Name: 探索基于表面增强拉曼散射的生物感测技术在疾病诊断和治疗中的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: 探索表面增强拉曼散射结合机器学习用于单个小细胞外囊泡的无标记检测与分子分型。该方法可区分胃癌与健康对照，并定量分析药物负载，支持疾病早期诊断与治疗应用。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作获得了美国国立卫生研究院国家转化科学促进中心的资助，资助编号为 4UH3TR002978-03 和 1U18TR003778-01，以及加州再生医学研究所（CIRM）的资助（资助编号 TRAN1-14649）。

人体标本的采集严格遵循《赫尔辛基宣言》进行，并已获得加州大学洛杉矶分校机构审查委员会（IRB）的批准。所有供体在参与研究前均签署了书面知情同意书。
注意：本研究共使用了4种细胞系，分别为AGS（CRL-1739）、A549（CCL-185）、NCI-N87（CRL-5822）和Hs 738.St/Int（CRL-7869），均购自商业供应商。这些细胞系的培养和传代均严格按照供应商提供的说明和试剂进行。收集条件培养基后，于-20 °C保存，待后续处理。在韩国三星医疗中心，志愿者自愿捐献了组织、血浆和唾液样本。胃癌组织样本在手术切除过程中获取，而非癌症对照组的活检样本则通过内窥镜采集。via标准临床操作规程，使用EDTA管收集血浆。每位受试者采集约&#8239;5 mL未刺激的全唾液，随后在&#8239;4 °C条件下以2,600 × g离心15&#8239;min。为保护细胞外RNA，上清液中加入SUPERase-In RNase抑制剂至终浓度为20&#8239;U/mL。所有样本均在-80 °C保存，直至进一步处理。sEVs根据既定方案从条件培养基和临床样本中分离21。
1. sEV 的分离与表征
<ol>
	<li>制备sEV样品
	<ol>
		<li>将澄清的细胞培养上清液在室温下完全解冻。</li>
		<li>将上清液通过无菌的0.22 µm注射器滤器，以去除碎片和较大的污染物。</li>
		<li>用1× PBS溶液平衡35 nm尺寸排阻色谱（SEC）柱。</li>
		<li>加入500 µL过滤后的样品至层析柱中。</li>
		<li>根据制造商说明书，用1×PBS洗脱样品。</li>
		<li>收集富含EV的组分，并将其置于干净的小瓶中，在−20 °C下保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测定颗粒浓度与粒径
	<ol>
		<li>将sEVs样品用无菌DPBS稀释至最终颗粒浓度为107-109 颗粒/mL</li>
		<li>使用纳米颗粒跟踪分析仪，对每个样本记录5段60秒的视频。相机灵敏度设为14，恒定流速设为25。</li>
		<li>使用仪器配套软件分析视频，应用稀释因子以确定最终颗粒浓度（particles/mL）和平均直径（nm）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>表征四跨膜蛋白表达
	<ol>
		<li>预先扫描人源四跨膜蛋白芯片（1 cm × 1 cm，预包被抗CD9、抗CD63和抗CD81抗体），以建立基线信号。</li>
		<li>将稀释后的sEV样品加入芯片中，置于密封的24孔板内，室温孵育过夜。</li>
		<li>加入35 µL检测抗体（anti-CD9 CF488、anti-CD63 CF647、anti-CD81 CF555），室温孵育1小时。</li>
		<li>按照制造商的方案清洗芯片。</li>
		<li>使用生物标志物表征读取仪及其配套扫描软件检测囊泡四次跨膜蛋白的表达水平。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过透射电子显微镜确认sEV形态
	<ol>
		<li>用约100 µL的4%多聚甲醛固定约100 µL sEVs，孵育30分钟。</li>
		<li>将约100 µL固定后的sEVs加样至300目铜网上，孵育5分钟。</li>
		<li>用去离子水冲洗载网。</li>
		<li>用蒸馏水配制的1%醋酸铀酰溶液（约20 µL）对载网进行染色。</li>
		<li>用清水进行最后一次漂洗，并让载网自然完全晾干。</li>
		<li>成像样品 通过 透射电子显微镜（TEM）用于确认小细胞外囊泡（sEV）的大小和形态。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. SERS 等离子体基底的制备&#160;12,18,19
<ol>
	<li>制备纳米球单层膜
	<ol>
		<li>在朗缪尔-布洛杰特槽内的水面上铺展直径为500 nm的聚苯乙烯小球。</li>
		<li>轻轻按压微球，形成紧密排列的六方单层结构。</li>
		<li>将球形单层转移至一片4英寸Si晶圆（带有约50 nm热生长SiO₂层）上2通过将晶圆浸入槽中并缓慢向上提起。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蚀刻纳米球阵列
	<ol>
		<li>使用氧气等离子体（O₂）反应离子刻蚀系统将球体直径从500 nm减小至约250 nm2 气体流速为100 sccm，时间50 s，功率200 W。有关制备过程的更多细节，请参见我们此前发表的文献。12,18,19.</li>
		<li>在收缩的球阵列上沉积一层50 nm的Cr层 通过 电子束蒸发，速率为每秒1.5 Å。</li>
		<li>用丙酮去除聚苯乙烯小球，从而在SiO上留下带孔的Cr掩膜2 表面</li>
		<li>刻蚀暴露的SiO2 在Cr开口处使用25 sccm Ar和25 sccm CHF的混合气体进行沉积3，射频等离子体刻蚀功率为200 W，持续2分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备倒金字塔结构
	<ol>
		<li>将晶圆浸入60 wt% KOH溶液中，在60 °C下反应2分钟，以在硅表面蚀刻出倒金字塔形凹坑。</li>
		<li>使用铬刻蚀剂去除铬掩模，持续5分钟。</li>
		<li>去除 SiO2 在6:1缓冲氧化物刻蚀液中刻蚀至完全清除。</li>
		<li>采用电子束蒸发法在倒金字塔结构表面保形沉积一层200 nm的Au薄膜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>完成等离子体基底
	<ol>
		<li>将快干环氧树脂（约 1 mL）涂抹于另一片 SiO₂ 基底上2/Si 衬底。将镀金晶圆压在环氧树脂上，形成金层位于中间的三明治结构。</li>
		<li>将环氧树脂从硅胶模具上剥离，待环氧树脂完全固化后，形成自支撑的金等离激元基底。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 将石墨烯转移至等离激元基底
<ol>
	<li>制备石墨烯薄膜
	<ol>
		<li>配制 1 M FeCl₃ 溶液3 溶液（通过将81 g无水氯化铁溶解于水中，制备1 M的储备液）3 在去离子水中稀释至终体积500 mL，用于从PMMA包覆的单层石墨烯片上蚀刻铜基底。</li>
		<li>将石墨烯涂层铜片正面朝下放置在 FeCl 溶液表面3 溶液直至铜完全溶解。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>清洗石墨烯薄膜
	<ol>
		<li>使用洁净的玻璃载玻片，小心地将漂浮的石墨烯薄膜转移至去离子水浴中，以冲洗掉刻蚀剂残留物。</li>
		<li>重复此洗涤步骤三次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将石墨烯转移至基底
	<ol>
		<li>将SERS等离激元基底浸入最后一次去离子水浴中，使其位于石墨烯薄膜下方。</li>
		<li>轻轻抬起基底，使石墨烯均匀地贴附在其表面。</li>
		<li>室温下将石墨烯涂层基底风干1小时。</li>
		<li>转移至真空干燥箱中，在180 °C、减压条件下干燥1小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>清洁最终底物
	<ol>
		<li>将干燥的基底浸入50 °C的丙酮浴中1 h，以溶解PMMA。</li>
		<li>用异丙醇将底物冲洗三次。</li>
		<li>将清洁后并转移了石墨烯的等离激元基底在使用前置于干燥器中干燥。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. SERS 样品制备与光谱采集
<ol>
	<li>在基底上制备样品
	<ol>
		<li>用移液器将约 5 µL sEV 样品滴加到适当的等离子体基底上。 
		注意：对于载药 sEV 的定量，应将囊泡施加到金-石墨烯基底上。对于所有其他实验，请使用普通的金等离子体基底。</li>
		<li>将基底放入干燥器中，使液滴完全干燥（约 15 分钟）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>校准拉曼系统
	<ol>
		<li>将基底转移至共聚焦拉曼显微镜。</li>
		<li>使用仪器软件（WiRE 版本 4.4）启动数据采集。</li>
		<li>将激发激光设置为 785 nm，功率为 5 mW。</li>
		<li>通过将硅参考峰对准 520 cm-1 来校准系统。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从金基底获取光谱（诊断用途）
	<ol>
		<li>在 300 µm × 300 µm 区域内进行初扫，使用静态模式定位单个囊泡，设置如下：50% 功率，0.1 s 曝光时间，步长 10 µm。</li>
		<li>找到 sEV 后，在 5 × 5 网格内以静态模式进行高分辨率成像，设置如下：1 µm 步长，50% 功率，每点曝光 0.2 s。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从石墨烯基底获取光谱（治疗用途）
	<ol>
		<li>在 300 µm × 300 µm 区域内进行初扫，使用静态模式定位单个囊泡，设置如下：50% 激光功率，0.1 s 曝光时间，步长 10 µm。</li>
		<li>在扩展模式下，使用 2 × 2 网格进行高分辨率成像，设置如下：1 µm 步长，1% 激光功率，每点曝光 10 s。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 数据预处理
<ol>
	<li>进行光谱质量控制
	<ol>
		<li>筛查初始原始光谱，排除噪声过高或光谱形状异常的信号。</li>
		<li>使用基于阈值的检测方法或局部偏差滤波法去除孤立的宇宙射线尖峰。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>滤波并归一化光谱
	<ol>
		<li>对每条光谱应用Savitzky-Golay滤波器，以降低荧光背景并平滑数据。</li>
		<li>计算每条光谱的信噪比（SNR），通常采用峰-基线比或标准差方法。进一步说明：通常将每条光谱的信噪比计算为代表性拉曼峰（基线扣除后）的峰强度与噪声标准差的比值。噪声通过从原始光谱中减去经Savitzky-Golay平滑处理后的光谱（窗口大小 = 11，多项式阶数 = 3）得到的残差光谱来估计，从而分离出高频波动。为经验性确定合适的SNR阈值，将所有光谱按SNR升序排列，并评估特征性生化峰——特别是苯丙氨酸峰（~1002 cm-1，氨基酸）、酰胺I峰（~1650 cm-1，蛋白质）和CH2变形峰（~1440 cm-1，脂质）——在排序后光谱中的持续存在情况。阈值设定为这些诊断峰之一持续消失于基线噪声中的临界点。对于本研究使用的金纳米金字塔SERS基底及采集参数（785 nm激发，5 mW激光功率，0.2 s积分时间），该经验阈值对应于SNR为28。</li>
		<li>根据上述5.2.2节确定的SNR阈值，排除所有低于该阈值的光谱。在本工作流程中，SNR低于28的光谱将被排除在训练数据集之外，因为将阈值设在此水平可确保仅保留高质量光谱用于后续分析，并提高模型的鲁棒性。</li>
		<li>将每条光谱归一化至最大峰强度或曲线下的总面积。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 机器学习光谱分析
<ol>
	<li>训练模型
	<ol>
		<li>为每个光谱测量数据分配一个标签，以对应其来源（例如，胃癌患者 vs. 健康对照）。</li>
		<li>将光谱数据输入具有线性核的支持向量分类器（Support Vector Classifier, SVC）中。</li>
		<li>采用分层随机打乱划分方法进行5折交叉验证。</li>
		<li>对每折的准确率指标取平均值，以评估模型性能。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>降维与分类
	<ol>
		<li>使用线性判别分析（Linear Discriminant Analysis, LDA）将高维表面增强拉曼散射（SERS）数据在低维空间中可视化。</li>
		<li>利用LDA模型对样本组之间进行直接分类。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>评估模型
	<ol>
		<li>在一组独立保留的盲法患者样本上评估已训练的模型，以模拟真实世界中的诊断场景。更多详细信息，请参考我们课题组的以下文献13,15,22。 
		注意：所有步骤均需使用洁净工具并在无尘环境中进行。单层石墨烯在铜基底上生长或采购获得，并涂覆一层PMMA以在转移过程中提供保护。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Van Niel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+directions+in+studying+cell-cell+communication+by+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Challenges and directions in studying cell-cell communication by extracellular vesicles.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (5), 369-382 (2022).</li>
<li>Herrmann, I. K., Wood, M. J. A., Fuhrmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+a+next-generation+drug+delivery+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as a next-generation drug delivery platform.</a> Nat Nanotechnol. 16 (7), 748-759 (2021).</li>
<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+Exosomes%2C+microvesicles%2C+and+friends%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).</li>
<li>Möller, A., Lobb, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+translational+potential+of+small+extracellular+vesicles+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The evolving translational potential of small extracellular vesicles in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 20 (12), 697-709 (2020).</li>
<li>Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificities+of+secretion+and+uptake+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+cell-to-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication.</a> Nat Cell Biol. 21 (1), 9-17 (2019).</li>
<li>Alvarez-Erviti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+siRNA+to+the+mouse+brain+by+systemic+injection+of+targeted+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes.</a> Nat Biotechnol. 29 (4), 341-347 (2011).</li>
<li>Kahroba, H., Hejazi, M. S., Samadi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+From+carcinogenesis+and+metastasis+to+diagnosis+and+treatment+of+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Exosomes: From carcinogenesis and metastasis to diagnosis and treatment of gastric cancer.</a> Cell Mol Life Sci. 76 (9), 1747-1758 (2019).</li>
<li>Ferguson, S. W., Nguyen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+as+therapeutics%3A+The+implications+of+molecular+composition+and+exosomal+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Exosomes as therapeutics: The implications of molecular composition and exosomal heterogeneity.</a> J Control Release. 228, 179-190 (2016).</li>
<li>Stiles, P. L., Dieringer, J. A., Shah, N. C., Van Duyne, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-enhanced+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Surface-enhanced Raman spectroscopy.</a> Annu Rev Anal Chem. 1, 601-626 (2008).</li>
<li>Jeon, T. Y., Kim, D. J., Park, S. G., Kim, S. H., Kim, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanostructured+plasmonic+substrates+for+use+as+SERS+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Converg%22%5BJournal%5D)">Nanostructured plasmonic substrates for use as SERS sensors.</a> Nano Converg. 3, 1-10 (2016).</li>
<li>Nie, S., Emery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+single+molecules+and+single+nanoparticles+by+surface-enhanced+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Probing single molecules and single nanoparticles by surface-enhanced Raman scattering.</a> Science. 275 (5303), 1102-1106 (1997).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-sensitive+graphene-plasmonic+hybrid+platform+for+label-free+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Ultra-sensitive graphene-plasmonic hybrid platform for label-free detection.</a> Adv Mater. 25 (35), 4918-4924 (2013).</li>
<li>Liu, Z. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanopyramid+arrays+for+non-invasive+surface-enhanced+Raman+spectroscopy-based+gastric+cancer+detection+via+sEVs%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Nano+Mater%22%5BJournal%5D)">Gold nanopyramid arrays for non-invasive surface-enhanced Raman spectroscopy-based gastric cancer detection via sEVs.</a> ACS Appl Nano Mater. 5 (9), 12506-12517 (2022).</li>
<li>Jonak, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+bronchoalveolar+fluid+derived+small+extracellular+vesicles+using+single-vesicle+SERS+for+non-small+cell+lung+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Sens+Diagn%22%5BJournal%5D)">Analyzing bronchoalveolar fluid derived small extracellular vesicles using single-vesicle SERS for non-small cell lung cancer detection.</a> Sens Diagn. 2 (1), 90-99 (2023).</li>
<li>Liu, Z. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+single-vesicle+based+surface+enhanced+Raman+spectroscopy%3A+A+robust+approach+for+investigating+the+biomolecular+composition+of+small+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Label-free single-vesicle based surface enhanced Raman spectroscopy: A robust approach for investigating the biomolecular composition of small extracellular vesicles.</a> PLoS One. 19 (6), e0304287(2024).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+feasibility+of+SERS-based+monitoring+of+drug+loading+efficiency+in+exosomes+for+targeted+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">On the feasibility of SERS-based monitoring of drug loading efficiency in exosomes for targeted delivery.</a> Biosensors (Basel). 15 (3), 198(2025).</li>
<li>Ling, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+graphene+be+used+as+a+substrate+for+Raman+enhancement%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Can graphene be used as a substrate for Raman enhancement.</a> Nano Lett. 10 (2), 553-561 (2010).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+optical+response+from+graphene-plasmonic+system%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Giant optical response from graphene-plasmonic system.</a> ACS Nano. 6 (7), 6244-6249 (2012).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+SERS+selective+detection+of+dopamine+and+serotonin+using+graphene-Au+nanopyramid+heterostructure%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Label-free SERS selective detection of dopamine and serotonin using graphene-Au nanopyramid heterostructure.</a> Anal Chem. 87 (20), 10255-10261 (2015).</li>
<li>Qiu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+advances+in+technologies+for+single+extracellular+vesicle+analysis+and+its+clinical+applications+in+cancer+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Current advances in technologies for single extracellular vesicle analysis and its clinical applications in cancer diagnosis.</a> Biosensors (Basel). 13 (1), 60(2023).</li>
<li>Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+human+adipocyte-derived+extracellular+vesicles+using+filtration+and+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation.</a> J Vis Exp. (170), e64102(2021).</li>
<li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+SARS-CoV-2+detection+platform+based+on+surface-enhanced+Raman+spectroscopy+with+support+vector+machine+spectral+pattern+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Eng+Sci%22%5BJournal%5D)">Label-free SARS-CoV-2 detection platform based on surface-enhanced Raman spectroscopy with support vector machine spectral pattern recognition.</a> Eng Sci. 23, 862-870 (2023).</li>
</ol>

作者声明，他们与本工作无任何利益冲突。

该方案的一个关键环节是基底制备和小细胞外囊泡（sEV）的纯化。无标记表面增强拉曼散射（SERS）的性能在很大程度上依赖于制备均匀、高共形且具有强增强效应的等离激元基底。 &#34;热点&#34;同样，高纯度sEV的分离 通过 尺寸排阻色谱对于获得可靠且可重复的表面增强拉曼光谱（SERS）至关重要。蛋白质聚集体或脂蛋白等杂质不仅会削弱囊泡信号，还可能因引入光谱噪声而干扰后续基于机器学习的分类分析。
我们平台的一个显著优势是其经过验证的单囊泡分辨率，这对于克服小细胞外囊泡（sEV）异质性带来的挑战至关重要。尽管激光光斑大于单个囊泡，但由于金纳米金字塔结构带来的超线性信号放大效应，信号主要来自最接近等离激元热点的sEV。结合基底上较低的囊泡密度，可确保每个光谱代表单个sEV的分子快照。这一能力使得能够识别出在整体分析方法（如蛋白质印迹或质谱）中通常被掩盖的不同sEV亚群。
该方案的临床价值体现在其在同一患者队列的多种生物流体（包括组织、血浆和唾液）中的成功应用。我们的研究结果表明，尽管组织来源的sEVs提供了最高的...

小型细胞外囊泡（sEVs），通常大小在30至200之间&#8239;直径为 nm 的细胞外囊泡天然分泌至生物体液中，携带源自其母细胞的蛋白质、脂质和核酸1,2,3作为存在于唾液、尿液及其他体液中的非侵入性生物标志物4它们在疾病早期诊断、预后评估及治疗监测方面具有广阔前景，尤其在肿瘤学领域。5,6,7然而，由于它们在复杂的生物基质中具有高度异质性和低丰度，其临床转化受到阻碍8为克服此类挑战，本方案采用表面增强拉曼光谱法（SERS），这是一种强大的分析技术，可将拉曼散射信号增强高达1010-1011 次 通过 等离激元基底9,10,11SERS 捕获内在分子 &#34;指纹&#34; 在数秒内获取单个sEV的光谱，实现超灵敏的单囊泡分析，同时避免长时间的检测过程。
我们的方法协同结合了基于无标记的表面增强拉曼散射（SERS）技术，以实现对单个小型细胞外囊泡（sEVs）快速且超灵敏的表征12,13,14,15,16。无标记SERS可捕获内在的生化特征，当与线性判别分析（LDA）、支持向量分类（SVC）等机器学习模型结合时，已被证明能够高特异性地区分来源于健康细胞与病变细胞的sEVs13。为进一步提高本平台的可重复性与定量能力，该方法完全兼容石墨烯覆盖的拉曼基底16。单层石墨烯提供化学均一的表面，可稳定等离激元热点并增强分子吸附17,18，更重要的是，单层石墨烯可作为SERS信号的&#34;内置&#34;标尺12,19，从而实现对检测分子的定量分析。尽管拉曼激光束直径（~&#8239;1 µm）大于典型的sEV，但由于物理机制与统计机制的独特协同作用，本平台仍可实现有效的单囊泡分辨率。准周期性金纳米金字塔基底产生尺寸小于100&#8239;nm的高度局域化等离激元&#34;热点&#34;，以超线性方式放大拉曼信号12。因此，在激光束范围内最接近最强热点的sEV所产生的信号在光谱中占主导地位。此外，扫描电镜（SEM）成像证实sEVs分布稀疏（&#62; 1 µm间隔），最大限度减少了光谱重叠，而拉曼强度图谱显示信号定位与单个囊泡的尺寸相符13,14。这些特性共同确保了每条采集的光谱主要对应单个sEV，从而实现具有统计稳健性的无标记单囊泡分析。与传统方法（如需要大量样本且无法分辨单个囊泡的蛋白质印迹、质谱或常规拉曼散射）相比20，我们的单囊泡SERS平台在灵敏度、通量和分子分辨率方面具有显著优势。该工作流程适用于致力于开发微创、高分辨率诊断工具，或在个体化治疗研究中探索sEV异质性及药物负载效率的研究人员。在本方案中，我们展示了该SERS平台如何利用单个sEV实现疾病检测和治疗应用，特别是在癌症研究中的应用，包括囊泡分离、等离激元基底制备、拉曼信号采集以及基于机器学习的数据分析在内的完整工作流程。

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J61196.AP</td><td></td></tr><tr><td>300目铜网</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>EMS200-Cu</td><td></td></tr><tr><td>4% 甲醛溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1004960700</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;Prime; 硅片&amp;nbsp;</td><td>MSE Supplies</td><td>&lt;strong&gt;WA0810&lt;/strong&gt;</td><td>(100) 取向&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>A549 细胞系</td><td>ATCC</td><td>&lt;strong&gt;CCL-185&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>AGS 细胞系</td><td>ATCC</td><td>CRL-1739</td><td></td></tr><tr><td>离心机转子 F-35-6-30, 5430</td><td>Eppendorf</td><td>&lt;strong&gt;22654306&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>CHA Mark 40</td><td>CHA Mark 40</td><td>https://chaindustries.com/mark-40-system/</td><td>电子束蒸发</td></tr><tr><td>铬蚀刻液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>651826-500ML</td><td></td></tr><tr><td>阿霉素&amp;nbsp;D-4000</td><td>LC Laboratories</td><td>D-4000_3g</td><td></td></tr><tr><td>ExoView R100 系统及 ExoView 人源四跨膜蛋白检测试剂盒</td><td>NanoView Biosciences</td><td>https://www.nowmedicalstudios.&lt;br/&gt; com/portfolio/nanoview-&lt;br/&gt; biosciences-3d-product-illustrations</td><td></td></tr><tr><td>FeCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>451649</td><td></td></tr><tr><td>HF 溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695068-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Hs 738.St/Int 细胞系</td><td>ATCC</td><td>CRL-7869</td><td></td></tr><tr><td>inVia 共聚焦拉曼显微镜</td><td>Renishaw</td><td>https://www.renishaw.com/en/&lt;br/&gt; invia-confocal-raman-microscope&lt;br/&gt; --6260?srsltid=AfmBOoqbZlyW&lt;br/&gt; qv2KDdcXV0UZnp8tdLNgYZ0&lt;br/&gt; GbZvGOWI6z1OKi48rg5-b</td><td></td></tr><tr><td>KOH 溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>417661</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 4000 台式恒温/制冷摇床</td><td>Thermo Scientific</td><td>SHKA4000 (4320)</td><td></td></tr><tr><td>MCO-19AIC 培养箱</td><td>SANYO</td><td>8380-30-0035</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP 滤器</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLGPM33RS</td><td>&amp;nbsp;0.22 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>NanoSEM 230 显微镜</td><td>FEI</td><td>SEM-FEI-014&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nanosight NS300</td><td>Malvern Panalytical</td><td>https://www.malvernpanalytical&lt;br/&gt; .com/en/support/product-support&lt;br/&gt; /nanosight-range/nanosight-ns300</td><td></td></tr><tr><td>NCI-N87 细胞系</td><td>ATCC</td><td>CRL-5822</td><td></td></tr><tr><td>Optima TLX 超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>8043-30-1197</td><td></td></tr><tr><td>Oxford Plasmalab 80 Plus</td><td>Oxford Plasmalab</td><td>https://plasma.oxinst.com/&lt;br/&gt; products/rie/plasmapro-800-rie</td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯微球</td><td>Alfa Aesar</td><td>&lt;strong&gt;AA42711AB&lt;/strong&gt;</td><td>500 nm</td></tr><tr><td>qEVoriginal/35 nm</td><td>Izon</td><td>ICO-35</td><td></td></tr><tr><td>单层石墨烯</td><td>MSE Supplies</td><td>&lt;strong&gt;ME0408&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>T-75 培养瓶</td><td>VWR</td><td>156800</td><td></td></tr><tr><td>TF20 高分辨率电镜</td><td>FEI</td><td>https://eicn.cnsi.ucla.edu/project/fei-tf20-tem/</td><td></td></tr><tr><td>醋酸铀酰溶液</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22400-1</td><td></td></tr></tbody></table>

探索基于表面增强拉曼散射的单个sev生物传感在疾病诊断与治疗中的应用

Exploring the Application of Surface-enhanced Raman Scattering-based Biosensing of Individual sEVs in Disease Diagnosis and Therapeutics

本方案介绍了一种全面的无标记检测平台，通过将表面增强拉曼光谱（SERS）与机器学习（ML）相结合，实现对单个小细胞外囊泡（sEVs）的检测及其分子特征分析，用于诊断和治疗应用。该方法首先采用尺寸排阻色谱法或超速离心法分离sEVs。分离得到的囊泡随后在工程化的等离子体金纳米金字塔二维阵列基底上进行分析，该基底具有单囊泡检测灵敏度。通过利用内源性拉曼生化指纹图谱，本方案可在无需外源标记的情况下实现高特异性检测。在获取拉曼光谱后，数据经过预处理，并采用训练好的机器学习算法（如LDA、SVC）进行分析，以分类疾病状态，成功利用来自组织、血浆和唾液的sEVs将胃癌患者与健康对照组区分开来，分类准确率分别为90.1%、70.9%和60.7%。此外，通过量化单个sEV中阿霉素的载药量，展示了该方法在治疗领域的应用潜力，其中采用石墨烯包覆基底作为内标，提高了测量的准确性。该方法可实现高通量分析，能够捕捉群体异质性，对于早期疾病检测以及在单囊泡水平上理解药物装载效率至关重要。

成功实施单囊泡SERS方案可获得来自单个sEV的独特拉曼光谱，从而实现下游的诊断分类及治疗性药物载荷监测。图1分别展示了利用本研究中所述方案进行胃癌诊断研究以及载药sEV监测应用的工作流程。
<img alt="sEV isolation process, SERS measurement, and model training diagram for gastric cancer detection." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69258/69258fig1.jpg" data-altupdatedat="1780372819000" data-alt="Figure 1"> 
图1研究流程图 (A胃癌单囊泡SERS诊断工作流程。临床囊泡经分离后沉积于...

本文介绍了一种利用无标记表面增强拉曼光谱法（SERS）分析单个小细胞外囊泡（sEVs）的实验方案，该方法可实现疾病无创诊断，并评估sEVs作为治疗递送载体的应用潜力。

探索基于表面增强拉曼散射的单个sEV生物传感在疾病诊断与治疗中的应用

本方案概述了一个全面的无标记平台，该平台将表面增强拉曼光谱（SERS）与机器学习（ML）相结合，以……

我们采用表面增强拉曼散射结合机器学习技术，以应对癌症早期诊断的挑战，并推动生物医学应用的发展。一个关键的实验难点在于外泌体样本固有的异质性，以及高度复杂、高维度的光谱数据，而低信噪比进一步加剧了这一问题。首先，用移液器吸取约五微升的小细胞外囊泡样本，滴加到指定的等离子体基底上。将基底放入干燥器中，使液滴完全干燥，约需15分钟。然后将干燥的基底转移至共聚焦拉曼显微镜。使用仪器配套软件WiRE 4.4版本，开始数据采集。将激发激光器设置为785纳米，功率为五毫瓦，并对系统进行校准。为从金基底获取光谱，在300乘以300微米的区域内进行探查扫描，使用静态模式，步长为10微米，曝光时间为0.1秒，激光功率为50%，以定位单个囊泡。找到囊泡后，在5乘以5的网格区域内进行高分辨率映射，采用静态模式，步长为1微米，每点曝光时间为0.2秒，激光功率为50%。接下来，通过执行以下扫描步骤从石墨烯基底获取光谱。筛选初始的原始光谱，排除任何显示过度噪声或异常光谱形状的光谱。对每条光谱应用Savitsky-Golay滤波器，以降低荧光背景并平滑光谱数据。使用峰-基线法或标准偏差法计算每个光谱的信噪比。对于每个光谱，将信噪比计算为在代表性拉曼谱带处基线扣除后的峰强度与噪声标准偏差的比值。通过从原始光谱中减去Savitsky-Golay平滑后的光谱来估计噪声，平滑时采用11点窗口宽度和三次多项式阶数。将所有光谱按信噪比升序排列，并评估诊断峰在排序后光谱中的持续性，以确定阈值。然后将阈值设定在任一这些峰消失于基线噪声的位置，该位置对应的信噪比为28。排除信噪比低于28阈值的光谱，以确保仅保留高质量光谱用于后续分析。将每个剩余的光谱归一化为其最大峰强度或曲线下的总面积。根据光谱数据的来源为其分配标签，例如胃癌患者或健康对照。将带有标签的光谱数据输入具有线性核的支持向量分类器，并应用分层随机划分进行五折交叉验证，以确保每一折中各类别样本的均衡代表。现在，对所有折的准确率指标进行平均，以评估模型的整体性能。最后，使用线性判别分析（LDA）降低表面增强拉曼散射数据集的维度，以便进行可视化。利用训练好的线性判别分析模型，在样本组之间进行直接分类。来自组织、血液和唾液样本中分离的单个小细胞外囊泡的拉曼光谱及其相应的平均光谱，显示出每种样本类型的独特分子特征。线性判别分析显示，根据来源不同，细胞外囊泡数据在组织、血液或唾液之间呈现出明显的聚类。使用支持向量机分类器进行二分类时，组织样本的准确率最高，达到90.1%，其次是血液样本为70.9%，唾液样本为60.7%。基于LDA的分类方法在组织来源的细胞外囊泡数据中清晰地区分了健康样本与胃癌样本。基于LDA的血液和唾液来源细胞外囊泡数据分类结果显示，健康样本与癌症样本之间的分离效果较差。未添加石墨烯的阿霉素孵育囊泡的拉曼光谱在约1,081、1,206和1,440 cm⁻¹处显示出稳定的特征峰。加入石墨烯后，在约1,350 cm⁻¹处出现额外的D峰，并在约1,580 cm⁻¹处观察到G峰，可作为内部标准。阿霉素在442 cm⁻¹处的峰与石墨烯G峰的比值随着药物浓度的升高和孵育时间的延长而增加。我们建立了一种单囊泡生化指纹图谱技术，可用于区分疾病来源，具有早期诊断的潜力。本技术具有三个关键优势。第一，它具有高灵敏度；第二，它具有非侵入性；第三，它不需要裂解或物理破坏颗粒。未来，我们将把光谱特征与蛋白质组学特征相关联，进而有助于将外显子内容与特定功能（如细胞通讯和物质运输）相关联。

exploring-application-surface-enhanced-raman-scattering-based

Research

科研

JoVE Journal

Engineering

工程

探索基于表面增强拉曼散射的生物感测技术在疾病诊断和治疗中的应用

本视频介绍了利用靶向纳米探针（特异性抗受体抗体）和非靶向对照纳米探针，通过表面增强共振拉曼散射技术检测转移性卵巢癌的方法。该方法有助于确定两种纳米探针的相对丰度，并将癌细胞与内脏背景信号区分开来。...

基于抗体功能化SERRS纳米探针成像：一种高灵敏度拉曼成像技术用于体内检测转移性卵巢癌

我们描述了纳米生物系统的制备与表征，该系统将纳米结构基底与固定化的蛋白质和适配体进行界面结合。文中报道了涉及纳米结构基底的光刻制备、生物功能化以及表面增强拉曼光谱（SERS）表征等相关实验步骤。展示了对表面固定化蛋白质的SERS检测，以及对蛋白质-配体和适配体-配体结合相互作用的探测。...

利用电子束光刻制备的纳米结构基底通过表面增强拉曼光谱检测生物分子

一种基于滤膜的表面增强拉曼光谱（SERS）检测化学污染物的制备与检测方法即，...

基于滤膜的表面增强拉曼光谱法快速检测化学污染物

基于纳米颗粒的光学探针已被设计为用于通过拉曼光谱和紫外-可见光谱检测抗原的载体。本文描述了一种制备此类探针用于紫外-可见/拉曼光谱免疫分析的方案，该方案可整合未来的多重检测能力。...

构建紫外-可见光与拉曼光谱免疫分析平台

本研究描述了一种纳米压印光刻技术，用于制备基于异常光学透射原理的高质量传感阵列。该生物传感器成本低、稳定性好、操作简便，可在临床相关浓度下检测血清中的心肌肌钙蛋白I（99th 百分位数截断值 ∼10–400...

利用超常光学透射技术定量检测人血清中的心脏生物标志物

卵巢癌会在整个腹膜腔内形成转移灶。本文介绍了一种制备和使用叶酸受体靶向的表面增强共振拉曼散射纳米探针的方案，该探针可通过比率成像以高特异性揭示这些病灶。via...

基于叶酸受体靶向的表面增强共振拉曼散射纳米探针比率法检测微小卵巢癌

本方案介绍了一种集成拉曼光谱-质谱（MS）平台，可实现单细胞分辨率。拉曼光谱可用于研究细胞对药物的响应，而质谱则可用于药物摄取与代谢的靶向定量分析。...

一种集成拉曼光谱与质谱技术的平台用于研究单细胞药物摄取、代谢及效应

本文提出了一种新一代的多参数分析平台，可提高细胞外囊泡亚群表征的通量。该方法结合了多重生物传感技术与原子力显微镜的计量学和形貌力学分析，并耦合拉曼光谱，用于对捕获在微阵列生物芯片上的囊泡靶标进行定性分析。...

基于多重表面等离子体共振成像芯片的多模态分析平台用于细胞外囊泡亚群分析

本研究开发了一种低成本、生物相容性良好的基于表面增强拉曼散射（SERS）的指纹纳米探针，可用于无标记活细胞生物成像并检测两种细菌菌株，详细展示了如何以非破坏性方法获取活细胞的SERS光谱。...

基于金@碳点纳米探针的无标记表面增强拉曼散射生物分析

利用结合无标记光学成像模式的多模态平台，我们开发了一种用于可视化和定量分析细胞动态与代谢的方案。通过多光子荧光、二次谐波生成和受激拉曼散射显微成像，我们能够获得细胞和分子环境的整体概览。...

用于研究细胞代谢的多模态光学成像平台

探索表面增强拉曼散射结合机器学习用于单个小细胞外囊泡的无标记检测与分子分型。该方法可区分胃癌与健康对照，并定量分析药物负载，支持疾病早期诊断与治疗应用。

探索基于表面增强拉曼散射的单个sEV生物传感在疾病诊断与治疗中的应用

探索更多视频