转录动力学的脑组织样本在行为经验综合分析

以下实验的总体目标是研究小鼠的转录动力学和根据行为体验定义的脑核。这是通过首先使动物适应并在注射盐水后记录它们的运动活动来实现的。一旦习惯了，在单剂量可卡因后记录运动活动，然后收集伏隔核的样本并用于 RNA 分离和 CDNA 制备。

接下来进行 QPCR 分析以研究行为诱导的基因表达。最终，获得的结果显示可卡因体验后的转录动力学 演示该协议的将是实验室经理 Hatu 博士、实验室研究生 Dum Muer 和实验室本科生 Duran 连续三天。每只小鼠都习惯了处理程序和注射程序，在开始实验之前将小鼠组织到笼子中，这样将来小鼠就不会在笼子之间转移，并且小鼠永远不会长时间隔离。

测试开始前 30 分钟，应将所有测试笼转移到行为室，让动物适应环境。注射后立即腹膜内注射 250 微升生理盐水，将鼠标置于行为室中以监测运动活动 15 分钟。鼠标可以放在行为室中 20 分钟。

从 2 分钟到 17 分钟监控的活动。在接下来的两天里，在当天的同一时间重复这些步骤。第四天，根据组别，单次注射可卡因或生理盐水，并立即将小鼠放入腔室中，在可卡因暴露后的选定时间点监测局部运动活动 20 分钟，提取大脑并将其置于冰冷的 CSF 溶液中 1 至 2 分钟以冷却和硬化。

去除小脑并吸走多余的液体后，将大脑粘在 vibram 的舞台上，喙部朝上。用冰冷的 A CSF 填充腔室，切成 200 微米的切片，直到清楚地识别伏隔核。切割时密切注意胼胝体的形状、前连合和脑室的位置和形状。

一旦确定了正确的区域，就切成两块 400 微米的切片，在立体镜下从中解剖伏隔核。用细刀片从切片上切开伏隔核。刀片在正确区域快速划过四次，应立即隔离适当的组织。

将分离的组织放入 900 微升裂解试剂中，并在零下 80 摄氏度下储存，直到 RNA 提取开始，在 37 摄氏度下解冻试管并匀浆。使用 25 号针头，前几轮可能很困难，需要将组织推向管壁以将其匀浆成小块。为确保适当的均质化，将裂解物移液到 kaya 粉碎机迷你离心柱上并离心。

将裂解物移液到新的微量离心管中，并根据制造商的说明提取 RNA。RNA 纯化后，进行 CDNA 的逆转录以及样品的靶标特异性前扩增，引物针对选择进行分析的基因组。这些过程在协议的文本版本中进行了描述。

用于全面 QPCR 分析的商用微流控芯片有 48 x 48 可供选择。规格，能够使用 48 个探针组分析 48 个样品，或采用 96 x 96 规格，其中使用 96 个探针分析 96 个样品。在大多数情况下，芯片的选择主要取决于分析的样品数量。

首先，根据为实验选择的芯片制备样品混合物。移液 20 XDNA 结合染料样品上样试剂时要小心。搅拌样品混合物溶液至少 20 秒，并离心至少 30 秒。

制备的反应可以在 4 摄氏度下短期储存，直到芯片准备好加载。接下来，制备检测混合物，彻底搅拌样品混合物并离心以离心所有组分。如前所述，动态阵列 IFC 芯片具有用于样品和分析的入口，以及用于对微流体室加压的控制管路流体的指定入口。

首先，将控制管路流体注入芯片上的每个蓄能器中。接下来，通过将芯片放入 IFC 控制器并运行相应的脚本来灌注芯片。脚本完成后，从 IFC 控制器中取出引物芯片，并在每次测定中移取 5 微升。

混入芯片上。将 5 微升每种样品混合物添加到其入口中，并使用 IFC 控制器软件将芯片返回给 IFC 控制器。运行脚本以将样品和检测加载到芯片中。

加载混合脚本完成后，从 IFC 控制器中删除加载的芯片。接下来，将芯片加载到热循环仪上，并创建一个包含熔解曲线分析的新芯片运行。使用 Thermal Cycler 软件可确保正确识别反应室，并允许反应运行直至完成。

单次急性可卡因注射后运动活动明显增加。在这个冠状切片中，白色粗线标记了为定义伏隔核边界而进行的切割位置。在解剖过程中，针对 CFO 和 phos B 的引物的扩增曲线表明，引物对以大约 100% 的效率扩增其靶转录物。

在每个周期中，结果表明，可卡因诱导的伏隔核中 CFOs 和 phos B 的表达在暴露后 1 小时和 2 小时最高。按照此程序，可以执行其他方法，如下一代测序，以识别新的未表征转录本。