定量和大小分析外囊泡的使用可调电阻脉冲检测
2014年10月19日
外囊泡发挥生理和病理过程，包括凝血，免疫应答和肿瘤或在药物递送或再生医学作为潜在治疗剂的重要作用。该协议提出了在采用可调电阻脉冲检测各种流体隔离和非隔离外囊泡的定量和大小的表征方法。
以下实验的总体目标是使用可调谐电阻脉冲传感定量和测定细胞外囊泡的尺寸。标准方法是比较从纯化的细胞外囊泡中提取的当前封闭测量值与从聚苯乙烯珠标准品中提取的封闭测量值。表征细胞外囊泡的第二种方法是用聚苯乙烯珠子加标样品，这在处理复杂样品（如未纯化的细胞外囊泡）时使用。
在细胞培养基中，所得数据表征细胞外囊泡的大小和数量，无论它们是纯化的还是未纯化的。与现有方法（如蛋白质印迹或流式细胞术）相比，该技术的主要优点是该方法直接在生物液体中表征颗粒，无需物理分离或标记。通常，刚接触该方法的个体会很挣扎，因为细胞外囊泡的大小是异质的。
当试图检测较小的囊泡时，较大的囊泡可能会堵塞纳米孔。我们在协议中添加了一些实用的提示和技巧，以快速恢复到可行的条件。我们试图减少细胞外囊泡的产生，并且需要一种方法来量化细胞培养中囊泡的浓度。Snet 的。
在寻找表征纳米颗粒的方法时，我们遇到了 TRPS 并修改了其方案，使其更适合表征 sles 和细胞培养。S 上清液和其他生物液体 首先将 TRPS 仪器连接到安装了 eyes on control suite 软件的计算机。请务必尽量减少文本协议中讨论的电气干扰。
现在，选择 Nanopore 大小。NP 100 是 70 至 200 纳米囊泡的最佳选择，而 NP 150 可用于 85 至 300 纳米大小的囊泡。NP 200 更适合测量 100 至 400 纳米的囊泡。
然后为 NP 100 和 NP 150 选择互补的聚苯乙烯校准颗粒，为 NP 200 选择 CPC 100 校准颗粒。使用 CPC 200 校准颗粒。涡旋校准颗粒 30 秒。
如果它们仍然聚集，则使用超声处理，然后将 PBS 中的校准颗粒稀释至目标浓度。根据纳米孔径，最终体积必须至少为 40 微升。现在通过应用 78 微升 PBS 并立即将其取出来润湿仪器的下部流体池。
这降低了在纳米孔下形成气泡的风险。接下来，将 Nanopore 放入仪器的 for 臂中。使用数字卡尺测量两个相对的臂之间的距离。
将此值输入到名为 stretch 的字段下的软件中，输入后，使用控制相对臂之间距离的侧轮单击校准拉伸。将纳米孔拉伸至 47 毫米。拉伸至一定大小后，将 78 微升 PBS 重新应用于下部液体池。
通过将上部流体池放在纳米孔上并连接屏蔽笼来开始校准过程。然后将 40 微升稀释的校准颗粒添加到上部流体池中。现在施加至少 0.8 kpak 的正压。
使用可变压力模块或 VPM，选择一个正电压，然后单击 turn on。然后在分析阻塞时慢慢减少拉伸。由校准粒子引起的事件。
随着拉伸的减小，封锁高度将逐渐增加，信噪比将因此提高。增加电压也会增加阻塞高度，但也会产生更多的 RMS 噪声。当观察到的阻塞适当地超过信号跟踪面板中记录的背景水平时，停止减少拉伸。
其次，观察颗粒速率。但是，这有一个不太严格的截止值。理想情况下，颗粒速率应至少为每分钟 100 个。
但是，如果颗粒速率大于每分钟 2000 个，请稀释样品并重新校准仪器。如此高的速率可能会导致此演示的测量不准确。表征了来自脑肿瘤细胞系的先前纯化的细胞外囊泡。
首先将校准粒子加载到上部流体单元压力机中。打开，然后使用 VPM 施加压力，并在此处记录至少 500 个数据颗粒。施加 0.8 千帕的压力。
或者，也可以进行多压力测量来执行此作，增加施加的压力并记录第二个校准文件。现在压力增量必须至少为 0.2 千帕，从上部池中取出样品，每次洗涤用 100 微升 PBS 洗涤池 3 次。洗涤后，用无绒纸擦去上部液体单元。
接下来添加实验示例。基线电流必须在测量校准颗粒时观察到的电流的 3% 以内。如果没有，请点击或扭动屏蔽帽，应用柱塞或完全去除纳米孔并用去离子水冲洗。
如果观察到的电流良好，则施加与施加到校准颗粒完全相同的压力。然后录制至少 500 个粒子并保存数据文件。如果颗粒检测突然中断、基线电流下降或 RMS 噪声突然增加，则暂停记录并尝试疏通纳米孔。
和以前一样，上下移液样品。轻敲或扭动屏蔽帽，应用柱塞或完全去除纳米孔并用去离子水冲洗。另一种策略是将纳米孔拉伸增加到 47 毫米，并最大限度地增加 VPM 的压力约 5 分钟。
因为这也可以 UNC 在软件中拔掉 NPO。转到 分析数据 选项卡，然后右键单击 unprocessed files 选项，然后选择 process files 选项。然后，要耦合样本和校准文件，请单击样本旁边的复选框。
在 calibrated （校准） 列中，选择相应的文件，然后选择 okay.选择。该软件将显示不同的样品特征，如大小、分布、基线持续时间、全宽、半高和浓度分析。
以下方法用于导致过度堵塞的样品，例如生物体液，使用标准方法进行制备，离心至少 50 微升的细胞培养物。含有细胞外囊泡的上清液，在 300 Gs 下放置 7 分钟，也以相同的方式为样品和对照制备单独的培养基对照。将 20 微升上清液转移到新试管中，并以每毫升 1000 万颗珠子的密度加入 20 微升 PBS 和 10 微升稀释的 335 纳米聚苯乙烯珠子原液。
现在像以前一样设置仪器，使用 NP 200 Nanopore 并测量培养基中珠子的对照样品。首先，为了准确性，必须将小非微珠颗粒的背景检测降至微珠检测的 10% 以下。现在，在记录重复之前测量每个样品一次。
这将使波动的纳米孔条件分布在样品上。每个样品应通过重新测量仅校准珠样品来完成 3 次测量。后。在数据分析过程中，使用电子表格软件进行浓度计算。
书面协议中包括一个示例计算。从 U 87 M-G-E-G-F-R-V 三种细胞培养物中纯化细胞外囊泡，通过超速离心上清液，然后使用所述方案使用 115 纳米校准珠进行测量。获得细胞外囊泡的大小分布。
还直接从胶质母细胞瘤细胞培养上清液中定量细胞外囊泡，使用用标准品加标样品的替代方法。观察到两个纳米颗粒群。较小的细胞外囊泡和较大的已知标准，基于已知标准对两个群体的大小估计，确定囊泡群体大于 140 纳米。
使用较小的纳米孔开口可能已经检测到较小的细胞外囊泡，但一旦掌握，就会有更多的堵塞。该技术可以在 1 到 4 小时内完成，具体取决于分析的样品数量。在执行此程序时，请务必记住，样品可能需要对方案进行间隔调整。
例如，由较大囊泡组成的样品可能需要在相对较大的拉伸下使用更大的纳米孔，并且还可以通过过滤我们的样品离心以去除细胞碎片来促进测量，这些细胞碎片可以给纳米孔计时。观看此视频后，您应该对如何使用 TRPS 表征细胞外囊泡有很好的了解。根据您的细胞外囊泡样品，您可以应用标准方案或使用调整后的加标方法。
概述
本协议详细说明了使用可调电阻脉冲感应（TRPS）来量化和表征细胞外囊泡（EV）大小的方法。该技术允许在生物流体中进行分析，无需分离或标记，使其比传统方法更具优势。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 生物技术
背景
- 细胞外囊泡参与各种生理和病理过程。
- 它们可以作为生物标志物或治疗剂。
- 当前的EV分析方法通常需要分离或标记，这可能会改变它们的特性。
- TRPS在复杂的生物样品中提供了一种直接测量的方法。
研究目的
- 量化和绘制不同生物流体中EV的大小分布。
- 提供一个尽量减少样品准备需求的协议。
- 提高研究中EV表征的准确性。
使用的方法
- 使用可调电阻脉冲感应（TRPS）进行直接测量。
- 将EV的电阻阻断测量与聚苯乙烯微珠标准进行比较。
- 使用特定纳米孔尺寸和聚苯乙烯微珠校准TRPS仪器。
- 收集和分析样品中粒子大小和浓度的数据。
主要结果
- 成功表征了细胞培养基中纯化和未纯化的EV。
- 确定了适用于不同EV大小范围的最佳纳米孔尺寸。
- 展示了该方法在未经事先分离的情况下测量EV的效率。
- 提供了针对测量过程中常见问题的故障排除提示。
结论
- TRPS是表征细胞外囊泡的有价值工具。
- 该方法增强了对生物环境中EV的理解。
- 未来的应用可能包括治疗开发和疾病监测。
常见问题
Executive Industry Relevance
Accurate quantification and size profiling of extracellular vesicles (EVs) in complex biological fluids is critical for target validation and biomarker discovery in oncology and immunology. Tunable resistive pulse sensing (tRPS) enables direct measurement without isolation or labeling, preserving native EV properties and reducing pre-analytical variability. This supports predictive confidence in early discovery by providing reproducible, quantitative data for go/no-go decisions in therapeutic development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying EV concentration and size distribution in disease-relevant systems.
- Operational Value: Supports biological de-risking through label-free, direct measurement in complex matrices like cell culture supernatant.
- Predictive Value: Provides quantitative outputs that aid in portfolio triage by correlating EV phenotypes with pathological states.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by delivering size and concentration analytics without purification steps.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through real-time calibration with polystyrene bead spikes in challenging samples.
- Scalability: Enables reliable compound evaluation by maintaining measurement integrity in high-throughput settings.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery to preclinical validation by enabling consistent EV characterization across sample types.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports decision-making by providing concentration and size data that inform mechanistic de-risking.
- Disease-Relevant System: Applicable to glioblastoma and other cancer models where EVs play roles in immune response and coagulation.
Pipeline & Workflow Integration
tRPS fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, offering quantitative particle analytics that support target confidence and assay readiness.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by sizing and counting EVs in biological fluids without isolation.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible size distribution and concentration measurements enabled by nanopore calibration.
- Analytics: Provides particle rate, blockade height, and size distribution outputs that allow comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling EV profiling in disease models such as U87-MG glioblastoma supernatant.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for EV analysis across projects, reducing reliance on isolation-dependent methods.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct, label-free EV quantification in native conditions.
- Operational Value: Standardization and scalability via tunable nanopore stretch and pressure controls for consistent measurements.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in EV-based biomarker studies.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through quantitative size and concentration data that inform therapeutic potential.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nanopore instrumentation and fluidic system setup to minimize electrical interference and bubble formation.
- Depends on access to qNano system with variable pressure module and appropriate nanopore sizes (NP 100, NP 150, NP 200) matched to EV size ranges.
- Necessitates cross-team standardization of calibration protocols, including polystyrene bead preparation and dilution in PBS.
- Involves adaptation considerations for sample types, such as using larger nanopores for larger vesicles or pre-filtration to reduce debris-induced clogging.
- Includes practical limitations like nanopore clogging by larger vesicles and the need for pressure and stretch adjustments based on sample complexity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:48
Preparations
3:54
Calibrating the Settings
5:20
Measuring the Calibration and Sample Particles
7:32
Data Analysis
8:15
Alternative Approach to Measuring Non-purified Extracellular Vesicles
9:58
Results: U87-MG/EGERvIII Extracellular Vesicle Characterization
11:03
Conclusion
