行为经验后脑组织样本转录动态的综合分析

以下实验的总体目标是研究小鼠在行为经历后转录动态及特定脑核的变化。首先使动物适应环境，并在注射生理盐水后记录其运动活动。待动物适应后，给予单次可卡因处理并记录其运动活动，随后采集伏隔核组织样本，用于RNA提取和cDNA制备。

接下来进行qPCR分析，以研究行为诱导的基因表达。最终获得的结果将展示可卡因体验后的转录动态。本实验方案将由实验室主管Hatu博士、实验室研究生Dum Muer以及实验室本科生Duran共同演示。在连续三天内，每只小鼠均需适应抓取和注射操作，并在实验开始前将小鼠分组安置于笼中，确保后续不再在不同笼子之间转移小鼠，且小鼠不得长时间单独隔离饲养。

测试开始前30分钟，应将所有测试笼具转移至行为学实验房间，以使动物适应环境。注射后立即给予250微升生理盐水腹腔注射，随后将小鼠放入行为学检测箱中，监测其15分钟内的运动活动。小鼠也可在行为学检测箱中放置20分钟。

监测第2至第17分钟的活动。在接下来的两天中，每天同一时间重复这些步骤。第四天，根据分组对小鼠注射一次可卡因或生理盐水，并立即将小鼠放入实验箱中，在可卡因暴露后的选定时间点监测局部运动活动20分钟，随后取出脑组织并将其置于冰冷的脑脊液（CSF）溶液中1至2分钟，以冷却并硬化组织。

去除小脑并吸去多余液体后，将脑组织腹侧朝上粘附于振动切片机的载物台上。向切片室中加入冰冻的人工脑脊液（aCSF），切出200微米厚的脑片，直至清晰看到伏隔核。在切片过程中，需密切注意胼胝体的形态、前连合的位置与形状以及脑室的结构。

确定正确区域后，切取两片400微米厚的脑片，随后在体视显微镜下分离出伏隔核。使用精细刀片将伏隔核从脑片中仔细切下。在正确区域快速划动刀片四次，即可立即分离出目标组织。

将分离的组织放入 900 微升裂解试剂中，于 -80 摄氏度保存直至进行 RNA 提取；开始提取时，先在 37 摄氏度下融化离心管，然后进行匀浆。使用 25 号针头时，最初几次操作可能较为困难，需将组织推压离心管管壁以将其匀浆成小片段。为确保充分匀浆，将裂解液转移至 Kaya Shredder Mini 离心柱中，离心处理。

将裂解液移入新的微量离心管中，并根据试剂盒说明书提取 RNA。RNA 纯化后，进行逆转录生成 cDNA，以及使用针对所选分析基因组的特异性引物对样本进行靶向预扩增。这些步骤在该方案的文字版本中有详细描述。

用于全面QPCR分析的商用微流控芯片有48乘48格式，可实现48个样本与48种探针组的分析，也有96乘96格式，可用于96个样本与96种探针的分析。在大多数情况下，芯片的选择主要取决于待分析样本的数量。

首先，根据实验所选芯片制备样品混合液。吸取20 XDNA结合染料样品上样试剂时需小心谨慎。将样品混合液充分振荡至少20秒，并离心至少30秒。

制备好的反应液可在芯片准备上样前短暂保存于4°C。接下来，配制检测混合液，充分混匀样本混合液，并离心以使所有组分沉降至管底。如前所示，动态阵列IFC芯片设有样本和检测试剂的进样口，以及用于对微流控腔室加压的控制液专用进样口。

首先，向芯片上的每个蓄液池注入对照液。接着，将芯片放入IFC控制器中，并运行相应的程序，以对芯片进行预处理。程序运行结束后，从IFC控制器中取出已完成预处理的芯片，用移液器向每个检测孔加入五微升（5 µL）的检测试剂。

将混合物加入芯片中。使用IFC控制器软件，将每个样本混合物各5 µL加入其对应的入口，然后将芯片放回IFC控制器。运行程序脚本，将样本和检测试剂加载至芯片中。

当加载混合脚本完成后，从IFC控制器中取出已加载的芯片。接着，将芯片放入热循环仪中，并创建一个新的芯片运行程序，包含熔解曲线分析。使用热循环仪软件确保反应室被正确识别，并让反应运行至完成。

单次急性可卡因注射后，运动活动明显增加。在此冠状切面中，粗白线标记了用于界定伏隔核边界的切割位置。在解剖过程中，针对 CFOs 和 phos B 的引物扩增曲线表明，这些引物对可将其靶标转录本扩增的效率约为 100%。

在每个周期中，实验结果表明，可卡因暴露后 1 小时和 2 小时，伏隔核中 CFOs 和磷酸化 B 蛋白的表达水平达到最高。在此基础上，可进一步采用其他方法（如新一代测序）来鉴定 novel uncharacterized transcript。