Name: 鼠脑区的高分辨率定量突触蛋白质双向听觉辨别学习后 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: 学习利用蛋白质组学技术对小鼠进行听觉辨别学习后突触分子重组的高分辨率定量分析方法。该方法可无假设地大规模表征突触蛋白质组变化，揭示学习与记忆形成的分子机制。

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感谢 Yvonne Ducho 和 Kathrin Pohlmann 提供出色的技术支持。本工作由德国研究基金会（SFB 779）以及萨克森-安哈尔特州/欧洲区域发展基金（ERDF）通过行为脑科学中心（CBBS）资助。

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该研究提出了一种方法学工作流程，旨在对小鼠不同脑区在学习与记忆巩固过程中突触蛋白表达变化进行精确的定量分析。尽管质谱分析要求每个样本至少进行三次技术重复，该实验设计仍可在单个动物水平上研究蛋白表达情况。
该方法考虑了突触前和突触后特殊的蛋白质组成，其中包括高分子量的支架蛋白，也包括具有中等或较低分子量的重要介导蛋白。突触体样本的溶液内消化会产生大量源自支架蛋白的肽段，从而导致这些肽段的过度代表。这反过来可能抑制对较小或丰度较低蛋白的分析。建议从各样本等分试样中制备SDS-PAGE组分，并平行进行胶内消化，该方案有助于中等及低丰度蛋白的分析，是一种强烈推荐的互补方法。在对一个样本所获得的各组分分别进行质谱分析后（例如 溶液内消化、凝胶内消化、联合磷酸化富集组分）相应的质谱/质谱数据集可合并，并通过PEAKS软件或其他常用软件包进行蛋白质鉴定与定量分析。
或者，可分别应用样品的胶内消化组分（样品泳道中单独处理的凝胶区域）以及溶液内消化样品所产生的组分例如 通过离子交换色谱与质谱联用可提高分析深度。然而，这一扩展的工作流程会显著延长液相色谱-串联质谱（LS-MS/MS）数据采集所需的时间。为了获得学习与记忆形成过程中突触蛋白重排的详细分子序列，需要进行特定时间点的蛋白质组学分析。该时间进程可从首次训练开始时甚至训练过程中立即启动，并持续覆盖密集的时间节点，直至动物行为表现达到约8至10天训练后的学习曲线平台期（参见 图2 详情请参见）。
对突触蛋白磷酸化变化的分析需要特别关注FMTD学习过程中选定的时间点。一方面，在动物训练的早期阶段，预计会启动已知由蛋白磷酸化和去磷酸化触发的信号级联反应，从而引发突触蛋白的重排。另一方面，已知多种突触蛋白的磷酸化状态会发生持久性改变，这些改变调控着突触结构内部的连接性和组装19, 20。这些翻译后修饰甚至在记忆巩固的后期时间点仍然存在。
该蛋白质组学工作流程产生的复杂数据集需要经过生物信息学处理，以鉴定参与的分子通路和关键分子。荟萃分析显示，存在显著富集的通路，这些通路在学习和记忆过程中发挥重要作用。

学习依赖于记忆痕迹的形成及其维持。目前普遍认为，其潜在机制之一可能是神经元之间新的突触连接的活动依赖性形成和/或已有突触连接的重新排列。在分子水平上，已有研究描述了多种突触蛋白的蛋白质修饰、亚细胞定位变化以及周转率的改变1-4（Lamprecht, 2004 #8）。然而，迄今为止大多数研究主要集中在特定蛋白质上，而非全面分析复杂突触蛋白质组的整体组成。本方法可在小鼠脑区进行学习实验后，对突触蛋白质组的变化进行无偏倚的筛选，适用于获取学习诱导的突触结构重组过程中特定时间点的分子快照。该实验流程需要动物行为学、蛋白质生物化学、质谱分析和生物信息学等多个专业领域的研究人员协同合作。
所选的学习范式， 即 频率调制音调辨别（FMTD）是一种在啮齿类动物中特征明确的听觉辨别任务5在该穿梭箱Go/No-Go任务中，学习与长期记忆的形成涉及依赖于皮层多巴胺信号增强及蛋白质合成的机制。因此，近期针对沙鼠和小鼠的蛋白质组学研究揭示了多巴胺及学习诱导的突触组分在皮层以及更深层脑区中的可塑性重组，这些脑区在FMTD学习与记忆过程中可能相互作用。6-8这表明记忆形成涉及多个脑区之间的复杂相互作用，因此这些脑区在蛋白质组水平上可能受到差异性调控。因此，该实验流程包含了对小鼠特定皮层及皮层下脑区的分离。
此外，即使是对突触蛋白组成中微弱变化的可靠表征，也需要对突触前和突触后组分进行富集，而非直接分析匀浆液或粗膜组分9。因此，为提高突触特异性蛋白的检测水平和动态范围，在进行蛋白质组学分析之前，需采用已建立的方案制备突触体10,11。
将无标记高分辨率质谱用于定量分析的一个基本前提是蛋白质样品之间具有高度相似性。由于学习后突触蛋白质组成仅预期发生轻微变化，因此采用无标记方法比较来自训练小鼠和未训练小鼠的相应蛋白质样品是合适的。 alternatively，可采用基于稳定同位素的条件特异性蛋白质/肽段标记策略例如 TMT、iTRAQ、ICPL 和 SILAC 以及基于 MS2 的无标记定量技术（SWATH）均有应用价值，但相较于所选的无标记方法，这些技术成本更高，或需要特殊的质谱硬件。
由于蛋白质组学筛选通常会产生复杂的数据集，因此建议进行生物信息学处理，以实现对数据的恰当解读。进一步的元分析可能有助于更好地理解与范式相关变化背后的潜在分子机制，并识别所涉及的关键细胞过程和信号通路。下文还将介绍相应的研究方法。

<table><tbody><tr><td>3 M Empore 固相萃取-滤膜</td><td>3M Bioanalytical Technologies</td><td>4245SD</td><td>7 mm/3 ml</td></tr><tr><td>Acclaim PepMap 100</td><td>Dionex/Thermo Scientific</td><td>164564</td><td>100 &amp;micro;m x 2 cm, C18</td></tr><tr><td>Acclaim PepMap 100</td><td>Dionex/Thermo Scientific</td><td>164569</td><td>75 &amp;micro;m x 25 cm, C18</td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3738.1</td><td></td></tr><tr><td>乙腈 (ACN)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>AE70.2</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酰胺 (30%)</td><td>AppliChem</td><td>A0951</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢铵&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Fluka</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化铵&amp;nbsp;</td><td>Fluka&amp;nbsp;</td><td>44273</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵&amp;nbsp; (APS)</td><td>AppliChem</td><td>A2941</td><td></td></tr><tr><td>Biofuge &lt;em&gt;pico&lt;/em&gt;</td><td>Heraeus GmbH</td><td>75003280</td><td></td></tr><tr><td>考马斯亮蓝 R-250&amp;nbsp;</td><td>SERVA Electrophoresis GmbH</td><td>17525</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Pharmacia Biotech</td><td>17132901</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J 小鼠</td><td>Charles River&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>斑蝥素</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3322.1</td><td></td></tr><tr><td>适用于 MLS-50 的离心管</td><td>Beckman Coulter</td><td>344057</td><td></td></tr><tr><td>适用于 TLA 100.1 转子的离心管</td><td>Beckman Coulter</td><td>343776</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇 (DTT)</td><td>AppliChem</td><td>A1101</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5417R 离心机</td><td>VWR</td><td>22636138</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf A-8-11 转子</td><td>VWR</td><td>5407000317</td><td></td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Fluka</td><td>14265</td><td></td></tr><tr><td>GeneCodis</td><td>http://genecodis.cnb.csic.es/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gephi</td><td>https://gephi.org/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>AppliChem</td><td>A1123</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>AppliChem</td><td>A1067</td><td></td></tr><tr><td>HALT 磷酸酶抑制剂混合液&amp;nbsp;</td><td>Pierce /Thermo Scientific</td><td>78420</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 缓冲液&amp;nbsp;</td><td>PAA Laboratories GmbH</td><td>S11-001</td><td></td></tr><tr><td>2 ml 匀浆管</td><td>Sartorius AG</td><td>854 2252</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>Ingenuity 通路分析</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>碘乙酰胺 (IAA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>实验室钻孔驱动器 &amp;nbsp;K-ControlTLC 4957&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Kaltenbach &amp;amp; Vogt GmbH</td><td>182997</td><td></td></tr><tr><td>LTQ Tune Plus 2.7.0.1112 SP2</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap Velos Pro</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Macs-mix 试管旋转混合仪</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>Magic Scan 4.71</td><td>UMAX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>AE71.2</td><td></td></tr><tr><td>MLS-50 转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>367280</td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX 超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>364300</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler 预染蛋白 Marker</td><td>Thermo Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>PEAKS 7.5</td><td>Bioinformatic Solutions&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸酶抑制剂混合液 3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0044</td><td></td></tr><tr><td>PhosphoRS 3.1</td><td>IMP/IMBA/GMI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Roche</td><td>4906845001</td><td></td></tr><tr><td>聚四氟乙烯 (PTFE) 制推杆/研杵</td><td>Sartorius AG</td><td>854 2651</td><td></td></tr><tr><td>PotterS 匀浆器</td><td>Sartorius AG</td><td>853 3024</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂完全 mini</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>Quantity One 4.5.1</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RapiGest</td><td>Waters</td><td>186002122</td><td></td></tr><tr><td>穿梭箱</td><td>Coulbourne Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠 (SDS)</td><td>AppliChem</td><td>A1112</td><td></td></tr><tr><td>钼酸钠</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>274.2</td><td></td></tr><tr><td>酒石酸钠二水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>228729</td><td></td></tr><tr><td>SONOREX RK 156 超声波清洗仪</td><td>BANDELIN electronic GmbH &amp;amp; Co. KG</td><td>305</td><td></td></tr><tr><td>隔音室</td><td>Industrial Acoustics Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4621.2</td><td></td></tr><tr><td>四甲基乙二胺 (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer&lt;em&gt; basic&lt;/em&gt;</td><td>CallMedia</td><td>111000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a name=&quot;RANGE!A60">Titansphere TiO 5&amp;micro;m&lt;/a&gt;</td><td>GL Sciences Inc. Japan</td><td>502075000</td><td></td></tr><tr><td>TLA 100.1 转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>343840</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸&amp;nbsp; (TFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>三(羟甲基)氨基甲烷 (TRIS)</td><td>AppliChem</td><td>A1086</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶 Gold</td><td>Promega</td><td>V5280</td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3000 超高效液相色谱&amp;nbsp;</td><td>Dionex/Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超速离心管</td><td>Beckman Coulter</td><td>343776</td><td></td></tr><tr><td>Unijet II 冷却式抽吸泵</td><td>Uniequip Laborger&amp;auml;te- und Vertriebs GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UNIVAPO 100 H 浓缩离心机&amp;nbsp;</td><td>Uniequip Laborger&amp;auml;te- und Vertriebs GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>AppliChem</td><td>A1049</td><td></td></tr><tr><td>水（高纯度纯化水）</td><td></td><td></td><td>电阻率：&gt; 18.2 M&amp;Omega;*cm（25 &amp;deg;C）&amp;nbsp; 内毒素：&amp;lt; 0.02 EU/ml&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 总有机碳 (TOC)：&amp;lt; 10 ppb</td></tr><tr><td>Xcalibur 3.0.63</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZipTip&lt;sub&gt;C18&lt;/sub&gt; 吸头</td><td>MILLIPORE</td><td>ZTC18S960</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠听觉辨别学习后脑区突触蛋白质组的高分辨率定量分析

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

介导听觉学习与记忆的分子突触机制在很大程度上仍不明确。本文描述了一项针对小鼠听觉分辨学习的蛋白质组学研究的工作流程。在此学习范式中，小鼠在穿梭箱的“Go/NoGo”任务中接受训练，以区分上升与下降频率调制音调，从而避免轻微的电击刺激。该方案包括在训练的不同阶段，从小鼠的四个脑区——听觉皮层、额叶皮层、海马和纹状体——富集突触体。通过蛋白质组学方法，将训练小鼠获得的突触蛋白表达模式与未受训练的对照组进行比较。为达到足够的分析深度，在质谱分析前对样本采用三种不同的分离方式：一维SDS-PAGE凝胶内消化、溶液内消化以及磷酸化肽段富集。
采用高分辨率质谱分析和非标记定量技术，对突触体蛋白样品中去除了磷酸肽和富集了磷酸肽的组分进行突触蛋白谱的检测。利用商业软件分析显著调控的突触相对丰度水平（训练组/未训练对照组）的蛋白质和磷酸化肽段。观察到训练后小鼠脑区中突触蛋白质组的共同及差异性调控模式。随后，通过多个数据库的元分析，鉴定出潜在的细胞功能和生物学通路。

图1 总结了小鼠在听觉辨别学习后，对其脑区进行定量突触蛋白质组分析的完整工作流程。该流程始于动物在穿梭箱中的训练。在下图示例中 图2小鼠开始在4 kHz频率调制音分辨任务中表现出显著的分辨能力th 训练阶段显示出高效的学习效果。在选定的时间点处死动物，以分离脑区。突触的富集可通过制备突触体实现，或者 alternatively 通过制备富集突触后密度（PSD）的组分来实现，两种方法均在下文中详细描述。 图3. PSD富集法已针对微量组织样本进行优化， 例如 1 - 2 个大鼠脑 hippocampal 脑片12, 18需要小型离心管、与这些离心管匹配的聚四氟乙烯（PTFE）研磨杵，以及用于驱动研磨杵的实验室钻孔机。
由于突触体具有特殊的蛋白质组成，强烈建议采用两种不同但互补的方法进行样品制备。突触后致密物质（PSD）支架通常是高化学计量比的高分子量蛋白质。溶液内消化是高效提取这些蛋白的最佳方法，但可能导致肽混合物的过度取样。同时平行进行的凝胶内消化则可排除这些高分子量蛋白，有利于中低分子量蛋白质的分析。为了实现全面的分析，建议同时采用这两种类型的蛋白酶解消化方法。
所研究的不同脑区组织量存在差异，需对所用材料进行调整，以便更好地进行比较。在所研究的四个脑区中，听觉皮层通常是限制因素。在制备突触体或富含突触后密度（PSD）组分后（见3.1.1节），其他所有脑区的材料量应根据听觉皮层的量进行精确调整。从小鼠新鲜制备的各脑区典型重量如下：听觉皮层（AC）：约50 mg；海马（HIP）：约90 mg；纹状体（STR）：约120 mg；前额叶皮层（FC）：约100 mg。
第2.3节所述的PSD富集方法，可在单个动物水平上，从每个脑区鉴定出约1500种不同的蛋白质和约250种不同的磷酸化肽（表1）。在首次训练后24小时进行的蛋白质组学分析显示，与未经训练的对照组相比，7.3%的已鉴定蛋白质和5.8%的磷酸化肽在突触表达水平上发生了显著（p&lt;0.05）的定量变化（表1）。突触支架蛋白表现出明显的下调趋势，这可能提示在FMTD学习的早期阶段发生了显著的突触结构重塑。绝大多数受调控的蛋白质在不同脑区呈现区域特异性变化，仅有22%的蛋白质在两个或更多脑区中被共同调控。六个代表性示例见图4。
IPA 对复杂结果的荟萃分析表明，以下经典信号通路可能被特别参与或调控：“网格蛋白介导的内吞作用信号通路”、“轴突导向信号通路”、“钙信号通路”、“RhoA 信号通路”、“Notch 信号通路”、“上皮粘附连接重塑”、“谷氨酸受体信号通路”、“GABA 受体信号通路”、“多巴胺受体信号通路”以及“突触长时程增强”。
单次富集分析显示，前额叶皮层中与蛋白质转运、细胞黏附、磷酸化、内吞作用、囊泡介导的转运、前脑发育以及轴突发育相关的生物学过程显著富集（图5）。在听觉皮层中，显著的生物学过程包括离子转运、翻译、mRNA转运、蛋白质转运以及学习功能。对海马体蛋白质组分的分析检测到与离子转运、细胞周期、翻译、磷酸化以及神经系统发育显著相关的富集过程。在纹状体中，发现显著富集的生物学过程包括mRNA转运、囊泡介导的转运、轴突发育、蛋白水解、蛋白质转运以及内吞作用。
<img alt="穿梭箱训练示意图；高分辨率液相色谱-串联质谱，磷酸化肽富集方法。" src="/files/ftp_upload/54992/54992fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1： 方法学策略的系统性工作流程。 本图以示意图形式总结了针对特定脑区突触蛋白组成进行高分辨率定量分析的整体工作流程。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54992/54992fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="会话次数与“go”反应的图表；命中与误报数据；行为实验分析。" src="/files/ftp_upload/54992/54992fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 2"> 
图2： 小鼠在FM音调辨别任务中表现的示例。 在训练过程中，动物的命中率（蓝色曲线）逐渐上升，而误报率（黑色曲线）逐渐下降。从第四次会话开始出现显著的辨别能力。误差条表示标准误（SEM）。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54992/54992fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="突触体分离示意图；显示离心步骤及用于膜分离的蔗糖梯度法。" src="/files/ftp_upload/54992/54992fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3： 突触体及PSD富集组分的制备。 A： 突触体的制备。 B： PSD富集组分的制备。两图分别说明了从脑组织中制备突触体或PSD富集组分的详细操作流程。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54992/54992fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="条形图比较实验分析中不同脑区的蛋白质表达水平。" src="/files/ftp_upload/54992/54992fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4： 部分定量蛋白质组学结果。 比较在首次训练后 24 小时，接受 FMTD 任务训练的小鼠（AV，n = 6）与未受训练的对照小鼠（NV，n = 6）之间特定蛋白质在突触中的相对丰度。蛋白质丰度值通过其三条最强烈肽段的峰面积中位数计算得出。图中标注了丰度变化显著的蛋白质（AV/NV；t 检验）：* p &lt; 0.05，** p &lt; 0.01，*** p &lt; 0.005。误差线表示标准差（SD）。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54992/54992fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="显示蛋白质相互作用和磷酸化通路的生物过程网络图。" src="/files/ftp_upload/54992/54992fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 
图 5： 通过 GeneCodis/Gephi 对额叶皮层生物通路的可视化。 此处仅显示与“生物过程”相关的 Gene Ontology (GO) 数据库（http://geneontology.org）中具有统计学显著性的条目，且每个条目所包含的蛋白质数量至少为三个。节点代表 GO 条目，节点的大小、连线的宽度以及某一节点的连接数量表示共享该 GO 条目的蛋白质数量。由于采用了 Gephi 的“Force Atlas”布局算法，相关的节点会紧密聚集在一起。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54992/54992fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>脑区</td>
			<td>AC</td>
			<td>FC</td>
			<td>HIP</td>
			<td>STR</td>
			<td>∑</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>鉴定出的蛋白质</td>
			<td>1435</td>
			<td>1758</td>
			<td>1572</td>
			<td>1507</td>
			<td>6272</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>差异表达蛋白质 (p&lt;0.05)</td>
			<td>59</td>
			<td>130</td>
			<td>162</td>
			<td>108</td>
			<td>459</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>↑ AV/NV</td>
			<td>8</td>
			<td>4</td>
			<td>76</td>
			<td>35</td>
			<td>123</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>↓ AV/NV</td>
			<td>51</td>
			<td>126</td>
			<td>86</td>
			<td>73</td>
			<td>336</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>鉴定出的磷酸化基序</td>
			<td>197</td>
			<td>361</td>
			<td>273</td>
			<td>278</td>
			<td>1109</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>差异表达磷酸化基序 (p&lt;0.05)</td>
			<td>8</td>
			<td>22</td>
			<td>21</td>
			<td>14</td>
			<td>65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>↑ AV/NV</td>
			<td>4</td>
			<td>17</td>
			<td>5</td>
			<td>9</td>
			<td>35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>↓ AV/NV</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
			<td>16</td>
			<td>5</td>
			<td>30</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：蛋白质组学结果概要。 本表总结了一项代表性蛋白质组学实验，比较了训练小鼠（AV，n=6）在首次训练后24小时与其未训练对照组（NV，n=6）的差异。共检测到459种表达改变的蛋白质，其中包含重叠的调控结果。其中283种调控被确定为脑组织特异性。具体而言，57种蛋白质在两个脑区中发生调控，18种蛋白质调控在三个脑区中被检测到，仅有2种蛋白质在所有四个被研究的脑区中均发生调控。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>误差容限</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>前体离子质量（傅里叶变换质谱法）</td>
			<td>10 ppm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>碎片离子质量（线性离子阱）</td>
			<td>0.6 Da</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>每条肽段允许的最大漏切位点数</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>固定修饰</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>凝胶内消化样品</td>
			<td>半胱氨酸的羧氨甲基化</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>溶液内消化样品</td>
			<td>半胱氨酸的甲硫基化</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>可变修饰</td>
			<td>甲硫氨酸的氧化</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>天冬酰胺和/或谷氨酰胺的脱酰胺</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>数据库</td>
			<td>Uniprot/Sprot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>物种分类</td>
			<td>小鼠</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>统计学鉴定-接受参数设置</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>从头平均局部置信度（ALC）</td>
			<td> &gt; 50%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>肽段错误发现率（FDR，基于估计的诱饵融合）</td>
			<td> &lt; 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>蛋白质显著性（-10logP，基于修正的t检验）</td>
			<td>&gt; 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>每种蛋白质的唯一肽段数</td>
			<td> ≥ 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>定量参数设置：</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>用于定量的肽段需满足：</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>肽段显著性（-10logP）</td>
			<td>&gt; 30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>肽段在</td>
			<td> ≥ 50% 的样品中被鉴定到</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>肽段信号质量</td>
			<td>&gt;1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>肽段平均峰面积</td>
			<td> &gt; 1E5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>肽段保留时间容差</td>
			<td> &lt; 5 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>归一化</td>
			<td>基于总离子流（TIC）</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：蛋白质鉴定参数设置（步骤4.2.2）。

识别调控突触可塑性和记忆的分子与通路，至今仍是神经科学领域的主要挑战之一。本文描述了一种工作流程，用于在听觉学习范式中，对可能参与学习与记忆巩固过程中突触分子重组的突触蛋白进行相对定量分析。

听觉学习与记忆背后的分子突触机制在很大程度上仍不清楚。本文介绍了一项针对听觉的蛋白质组学研究的工作流程...

该蛋白质组学方法的总体目标是表征学习与记忆形成后突触处的分子重排，以理解其基本机制和信号通路。该技术的主要优势在于其无需预先假设，能够对突触蛋白质组中的翻译后修饰进行大规模定量与表征。我们已建立的工作流程可实现特定分子变化与特定行为之间的关联分析。学习与记忆的形成基于突触效能的改变，因此蛋白质组学研究应更多关注突触结构（如突触体）的分析，而非脑组织匀浆。蛋白质组学结果呈现出高度复杂的数据库，因而需要生物信息学处理。开始训练时，将待测小鼠置于隔音室内的昏暗穿梭箱中。采用完全由计算机控制的学习时间表进行听觉辨别学习。在开始训练前，先进行三分钟的静音习惯化阶段。在“go”试验中，动物必须在声音呈现后的六秒内越过障碍，才能记为一次正确反应。在非进行试验（no-go trials）中，动物需在提示音持续的六秒内停留在穿梭箱的当前隔间内。以伪随机顺序进行30次进行试验（go trials）和30次非进行试验（no-go trials），每次试验之间设置20秒的间隔，使单次实验共包含60次试验，持续约25分钟。完成所有试验后，将训练过的小鼠放回饲养笼，直至处死。处死小鼠并取出脑组织后，利用血管和脑表面形态等视觉标志定位听觉皮层。然后使用手术刀和针头双侧解剖听觉皮层，获取一块矩形组织。以视交叉为解剖标志，从前囟3.56 mm至1.54 mm处切取额叶皮层脑片。在前囟（Bregma）1.54至0.5之间的脑切片中分离纹状体，并小心去除皮层组织。通过将针插入小脑固定脑组织，从枕叶开始展开皮层，以分离海马体。将解剖的脑组织样本在液氮中速冻。开始突触体纯化时，将解剖的脑组织转移至含有1 mL冰上预冷的缓冲液A的匀浆器中，然后以900 RPM的速度匀浆，约12次。将样品在4°C下以1,000 ×g离心10分钟。离心后，保留上清液。将沉淀物重新混匀，方法同前，并合并上清液。将合并后的上清液在12,000 × g 条件下离心20分钟。将沉淀物重悬于1毫升匀浆缓冲液中，以900 RPM进行6次匀浆，随后在1,200 × g 条件下离心20分钟。在离心制备P2沉淀的过程中，于超速离心管中制备蔗糖浓度梯度。首先加入2.5毫升1.0摩尔蔗糖缓冲液，然后使用玻璃巴斯德移液管将1.5毫升1.2摩尔蔗糖缓冲液小心地铺在下层。离心结束后，向P2沉淀中加入0.5毫升0.32摩尔蔗糖缓冲液。然后用六次冲程重新匀浆。将匀浆后的组分加在梯度液顶部。将加样后的梯度液放入摆动桶转子中，于超速离心机中以85,000 × g离心两小时。离心完成后，弃去上层 0.32 mol/L 蔗糖层，包括与 1.0 mol/L 蔗糖缓冲液界面处的物质。收集位于 1.0 至 1.2 mol/L 蔗糖缓冲液界面处的突触体。按 1.1 的比例向突触体组分中加入 0.32 mol/L 蔗糖缓冲液。小心混合后，在150,000 × g条件下离心一小时。突触体存在于沉淀中，可用缓冲液重新悬浮以进行后续处理。将每只动物各脑区的突触体溶于20至50微升8摩尔尿素中，置于冰上并在超声波清洗器中孵育一小时。用可去除的去垢剂稀释至终浓度为1%，以确保终浓度为2摩尔的尿素。通过SDS-PAGE确定各样品中相对蛋白质含量后，将每份样品剩余部分的三分之一转移至新的离心管中。加入2毫摩尔的DTT和25毫摩尔的碳酸氢铵，轻轻涡旋混匀，进行溶液内酶解。在20摄氏度下还原样品45分钟。加入10毫摩尔碘乙酰胺以羧甲基化半胱氨酸残基，并混匀。在20摄氏度避光孵育30分钟。最后，加入1 µL胰蛋白酶储存液，在20 °C下孵育12小时。为去除酸可裂解的去垢剂，加入三氟乙酸至终浓度为1%，并在20 °C下继续孵育1小时。将样品在16,000 ×g下离心10分钟，小心收集上清液。将固相萃取柱置于支架上，用 2 毫升甲醇平衡柱体。洗涤后，加入额外的 2 毫升缓冲液 B 并上样。用缓冲液 B 洗涤三次后，加入 200 微升 70% 乙腈和 0.1% 三氟乙酸洗脱肽段。然后在真空离心浓缩仪中干燥纯化后的样品。在此示例中，接受FM音调辨别任务训练的动物在训练过程中击中率逐渐升高，误报率逐渐降低。从第四次训练 session 开始出现显著的辨别能力。在完成首次训练后24小时，比较了接受FM音调分辨任务训练的小鼠与未受训练的对照小鼠之间特定蛋白的突触相对丰度。训练后，所有研究脑区中的CYFP2蛋白水平均发生改变。请勿忽视动物个体内部常存在的变异性。因此，强烈建议在研究中至少包含五个或更多匹配良好的动物组生物学重复。一旦建立，该技术可轻松适用于其他物种。例如，该技术已用于监测单个果蝇大脑中依赖学习的蛋白质表达变化。

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