High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

这种蛋白质组学方法的总体目标是表征学习和记忆形成后突触处的分子重组，以了解基本机制和信号通路。该技术的主要优点是无假设的方法，允许对突触蛋白质组内的翻译后和修饰进行大规模定量和表征。我们建立的工作流程允许某种分子变化与特定行为之间存在相关性。

学习和记忆的形成是基于突触功效的变化，因此蛋白质组学研究应该更多地关注突触结构（如突触体）的分析，而不是脑组织的匀浆。蛋白质组学结果代表了高度复杂的数据集，因此需要生物信息处理。通过将测试鼠标放在隔音室内光线昏暗的穿梭箱中开始训练。

使用完全计算机控制的学习计划进行听觉辨别学习。在开始训练之前，先进行三分钟的沉默。在围棋试验中，动物必须在音调呈现后的 6 秒内越过障碍才能获得成功。

在禁行试验期间，动物必须在 6 秒的音调呈现期间留在穿梭箱的当前隔间中。以伪随机顺序执行 30 次 go 试验和 30 次 no-go 试验，试验间隔为 20 秒，以便一个会话由 60 次试验组成，持续时间约为 25 分钟。一旦进行了所有试验，将训练有素的小鼠放回家笼中，直到处死。

在牺牲鼠标并移除大脑后，使用视觉标志（包括血管和表面形状）定位听觉皮层。然后用手术刀和针头双侧解剖听觉皮层，将其解剖成矩形组织块。以视交叉为标志，将额叶皮层解剖为前囟 3.56 和 1.54 之间的脑切片。

将纹状体解剖为前囟 1.54 和 0.5 之间的脑切片。并小心地去除皮质组织。通过用针头穿过小脑稳定大脑并从枕叶开始展开皮层来解剖海马体。

在液氮中休克冷冻解剖的大脑样本。通过将解剖的脑组织转移到含有 1 毫升冰冷缓冲液 A 的匀浆容器中来开始突触体纯化，然后以 900 RPM 的速度使用大约 12 次冲程对组织进行匀浆。将样品以 1， 000 倍 G 离心 10 分钟。

离心后，保留上清液。像以前一样重新匀浆沉淀，并合并上清液。将合并的上清液以 12， 000 倍 G 离心 20 分钟，将沉淀重悬于 1 毫升匀浆缓冲液中，并以 900 RPM 的转速进行 6 次匀浆，然后以 1， 200 倍 G 离心 20 分钟。

在离心过程中产生 P2 沉淀，在超速离心管中制备蔗糖阶梯梯度。从 2.5 毫升 1.0 摩尔蔗糖缓冲液开始，然后使用玻璃巴斯德移液器对 1.5 毫升 1.2 摩尔蔗糖缓冲液进行分层。离心后，向 P2 沉淀中加入 0.5 毫升 0.32 摩尔蔗糖缓冲液。

然后使用 6 次笔画重新均质。将均质级分加载到梯度的顶部。将加载的梯度放入摆动的吊篮转子中，然后在超速离心机中以 85， 000 倍 G 旋转 2 小时。

离心完成后，丢弃顶部 0.32 摩尔蔗糖层，包括 1.0 摩尔蔗糖缓冲液界面处的材料。在 1 至 1.2 摩尔蔗糖缓冲液界面收集突触体。以 1.1 的比例向突触体组分中加入 0.32 摩尔蔗糖缓冲液。

小心混合，并以 150， 000 倍 G 离心 1 小时。突触体位于颗粒中，可以重新悬浮在缓冲液中以进行进一步处理。通过在超声波浴中在冰上孵育 1 小时，将动物每个大脑区域的突触体溶解在 20 至 50 微升 8 摩尔尿素中。

用 1% 的可去除去污剂稀释，以确保最终浓度为 2 摩尔尿素。使用 SDS-PAGE 确定相对蛋白质量后，将每个样品剩余部分的三分之一移液到新管中。通过添加 2 毫摩尔 DTT 和 25 毫摩尔碳酸氢铵进行溶液内消化，并轻轻涡旋样品。

将样品在 20 摄氏度下减少 45 分钟。将 10 毫摩尔 iota 乙酰度胺添加到氨基甲酸半胱氨酸残基中并混合。在 20 摄氏度的黑暗中孵育 30 分钟。

最后，加入 1 微升胰蛋白酶储备液，并在 20 摄氏度下孵育 12 小时。要去除酸裂解剂，请添加三氟乙酸至终浓度为 1%，并在 20 摄氏度下再孵育一小时。将样品以 16， 000 倍 G 离心 10 分钟后，小心收集上清液。

将固相萃取柱放在机架中，用 2 mL 甲醇平衡基质。洗涤后，再加入 2 mL 缓冲液 B 并上样。用缓冲液 B 洗涤 3 次后，加入 200 μL 70% 乙腈和 0.1% 三氟乙酸洗脱肽。

然后在真空离心机中干燥纯化的样品。在这个例子中，在训练过程中，接受 FM 音调辨别任务训练的动物表现出更高的命中率和更低的误报率。从第四次会议开始出现重大歧视。

在第一次训练后 24 小时，比较接受 FM 音调区分任务训练的小鼠和幼稚对照小鼠之间所选蛋白质的相对突触丰度。训练后，CYFP2 蛋白水平在所有研究区域都发生改变。不要忘记，动物经常表现出个体内部的变异性。

因此，强烈建议在研究中包括至少五个或更多匹配良好的动物群体的生物学重复。一旦建立，这种技术可以很容易地适应其他物种。例如，它已被用于监测单个果蝇大脑中依赖于学习的蛋白质表达变化。