鼠脑区的高分辨率定量突触蛋白质双向听觉辨别学习后
December 15th, 2016
鉴定控制突触可塑性和记忆的分子和通路仍然是神经科学的一个主要挑战。在这里，描述了一个工作流程，解决了在听觉学习范式中的学习和记忆巩固过程中被认为参与突触分子重组的突触蛋白的相对定量。
这种蛋白质组学方法的总体目标是表征学习和记忆形成后突触处的分子重组，以了解基本机制和信号通路。该技术的主要优点是无假设的方法，允许对突触蛋白质组内的翻译后和修饰进行大规模定量和表征。我们建立的工作流程允许某种分子变化与特定行为之间存在相关性。
学习和记忆的形成是基于突触功效的变化，因此蛋白质组学研究应该更多地关注突触结构（如突触体）的分析，而不是脑组织的匀浆。蛋白质组学结果代表了高度复杂的数据集，因此需要生物信息处理。通过将测试鼠标放在隔音室内光线昏暗的穿梭箱中开始训练。
使用完全计算机控制的学习计划进行听觉辨别学习。在开始训练之前，先进行三分钟的沉默。在围棋试验中，动物必须在音调呈现后的 6 秒内越过障碍才能获得成功。
在禁行试验期间，动物必须在 6 秒的音调呈现期间留在穿梭箱的当前隔间中。以伪随机顺序执行 30 次 go 试验和 30 次 no-go 试验，试验间隔为 20 秒，以便一个会话由 60 次试验组成，持续时间约为 25 分钟。一旦进行了所有试验，将训练有素的小鼠放回家笼中，直到处死。
在牺牲鼠标并移除大脑后，使用视觉标志（包括血管和表面形状）定位听觉皮层。然后用手术刀和针头双侧解剖听觉皮层，将其解剖成矩形组织块。以视交叉为标志，将额叶皮层解剖为前囟 3.56 和 1.54 之间的脑切片。
将纹状体解剖为前囟 1.54 和 0.5 之间的脑切片。并小心地去除皮质组织。通过用针头穿过小脑稳定大脑并从枕叶开始展开皮层来解剖海马体。
在液氮中休克冷冻解剖的大脑样本。通过将解剖的脑组织转移到含有 1 毫升冰冷缓冲液 A 的匀浆容器中来开始突触体纯化，然后以 900 RPM 的速度使用大约 12 次冲程对组织进行匀浆。将样品以 1， 000 倍 G 离心 10 分钟。
离心后，保留上清液。像以前一样重新匀浆沉淀，并合并上清液。将合并的上清液以 12， 000 倍 G 离心 20 分钟，将沉淀重悬于 1 毫升匀浆缓冲液中，并以 900 RPM 的转速进行 6 次匀浆，然后以 1， 200 倍 G 离心 20 分钟。
在离心过程中产生 P2 沉淀，在超速离心管中制备蔗糖阶梯梯度。从 2.5 毫升 1.0 摩尔蔗糖缓冲液开始，然后使用玻璃巴斯德移液器对 1.5 毫升 1.2 摩尔蔗糖缓冲液进行分层。离心后，向 P2 沉淀中加入 0.5 毫升 0.32 摩尔蔗糖缓冲液。
然后使用 6 次笔画重新均质。将均质级分加载到梯度的顶部。将加载的梯度放入摆动的吊篮转子中，然后在超速离心机中以 85， 000 倍 G 旋转 2 小时。
离心完成后，丢弃顶部 0.32 摩尔蔗糖层，包括 1.0 摩尔蔗糖缓冲液界面处的材料。在 1 至 1.2 摩尔蔗糖缓冲液界面收集突触体。以 1.1 的比例向突触体组分中加入 0.32 摩尔蔗糖缓冲液。
小心混合，并以 150， 000 倍 G 离心 1 小时。突触体位于颗粒中，可以重新悬浮在缓冲液中以进行进一步处理。通过在超声波浴中在冰上孵育 1 小时，将动物每个大脑区域的突触体溶解在 20 至 50 微升 8 摩尔尿素中。
用 1% 的可去除去污剂稀释，以确保最终浓度为 2 摩尔尿素。使用 SDS-PAGE 确定相对蛋白质量后，将每个样品剩余部分的三分之一移液到新管中。通过添加 2 毫摩尔 DTT 和 25 毫摩尔碳酸氢铵进行溶液内消化，并轻轻涡旋样品。
将样品在 20 摄氏度下减少 45 分钟。将 10 毫摩尔 iota 乙酰度胺添加到氨基甲酸半胱氨酸残基中并混合。在 20 摄氏度的黑暗中孵育 30 分钟。
最后，加入 1 微升胰蛋白酶储备液，并在 20 摄氏度下孵育 12 小时。要去除酸裂解剂，请添加三氟乙酸至终浓度为 1%，并在 20 摄氏度下再孵育一小时。将样品以 16， 000 倍 G 离心 10 分钟后，小心收集上清液。
将固相萃取柱放在机架中，用 2 mL 甲醇平衡基质。洗涤后，再加入 2 mL 缓冲液 B 并上样。用缓冲液 B 洗涤 3 次后，加入 200 μL 70% 乙腈和 0.1% 三氟乙酸洗脱肽。
然后在真空离心机中干燥纯化的样品。在这个例子中，在训练过程中，接受 FM 音调辨别任务训练的动物表现出更高的命中率和更低的误报率。从第四次会议开始出现重大歧视。
在第一次训练后 24 小时，比较接受 FM 音调区分任务训练的小鼠和幼稚对照小鼠之间所选蛋白质的相对突触丰度。训练后，CYFP2 蛋白水平在所有研究区域都发生改变。不要忘记，动物经常表现出个体内部的变异性。
因此，强烈建议在研究中包括至少五个或更多匹配良好的动物群体的生物学重复。一旦建立，这种技术可以很容易地适应其他物种。例如，它已被用于监测单个果蝇大脑中依赖于学习的蛋白质表达变化。
概述
本研究描述了一种蛋白质组学工作流程，旨在描述听觉学习和记忆巩固过程中突触处的分子重组。该方法侧重于量化参与这些过程的突触蛋白。
研究的关键组成部分
科学领域
- 神经科学
- 蛋白质组学
- 突触可塑性
背景
- 理解突触可塑性对于洞察记忆形成至关重要。
- 蛋白质组学研究可以揭示突触结构的变化。
- 大规模量化允许无假设分析。
- 生物信息处理对于处理复杂数据集至关重要。
研究目的
- 描述学习后突触处的分子变化。
- 将分子变化与特定行为相关联。
- 增强对记忆涉及的信号通路的理解。
使用的方法
- 小鼠的听觉辨别学习。
- 从脑组织中纯化突触体。
- 使用SDS-PAGE和溶液消化进行蛋白质组学分析。
- 对训练和未训练小鼠的蛋白质水平进行统计比较。
主要结果
- 在训练后观察到蛋白质水平的显著变化。
- CYFP2蛋白质水平在各个脑区发生了改变。
- 训练过的小鼠表现出行为改善。
- 经过几次训练课程后，辨别能力显著提高。
结论
- 该研究提供了关于学习相关突触变化的见解。
- 蛋白质组学方法可以有效地将分子变化与行为联系起来。
- 未来的研究可以在这些发现的基础上探索记忆机制。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-resolution quantitative synaptic proteome profiling enables discovery-stage teams to map molecular changes underlying learning and memory, directly informing target validation and mechanistic de-risking in CNS drug discovery. By correlating synaptic protein dynamics with behavioral outcomes, this workflow enhances predictive confidence for early portfolio decisions in neuropsychiatric and neurodegenerative research. The approach supports enterprise R&D by providing scalable, hypothesis-free proteomic data for cross-functional evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables unbiased identification of synaptic protein changes linked to behavioral phenotypes.
- Supports mechanistic de-risking by mapping post-translational modifications in disease-relevant brain regions.
- Facilitates functional target validation through quantitative comparison of trained versus control cohorts.
- Provides a foundation for prioritizing molecular targets based on learning-dependent regulation.
Screening & Assay Development
- Delivers validated synaptosome preparations for downstream proteomic and biochemical assays.
- Establishes reproducible workflows for quantitative protein and phospho-peptide measurement.
- Enables assay standardization across multiple brain regions and experimental conditions.
- Supports scalable screening of candidate modulators affecting synaptic proteome signatures.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular findings with behavioral endpoints for translational biomarker development.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by tracking synaptic changes across learning stages.
- Supports risk-adjusted advancement by linking proteomic shifts to functional outcomes.
- Provides mechanistic insights for preclinical model selection and validation.
Pipeline & Workflow Integration
This proteomic workflow integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting hypothesis testing and mechanistic de-risking in CNS pipelines.
- Discovery Biology: Quantitative synaptic profiling clarifies pathway engagement and molecular adaptation after behavioral training.
- Screening: Standardized synaptosome and peptide fractionation enable reproducible, quantitative readouts for compound evaluation.
- Analytics: Label-free quantification and statistical analysis provide robust comparative outputs across experimental groups.
- Translational Research: Correlation of molecular and behavioral data supports biomarker alignment and translational continuity.
- Enterprise Reuse: The workflow is adaptable to other species and learning paradigms, supporting broad R&D utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible proteomic workflows for cross-team adoption.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and capital allocation by linking molecular changes to functional outcomes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and models based on quantitative synaptic data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroanatomy, proteomics, and bioinformatics for data acquisition and analysis.
- Demands access to high-resolution mass spectrometry and robust computational infrastructure.
- Necessitates standardized protocols for synaptosome isolation and peptide fractionation across teams.
- Adaptable to various species and behavioral paradigms with appropriate validation.
- Biological variability mandates sufficient replicates and rigorous statistical analysis for reliable interpretation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:14
Auditory Discrimination Learning in the Shuttle Box (FMTD Paradigm)
2:28
Brain Dissection
3:43
Purification of Synaptosomes from Crude Brain Membrane Fractions
6:29
Sample Preparation for Mass Spectrometry Using In-solution Digest
9:02
Results: Synaptic Abundance of selected Proteins After FMTD Task Training
9:53
Conclusion
