Name: 转录动力学的脑组织样本在行为经验综合分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 学习使用微流控qPCR阵列分析小鼠伏隔核在可卡因暴露后的转录动力学变化。该方案通过RNA分离和基因表达分析，帮助研究人员理解行为经验对大脑基因表达的影响，为成瘾研究提供分子机制见解。

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本工作得到了以色列科学基金会资助（ISF #393/12）、以色列研究中心卓越计划资助（I-CORE 1796/12）、德以基金会资助（GIF #2299-2291.1/2011）以及玛丽·居里职业融合资助（FP7-PEOPLE-2013-CIG #618201）的支持。该项目的初期工作由AXA博士后奖学金资助给AC。我们感谢埃德蒙与莉莉·萨夫拉脑科学中心提供的慷慨启动资金。
我们非常感谢 Citri 实验室成员的审阅意见。

注意：本方案遵循耶路撒冷希伯来大学的动物护理指南。
1. ACSF 溶液的制备
<ol>
	<li>按照表1所述配制人工脑脊液（ACSF）溶液。用ddH2O（&#62;18 MΩ纯度）配制1 L，并通过适量添加水或NaCl将渗透压调节至约300 mOsm/L。</li>
</ol>
2. 仪器设备与房间设置
用于监测可卡因诱导的运动行为的设备包括行为记录箱（50 × 45 cm），箱内配备光源、风扇和摄像头（或红外传感器），并内置一个透明亚克力箱（30 × 30 cm），小鼠可在其中自由活动，其运动行为将被实时记录。行为学测试应在光照周期开始后1小时至关灯前1小时之间进行，光照条件保持标准的明暗循环。动物应每天在同一时间接受一致的训练。
<ol>
	<li>将相机或红外系统连接至合适的系统，用于监测和记录小鼠的运动行为。</li>
	<li>每次实验后，使用动物房提供的消毒剂和/或除味试剂清洁实验舱，以防止嗅觉线索干扰并确保充分消毒。</li>
</ol>
重要提示：操作小鼠时应保持安静、镇定且小心谨慎。
3. 动物准备
<ol>
	<li>每笼饲养5只C57BL/6雄性小鼠（6-12周龄，体重约25-35 g），饲养环境为12小时光照/12小时黑暗循环，自由获取食物和饮水，符合当地动物护理委员会的指导原则和实验规程。实验开始前，称量小鼠体重并记录数据，后续可卡因的给药剂量将根据小鼠体重确定。</li>
	<li>在开始第一次试验前30分钟，将所有装有小鼠的笼子转移至行为学实验室内。</li>
	<li>在实验开始前，使所有实验小鼠适应实验人员的操作、注射以及行为学装置中的监测。具体方法如下：连续3天，每天进行一次腹腔注射250 μl生理盐水。</li>
	<li>腹腔注射 250 μl 生理盐水。注射后立即放入小鼠至行为观察箱中，监测 15 分钟的运动活动。连续 3 天每天同一时间重复该操作。</li>
	<li>第四天，将小鼠分为两组。用生理盐水配制浓度为 2 mg/ml 的可卡因储备液。根据小鼠体重，向实验组单次注射可卡因溶液（终剂量 20 mg/kg）（例如 对于25 g的小鼠注射250 μl，30 g的小鼠则注射300 μl。对照组给予生理盐水。注射后立即放入行为检测箱中，持续20 min以监测其运动活动（通常监测前15 min）。</li>
	<li>在注射可卡因后，于不同时间点（注射后 0、1、2、4、8 和 24 小时）处死小鼠。需要注意的是，对照组小鼠（0 小时时间点）在当天不应接受任何注射。由于该组具有重要意义，必须包含对照组的重复样本。</li>
</ol>
4. 伏隔核的解剖分离
<ol>
	<li>在注射可卡因/生理盐水后的适当时间，使用异氟烷对小鼠进行麻醉。异氟烷必须直接排出室外，因此该操作应在化学通风橱中进行。</li>
	<li>通过检测后肢足部反射来监测麻醉深度。轻捏足掌以诱发动物的回缩反应。若动物出现反射，则表明其尚未达到外科手术所需的麻醉水平，不可实施安乐死。</li>
	<li>脑组织的取出：
	<ol>
		<li>通过断头法对小鼠实施安乐死。</li>
		<li>移除颅骨顶部中央的皮肤，并用锋利的剪刀剪开颅骨。</li>
		<li>从脊髓进入脑部的位置（枕骨大孔）插入剪刀，进行两次侧向剪切。</li>
		<li>从同一位置沿矢状缝做一条长的矢状切口。到达嗅球时，分别向左和向右剪断。</li>
		<li>用镊子小心移除颅骨，牢固夹住颅骨的每一半并侧向拉出，注意不要压迫或损伤脑组织。</li>
		<li>使用倒置的微型勺形刮匙切断颅神经，从而取出脑组织。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将脑组织置于冰冻的人工脑脊液（ACSF）溶液中 1–2 分钟，使其冷却并硬化。</li>
	<li>从 ACSF 中取出脑组织，用纸巾吸去多余液体，在小脑与其余脑组织之间做一冠状切面，并将脑组织腹侧朝下粘附于振动切片机的载物台上。</li>
	<li>切割伏隔核（NAc）：
	<ol>
		<li>在振动切片机的切片室中保持 ACSF 溶液处于冰冻温度。以 200 μm 厚度进行切片，直至根据 Paxinos 和 Franklin 小鼠脑图谱明确识别出伏隔核（NAc）（约位于前囟前 1.8 mm 处；注意胼胝体的形状、前连合的位置与形态、脑室以及脑切片的整体形态）。此时，连续制备两个厚度为 400 μm 的切片，用于后续分离 NAc。</li>
		<li>在体视显微镜下，使用精细刀片从切片中分离出 NAc 区域。NAc 的界定依据 Paxinos 和 Franklin 小鼠脑图谱，可通过在组织上快速四次划刀便捷地完成分离。（图 2）。</li>
		<li>立即将 NAc 切片放入含有 900 μl Trizol 裂解试剂的微量离心管中，并于 -80 °C 保存，直至进行 RNA 提取。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. RNA 提取与 cDNA 逆转录
<ol>
	<li>在室温下解冻含有伏隔核切片的 Trizol 裂解试剂管，用连接25 G针头的1 ml注射器匀浆裂解液，直至组织完全匀浆（至少15-20次）。最初几次操作较为困难，需将组织在管壁上推压，以将其破碎成可进入针头的小碎片。</li>
	<li>为确保充分匀浆，将裂解液转移至QIAshredder微型离心柱中，以12,000 × g离心1分钟。</li>
	<li>将裂解液转移至新的微量离心管中，按照制造商说明书提取RNA。提取后的RNA储存于-80 °C，待用。</li>
	<li>测定RNA浓度，使用Bioanalyzer或等效设备分析其完整性与质量。每轮cDNA合成使用100-500 ng RNA，并以随机六聚体引物进行。</li>
</ol>
6. 引物设计与引物验证
<ol>
	<li>选择合适的引物：为获得用于mRNA转录本qPCR的最优引物对，请遵循以下要求（图3):
	<ol>
		<li>设计引物时，长度不超过17-28个碱基。避免核苷酸重复序列，因其可促进错配引物结合。</li>
		<li>设计引物时，其熔解温度（Tm) 在56-68°C之间（最佳为60-64°C）。Tm 引物对之间的退火温度差异应控制在1 °C以内。</li>
		<li>请注意，产物大小最好在80至150 bp之间。</li>
		<li>确保至少一个引物跨越外显子-外显子连接区，或扩增子包含一个较大的内含子（跨内含子），以避免基因组DNA污染的扩增。</li>
		<li>使用基于 Primer3 的可靠软件（例如参见 表 2以优化引物设计。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>引物验证：为确保引物的特异性和扩增效率，应进行对照qPCR反应：
	<ol>
		<li>使用阳性样本（包含所有相关引物对的cDNA模板）并进行cDNA梯度稀释（例如 八个三倍稀释样本（起始浓度约为 10 ng），每个样本设两个平行重复反应。设置无模板对照，以检测反应所用溶液中的污染情况。</li>
		<li>使用以下公式计算引物效率：(10(−1/斜率-1) × 100，使得最佳斜率曲线为 −3.333（即 10(− 1/3.333) = 2) (图4).</li>
		<li>确定扩增的特异性。特异性扩增表现为所有扩增产物熔解曲线中均出现单一显著的主峰，而非特异性扩增则表现为明显偏离该单一主峰的额外峰。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. qPCR 分析
<ol>
	<li>预扩增：
	<ol>
		<li>全面的qPCR分析依赖于使用大量引物对对有限数量的RNA进行平行检测。因此，预扩增步骤至关重要。在此步骤中，cDNA将使用未来用于样本检测的所有引物混合物（最多可达800对引物）进行14-18个循环的预扩增。</li>
		<li>使用低EDTA的TE缓冲液将所有引物稀释至50 μM，用于特异性目标扩增（STA）。</li>
		<li>将所有拟用于STA反应的50 μM引物体系各取1 μl等分试样混合，最多可混合800个检测。</li>
		<li>按照所述方法制备STA所需的预混液和样品 表3准备足够用于所需扩增样本数量110%的混合液，以预留误差余量。 </li>
		<li>每个样本分装 3.75 μl STA 预混液，再向每个样本加入 1.25 μl cDNA。</li>
		<li>涡旋混匀反应液，离心10秒。</li>
		<li>将STA反应置于热循环仪中，并按照指定条件进行循环 表4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>外切酶 I（ExoI）处理：
	<ol>
		<li>按指示稀释 Exo I 表5.</li>
		<li>向每个5 μl的STA反应中加入2 μl稀释的ExoI（4 U/μl），涡旋混匀，离心沉降（&#62;6,000 × g) 离心，然后置于37℃恒温循环仪中 30 分钟后于 80 °C 下反应 15 分钟。</li>
		<li>将最终产物稀释至适合检测的适当浓度。使用TE缓冲液（向7 μl TSA样品中加入43 μl TE缓冲液）。</li>
		<li>将稀释后的STA产品在-20 °C保存或立即使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>qPCR 引物和样本设置：
	<ol>
		<li>按照所示准备样品 表6根据实验所选芯片的类型配制混合液，并相应加入样品。</li>
		<li>将样本混合液充分振荡至少20秒，并离心（&#62;6,000 × g 离心至少 30 秒。制备好的反应液可在 4 °C 短期保存，直至芯片准备上样。</li>
		<li>按照所述方法准备实验 表7.</li>
		<li>振荡反应混合物至少20秒，并离心（&#62;6,000 × g) 离心至少 30 秒，使所有组分沉降至管底。 
		重要提示：在将所有样本和检测溶液移液至芯片入口前，必须充分涡旋混匀并离心。若未执行此步骤，可能导致数据质量下降。 
		注意：每种引物在进样口中的终浓度为 5 μM，在最终反应体系中的浓度为 500 nM。</li>
	</ol></li>
	<li>启动并加载动态阵列IFC（集成流体电路）芯片。IFC芯片设有用于样品和检测试剂的入口，以及用于控制管线流体（矿物油）的指定入口（蓄压器），后者用于对微流控反应室加压图 4A).
	<ol>
		<li>向芯片上的每个蓄液池注入对照线液体。</li>
		<li>移除并丢弃芯片底部的蓝色保护膜。</li>
		<li>将芯片放入相应的IFC控制器中（48.48动态阵列IFC使用控制器MX，96.96动态阵列IFC使用IFC控制器HX），然后运行48.48动态阵列IFC的Prime (113x)程序或96.96动态阵列IFC的Prime (136x)程序，以对芯片进行预处理。</li>
		<li>脚本运行结束后，从 IFC 控制器上取下已启动的芯片。</li>
		<li>将5 μl的每种检测混合液和5 μl的每种样品混合液分别加入其对应的入口。</li>
		<li>将芯片放回IFC控制器中。</li>
		<li>使用 IFC 控制器软件，针对 48.48 动态阵列 IFC 运行 Load Mix (113x) 脚本，或针对 96.96 动态阵列 IFC 运行 Load Mix (136x) 脚本，以将样本和检测物加载至芯片中。Load Mix 脚本运行完成后，从 IFC 控制器中取出已加载的芯片。</li>
		<li>将芯片装载到热循环仪上，根据制造商指南创建新的芯片运行程序，包括熔解曲线分析。使用热循环仪软件确保反应室被正确识别，并运行反应至完成。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 数据分析
<ol>
	<li>质量控制：为确保数据质量，需通过分析引物的稀释曲线（如上所述）来验证引物的质量。通过观察扩增产物的熔解曲线来监测扩增的特异性，其峰形应尽可能紧密对齐29。</li>
	<li>数据可视化：对于高通量qPCR获得的大量数据，可使用软件生成热图进行可视化，其中表达水平按强度以颜色编码。此外，可将单个基因的转录动态以折线散点图形式展示。</li>
	<li>发表规范：在发表基因表达结果时，建议遵循MIQE指南，该指南规定了定量实时PCR实验发表所需的最低信息标准，以确保实验的相关性、准确性、正确解读及可重复性。</li>
</ol>

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<li>Citri, A., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+qPCR+profiling+of+gene+expression+in+single+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Comprehensive qPCR profiling of gene expression in single neuronal cells.</a> Nature protocols. 7, 118-127 (2012).</li>
</ol>

我们无任何利益冲突需要披露。

在行为学实验范式后，对脑组织基因表达进行成功表征的关键因素包括：1）在行为学实验过程中对小鼠的谨慎操作；2）快速而精确地分离目标组织；3）采取RNA安全措施以确保RNA的完整性；以及4）精心设计引物和实验方案，并在qPCR分析的准备过程中保持精确性和对细节的关注。
本实验方案的目的是表征由行为经历所诱导的转录事件的动态变化；因此，必须仔细控制实验条件，以确保小鼠所经历的行为范式确实反映了研究者所预期的体验。例如，即使是在可卡因行为敏化这样相对简单的范式中，小鼠的实际体验仍可能受到多种混杂因素的影响：实验前小鼠在饲养笼内的既往经历；转移至实验房间的方式；实验房间内的光照、声音和气味刺激；实验人员抓取和操作小鼠的过程；腹腔注射带来的疼痛或不适；对新环境的暴露；以及从特定行为发生后直至实施安乐死前的整个经历。上述每一种经历单独都可能在小鼠大脑的不同区域诱导转录程序的激活。因此，必须谨慎设计实验，以确保所检测到的转录程序反映的是目标行为范式本身，而非与之伴随的表观现象。在研究可卡因体验时，通过严谨的实验设计、细致的操作以及一个简单的对照实验即可实现这一目标——该对照实验中除给予小鼠的是溶剂...

大脑的动态组织结构赋予了认知和行为的灵活性。经验通过改变大脑神经元之间连接的结构和强度而被编码3。这种“依赖经验的可塑性”源于特定基因表达模式的诱导，从而提供用于调节突触结构和功能强度所需的蛋白质4。识别介导长期记忆形成的基因调控网络是分子神经科学的核心命题之一，人们期望通过鉴定转录程序中的主导因子，深入理解调控记忆形成的基本原理，并为神经退行性疾病和神经精神障碍的治疗提供潜在靶点。转录程序以明确的时间顺序分阶段展开，每一阶段激活具有不同特征的基因，这些基因对于信号事件后续效应实施过程中的不同阶段至关重要1,2。因此，有必要在精细的时间尺度上研究转录动态，以全面鉴定被诱导的基因集合，并根据其诱导动力学特征深入理解其潜在功能。
药物成瘾是一种由滥用药物对大脑神经环路产生持久影响所导致的强烈经验依赖性可塑性现象5,6。药物的初次急性暴露可能引发成瘾的发生，并促使向慢性使用转变。情境信息在成瘾的发展过程中起着关键作用。药物相关的环境线索在药物滥用者脑海中具有重要意义。能够唤起药物滥用者过去用药经历的情境信息，即使在长期戒断后，也可能诱发对药物的渴求和复吸7,8。因此，成瘾治疗面临巨大的临床挑战——成瘾者在戒断症状消失很久之后仍极易复发9。
对可卡因的行为敏化是研究药物成瘾机制的一种简单且有用的可卡因经验模型。在这一广泛研究的模型中，长期接触滥用药物会诱导持久的敏化效应：首先让啮齿类动物在新环境中适应生理盐水注射（腹腔注射；IP）（在监测其运动活性的敞箱装置中）；随后，在敞箱装置中每天给予可卡因注射，同时持续监测其活动情况10（图1）。这种行为范式通常会导致运动行为显著敏化（比基线活动水平高8-12倍）11，且在停止可卡因注射后，该敏化效应可持续数月之久，表明药物经验已形成广泛而持久的记忆痕迹。
奖赏相关的神经环路通常参与强化对物种生存至关重要的行为（例如摄食、性行为），而滥用药物则利用这一环路来强化与药物相关的行为12,13。滥用药物所致体验增强的分子与细胞机制，似乎与其他脑区中陈述性或语义性记忆形成的机制相似14。因此，行为敏感化模型的稳健性使其成为研究经验依赖性可塑性机制的理想模型系统。
伏隔核（NAc）是大脑奖赏环路的核心整合中枢，与成瘾的形成密切相关5,6。成瘾的形成依赖于伏隔核内新蛋白质的转录，且在可卡因暴露后，伏隔核中可观察到结构明确的转录程序被显著诱导15-19。 对可卡因暴露的急性转录反应可能在多个层面发挥作用，以适应强烈的诱导刺激，并指导新蛋白质的合成，这些蛋白质负责介导药物暴露所引发的结构和电生理变化6,19-22。
为了促进对大脑中依赖经验的可塑性分子机制的研究，本文描述了一种在行为干预后对脑组织样本中的转录动态进行系统分析的实验方案。该方案以Citri实验室所研究的行为经验——可卡因行为敏化——为范例，并利用微流控动态阵列进行转录分析。所描述的方案显然不仅限于在行为敏化的背景下研究伏隔核，还可广泛应用于多种行为范式和不同的脑区。事实上，该方案也可用于脑外的其他组织，以及多种不同的生物体经历或实验干预条件。
该实验方案大致分为四个步骤。第一步，对动物实施行为学范式；第二步，对组织进行显微解剖；第三步，纯化mRNA并进行逆转录和探针检测；最后一步，分析数据。
在研究转录动态的过程中，经验发生的时间点及其具体定义可能是需要控制的最重要的实验参数。因此，我们选择的行为学模型是可卡因行为敏化，该系统能够使实验者对经验参数进行高度精确的操控。此外，也存在其他可实现精确时间控制的行为范式，可用于研究不同类型的依赖经验的可塑性或记忆形成模型，这些模型包括恐惧条件反射23、急性环境富集24,25、新物体探索26以及暗饲养后的视觉经验27。然而，可卡因行为敏化是一种稳定且显著的行为干预手段，能够在可卡因体验后形成广泛而持久的记忆痕迹，可持续数月之久28。
大脑被切片后，通过手工显微解剖分离伏隔核。根据我们的经验，从快速制备的脑切片中进行手工显微解剖是提取与行为范式相关组织最可靠且快速的方法。随着操作经验的积累，组织的边界会变得清晰并易于识别。另一种方法是制备精细切片，随后进行激光捕获显微切割。尽管该方法能够精确界定目标区域，但操作耗时较长（因而存在不稳定mRNA降解的风险），过程繁琐，且需要昂贵的专用设备（配备激光捕获系统的显微镜）。本文所述方案也可通过使用膜片钳移液管手动吸取经视觉识别细胞的细胞质，进而适用于单细胞转录分析29。需要强调的是，本方案所获得的结果反映的是细胞群体的平均状态，而极有可能在大多数情况下，组织内仅有一部分细胞亚群实际参与了对特定经历的响应。因此，选择性地对响应经历的特定细胞亚群进行转录谱分析具有重要意义，但对此类方法的讨论已超出本研究的范围。
对于mRNA纯化、逆转录和qPCR检测，需通过细针反复抽吸以破碎组织，随后使用市售试剂盒进行操作（更多信息参见表8）。该选择基于对这些方法的实践经验，可确保高效提取高质量RNA，并为下游应用提供可靠且稳定的结果。
尽管本方案以利用微流控动态阵列进行高通量qPCR为例进行描述，但也可采用终点PCR、低通量qPCR、基因表达微阵列或深度测序等方法对样本进行基因表达检测。之所以优先选择基于动态阵列的高通量qPCR，是因为在行为学实验范式后从脑核团中获得的mRNA通常数量有限。动态阵列提供了一个平台，能够在单次实验中高效地对大量平行样本的转录本进行系统性分析。在初始购置微流控系统（通常由机构统一采购）之后，后续实验运行成本相对较低。在此分析基础上，可进一步使用成本更高的平台对样本进行深入探究（如通过微阵列或RNA-seq寻找新转录本），而动态阵列的结果可作为全面的质量控制参考依据。最后，在数据分析方面，采用标准分析方法。本方案正文中将讨论可能出现的相关问题及具体注意事项。
本方案最适合希望对其研究体系进行深入研究的研究人员，尤其适用于需要研究多种条件和重复样本的情况。此外，该方案也最适合那些已经通过微阵列或RNA测序实验确定了50至500个目标基因子集，并希望对这些基因进行反复查询的研究人员。

<table><tbody><tr><td>病毒溶解液</td><td>Oriek Medical</td><td>J29D</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷，USP 100%</td><td>MINRAD INC</td><td>NDC 60307-110-25</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Universal Mini 试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>73404</td><td></td></tr><tr><td>QIAshredder</td><td>QIAGEN</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>高容量 cDNA 反转录试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>AB-4368814</td><td></td></tr><tr><td>TE 缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>1355656</td><td></td></tr><tr><td>行为实验箱（中密度纤维板；50 × 45 cm）</td><td></td><td></td><td>自行组装</td></tr><tr><td>内层亚克力箱（30 × 30 cm）</td><td></td><td></td><td>自行组装</td></tr><tr><td>摄像机与录像设备</td><td>Campden Inst.</td><td>CMD-80051</td><td></td></tr><tr><td>Media Recorder 软件</td><td>Noldus</td><td>NDS-NMR3-00M</td><td></td></tr><tr><td>虹膜剪刀</td><td>FST</td><td>FST-14062-09</td><td></td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Campden Inst.</td><td>7000SMZ-2</td><td></td></tr><tr><td>生物分析仪</td><td>Agilent Technologies</td><td>The Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td></td></tr><tr><td>PCR 仪</td><td>Bio-Rad</td><td>1852048</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微勺刮铲</td><td>Bochem Instrument GmbH</td><td>3213</td><td></td></tr><tr><td>Biomark HD 检测仪</td><td>Fluidigm</td><td>BMHD-BMKHD</td><td></td></tr><tr><td>96.96 基因表达动态阵列芯片</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M-96.96</td><td></td></tr></tbody></table>

行为经验后脑组织样本转录动态的综合分析

Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience

大脑对经历的编码以及长期记忆的巩固依赖于基因转录。确定特定基因在经历编码中的功能是分子神经科学的主要目标之一。此外，明确基因与特定行为之间的功能关联，有助于理解神经精神障碍的生物学基础。在小鼠接受各种行为干预后，其大脑中已观察到强烈的转录程序被诱导。尽管某些遗传元件在不同行为干预及不同脑核团中会反复被利用，但总体而言，转录程序具有刺激特异性和脑区特异性1,2。
本文介绍了一种针对小鼠脑核在行为干预后进行稳健且全面转录谱分析的实验方案。该方案以急性可卡因暴露后伏隔核内基因表达动态变化的分析为例进行了演示。在明确界定的 体内 根据经验，对目标神经组织进行解剖，随后进行RNA纯化、逆转录，并利用微流控阵列对多个目的基因进行全面的qPCR分析。本方案适用于起始材料量有限的情况（如小脑组织样本甚至单细胞），可实现对50-500个基因的全面分析。
该方案在对多个样本进行平行分析时最具优势（例如 单个细胞，在药物、病毒或行为干扰后的动态分析）。然而，该方案也可用于微阵列或RNA测序等全基因组研究前的样本表征与质量控制，以及全基因组研究所得数据的验证。

采用本方案所获得结果的质量在很大程度上取决于多个参数。合理的实验设计将最大限度地减少对实验小鼠的干扰，从而使所测试的经历（在本例中为可卡因暴露）成为其近期经历中最显著的事件，进而引发强烈且特异的转录程序。图1描述了对可卡因产生行为敏化的实验设计，明确了在可卡因经历后不同时间点从小鼠中分离并分析伏隔核的时机。下一个关键点是准确定义用于分析的组织切取范围。图2描述了伏隔核在冠状面和矢状面上的边界。理想情况下，解剖时应排除伏隔核组织的边缘薄层，仅取核心区域进行分析。这可确保仅对伏隔核进行一致性的分析，减少变异性和因混入周围组织而产生假象的可能性。
在扩增极微量RNA时（例如分离小脑核团时），需要进行多轮扩增才能有效检测到信号。因此，在任何定量PCR实验中，尤其是在起始材料量较少的情况下，一个关键环节是对扩增所用引物的表征。图3描述了设计最优引物的关键特征，图4展示了针对c-Fos和FosB的引物扩增曲线，表明这些引物对在每一轮扩增中均能以约100%的效率...

本文描述了一种用于分析啮齿类动物在特定行为范式后脑内特定核团转录程序的综合性分析方案。本文以小鼠急性可卡因暴露后伏隔核（NAc）中基因表达谱的变化为例，展示了利用微流控qPCR阵列进行基因表达谱分析的方法。

大脑对经历的编码以及长期记忆的巩固依赖于基因转录。确定特定……的功能

以下实验的总体目标是研究小鼠在行为经历后转录动态及特定脑核的变化。首先使动物适应环境，并在注射生理盐水后记录其运动活动。待动物适应后，给予单次可卡因处理并记录其运动活动，随后采集伏隔核组织样本，用于RNA提取和cDNA制备。接下来进行qPCR分析，以研究行为诱导的基因表达。最终获得的结果将展示可卡因体验后的转录动态。本实验方案将由实验室主管Hatu博士、实验室研究生Dum Muer以及实验室本科生Duran共同演示。在连续三天内，每只小鼠均需适应抓取和注射操作，并在实验开始前将小鼠分组安置于笼中，确保后续不再在不同笼子之间转移小鼠，且小鼠不得长时间单独隔离饲养。测试开始前30分钟，应将所有测试笼具转移至行为学实验房间，以使动物适应环境。注射后立即给予250微升生理盐水腹腔注射，随后将小鼠放入行为学检测箱中，监测其15分钟内的运动活动。小鼠也可在行为学检测箱中放置20分钟。监测第2至第17分钟的活动。在接下来的两天中，每天同一时间重复这些步骤。第四天，根据分组对小鼠注射一次可卡因或生理盐水，并立即将小鼠放入实验箱中，在可卡因暴露后的选定时间点监测局部运动活动20分钟，随后取出脑组织并将其置于冰冷的脑脊液（CSF）溶液中1至2分钟，以冷却并硬化组织。去除小脑并吸去多余液体后，将脑组织腹侧朝上粘附于振动切片机的载物台上。向切片室中加入冰冻的人工脑脊液（aCSF），切出200微米厚的脑片，直至清晰看到伏隔核。在切片过程中，需密切注意胼胝体的形态、前连合的位置与形状以及脑室的结构。确定正确区域后，切取两片400微米厚的脑片，随后在体视显微镜下分离出伏隔核。使用精细刀片将伏隔核从脑片中仔细切下。在正确区域快速划动刀片四次，即可立即分离出目标组织。将分离的组织放入 900 微升裂解试剂中，于 -80 摄氏度保存直至进行 RNA 提取；开始提取时，先在 37 摄氏度下融化离心管，然后进行匀浆。使用 25 号针头时，最初几次操作可能较为困难，需将组织推压离心管管壁以将其匀浆成小片段。为确保充分匀浆，将裂解液转移至 Kaya Shredder Mini 离心柱中，离心处理。将裂解液移入新的微量离心管中，并根据试剂盒说明书提取 RNA。RNA 纯化后，进行逆转录生成 cDNA，以及使用针对所选分析基因组的特异性引物对样本进行靶向预扩增。这些步骤在该方案的文字版本中有详细描述。用于全面QPCR分析的商用微流控芯片有48乘48格式，可实现48个样本与48种探针组的分析，也有96乘96格式，可用于96个样本与96种探针的分析。在大多数情况下，芯片的选择主要取决于待分析样本的数量。首先，根据实验所选芯片制备样品混合液。吸取20 XDNA结合染料样品上样试剂时需小心谨慎。将样品混合液充分振荡至少20秒，并离心至少30秒。制备好的反应液可在芯片准备上样前短暂保存于4°C。接下来，配制检测混合液，充分混匀样本混合液，并离心以使所有组分沉降至管底。如前所示，动态阵列IFC芯片设有样本和检测试剂的进样口，以及用于对微流控腔室加压的控制液专用进样口。首先，向芯片上的每个蓄液池注入对照液。接着，将芯片放入IFC控制器中，并运行相应的程序，以对芯片进行预处理。程序运行结束后，从IFC控制器中取出已完成预处理的芯片，用移液器向每个检测孔加入五微升（5 µL）的检测试剂。将混合物加入芯片中。使用IFC控制器软件，将每个样本混合物各5 µL加入其对应的入口，然后将芯片放回IFC控制器。运行程序脚本，将样本和检测试剂加载至芯片中。当加载混合脚本完成后，从IFC控制器中取出已加载的芯片。接着，将芯片放入热循环仪中，并创建一个新的芯片运行程序，包含熔解曲线分析。使用热循环仪软件确保反应室被正确识别，并让反应运行至完成。单次急性可卡因注射后，运动活动明显增加。在此冠状切面中，粗白线标记了用于界定伏隔核边界的切割位置。在解剖过程中，针对 CFOs 和 phos B 的引物扩增曲线表明，这些引物对可将其靶标转录本扩增的效率约为 100%。在每个周期中，实验结果表明，可卡因暴露后 1 小时和 2 小时，伏隔核中 CFOs 和磷酸化 B 蛋白的表达水平达到最高。在此基础上，可进一步采用其他方法（如新一代测序）来鉴定 novel uncharacterized transcript。

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科研

JoVE Journal

Behavior

行为

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