体动脉，以免损伤平滑肌，尤其是内皮。
在此程序之后，可以执行其他方法，例如添加血管收缩剂和血管扩张剂激动剂或受体拮抗剂，以回答包括影响血管对不同物质反应的机制和药物对血管的作用机制在内的问题。该技术发展后，为血管生物学和微循环生理学领域的研究人员探索实验动物和人类不同血管床阻力动脉的平滑肌和内皮功能铺平了道路。看完这个视频，你应该对如何使用这种方法来评估来自不同血管床的小阻力动脉中的内皮和血管平滑肌控制机制有一个很好的了解。
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概述
本手稿介绍了用于评估大鼠脑部阻力动脉血管功能的体外视频显微镜协议。它还详细说明了评估微血管密度和组织灌注的技术。
关键研究组成部分
科学领域
- 血管生物学
- 微血管功能
- 内皮和平滑肌控制机制
背景
- 阻力动脉在调节血流中起着至关重要的作用。
- 理解血管对血管活性刺激的反应对血管研究至关重要。
- 分离的动脉可以提供对血管功能的洞察，而无需考虑体内并发症。
- 本研究旨在增进对血管功能障碍及其治疗意义的认识。
研究目的
- 评估分离阻力动脉的血管反应性。
- 评估平滑肌控制机制的变化。
- 研究小阻力动脉的被动机械性质。
使用的方法
- 体外视频显微镜协议。
- 用于评估微血管密度的荧光标记的植物凝集素。
- 用于评估组织灌注的激光多普勒流量测定。
- 分离阻力动脉以在测试过程中保持正常压力。
主要结果
- 展示了从其环境中分离阻力动脉的能力。
- 展示了如何有效地测试对血管活性刺激的反应。
- 提供了关于内皮和血管平滑肌相互作用的见解。
- 突出了诊断血管功能障碍的意义。
结论
- 该技术允许在受控环境中详细研究血管功能。
- 它可能会导致对血管疾病理解的进步。
- 研究结果可能为血管功能障碍的治疗方法提供信息。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables mechanistic de-risking of vascular targets by isolating resistance arteries from confounding parenchymal influences, providing predictive confidence in endothelial and smooth muscle control mechanisms. It supports target validation in preclinical models by maintaining physiological pressure and allowing direct assessment of vasoactive responses. The approach bridges molecular reductionist findings with integrative vascular physiology, enhancing translational relevance for cardiovascular drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by testing endothelial-dependent and independent vasodilator pathways in isolated resistance arteries.
- Operational Value: Enables functional target validation by assessing changes in smooth muscle control mechanisms and passive mechanical properties under controlled conditions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying vascular phenotypes linked to specific genetic backgrounds, such as Renan allele regulation in salt-sensitive hypertension models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing baseline vascular tone and reactivity profiles.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through pressure-controlled perfusion and video microscopy-based diameter measurements.
- Scalability: Highlights platform reuse across vascular beds and genetically engineered rat strains for consistent compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Discusses application to peripheral and coronary artery disease models through evaluation of endothelial dysfunction in genetically defined rat strains.
- Translational Continuity: Describes continuity from discovery through preclinical validation by using techniques applicable to both isolated vessels and in vivo perfusion assessments via Laser Doppler Flowmetry.
- Risk-Adjusted Advancement: Addresses mechanistic de-risking by distinguishing endothelial dysfunction from structural remodeling via calcium-free solution-induced maximal dilation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, supporting mechanistic insight before compound screening in vascular biology programs.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing of endothelial and vascular smooth muscle control mechanisms in small-resistance arteries under various conditions.
- Screening: Describes assay readiness through reproducible isolation and cannulation techniques that maintain arterial integrity for consistent vasoactive stimulus testing.
- Analytics: Highlights quantitative dependent variable measurements (internal diameter changes via video microscopy) that enable comparison of vasodilator and vasoconstrictor responses.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity through parallel use of Laser Doppler Flowmetry for tissue perfusion and fluorescent lectin labeling for microvessel density in related vascular studies.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability across vascular beds and rat strains, reducing redundant model development in cardiovascular research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in vascular control pathways.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of isolated artery preparations for consistent pharmacological profiling.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by confirming target engagement in physiologically relevant ex vivo models.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on confirmed endothelial function and smooth muscle responsiveness in disease-relevant genetic models.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in microvascular dissection, cannulation techniques, and video microscopy operation.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including pressure-regulated perfusion systems, video microscopes with micrometers, and pressure transducers.
- Cross-team standardization requirements for arterial isolation, suture ligation, and pressure maintenance protocols across laboratories.
- Adaptation considerations across model systems, including adjustment of perfusion pressures and solution compositions for different vascular beds and species.
- Practical limitations supported by source material: delicate microcannulation steps require significant training to avoid endothelial or smooth muscle damage, and arteries lacking active resting tone (e.g., small mesenteric arteries) may be excluded from tone-dependent analyses.
