阵列比较基因组杂交（CGH阵列），用于检测基因拷贝数变异的

该程序的总体目标是排列比较基因组杂交，以识别基因组中可能导致多种遗传疾病的不平衡。这是通过首先用荧光染料标记患者的 DNA 来实现的。在第二步中，将患者 DNA 和不同标记的参考 DNA 与阵列杂交。

接下来，扫描阵列以测量患者的数量，并参考每个探针的 DN 比比皆是。在最后一步中，对扫描图像进行处理，以识别基因组中患者 DNA 的物质多于或少于参考 DNA 最终阵列的区域。比较基因组杂交用于确定患者是否携带导致遗传综合征的拷贝数变异。

这种方法的视觉演示至关重要，因为阵列玻片的组装可能很困难，而且很容易杂交。混合从腔室中溢出的物质 在开始标记反应之前。在 4 摄氏度下解冻即用型 96 孔板的核苷酸和引物，并避光约一小时。

解冻后，在室温下再平衡覆盖的板 30 分钟，此时在 60 摄氏度下平衡 DNA 样品 15 分钟。当样品加热时，使用液体处理机器人将足够的无核酸酶水分配到新 96 孔板的每个孔中。然后，当 DNA 准备好时，将每孔 1 μg 样品转移到 96 孔板水中。

现在将 20 μL 的平衡核苷酸和引物转移到含有稀释 DNA 样品的每个板中，并用条带盖密封板，注意进行紧密密封。接下来，在带有加热盖的 PCR 机器中，在 99 摄氏度下使 DNA 变性 10 分钟，并将板在冰上快速冷却 5 分钟，使引物屈膝。然后使用液体处理机器人向每个样品中加入 10 μL 的清除 exo DNA 聚合酶。

用移液管混合样品，然后密封板并在 37 摄氏度下孵育 16 小时。第二天，用每孔 5 μL 终止缓冲液终止反应，然后去除未掺入的核苷酸。将每个孔的内容物转移到单独的预先标记的 2 ml 试管中。

将样品和 DNA 纯化离心柱以及适当的相关缓冲液加载到离心柱处理机器人中。根据制造商的说明，离心柱处理机器人将使用每管 250 微升高盐 DNA 结合缓冲液将标记的 DNA 结合到硅胶膜上，然后用 500 微升洗涤缓冲液洗涤两次从膜上去除杂质。然后，机器人将向膜中加入 15 μL 低盐溶液缓冲液，以回收约 12 μL 体积的纯化标记 DNA 样品，以杂交样品。

接下来，将杂交炉预热至 65 摄氏度，并预热背衬玻片和杂交室。为了制备杂交混合物，将 1.1 微升 cot 1D NA、4.95 微升制造商提供的封闭混合物和 24.75 微升杂交缓冲液混合。使用液体处理机器人将此混合物分配到新的 96 孔板的每个孔中，并预润湿每个吸头以提高转移准确性。

接下来吸取 9.35 微升适当的签名，三个标记的 DNA，然后移取 9.35 微升适当的签名，五个标记的 DNA。对于每个孔，密封板，将样品四次密封 1 分钟，然后快速旋转板以收集每个孔底部的内容物。在预杂交培养箱中使标记的 DNA 变性。

首先在 95 摄氏度下持续 3 分钟，然后在 37 摄氏度下持续 30 分钟。然后在 42 摄氏度的加热平台上工作。将背衬滑片放入杂交室中，确保垫圈的透明部分与杂交室的开窗部分对齐使用预湿吸头。

现在慢慢地将 42 μL 杂交混合物移液到阵列背衬玻片适当位置的中心。注意液体不要接触橡胶圈边界。一旦所有位置都填满，小心地将阵列载玻片放到背衬载玻片上，然后组装杂交室。

注意带有写入的阵列的一面朝向背衬玻片，然后完全拧紧杂交室螺钉并检查组装好的杂交室，确认没有杂交泄漏。在橡胶圈边界之外混合，每个气泡的高度约为 4 毫米。当杂交室垂直放在其末端时，旋转杂交室以检查这一点。

每个位置的所有气泡都在移动。如果有任何气泡卡住，请用力敲击腔室的工作台。然后将杂交室放入 65 摄氏度的旋转烘箱中 24 小时。

第二天，将杂交室浸入洗涤缓冲液 1 中，并使用一对塑料平边镊子将载玻片撬开。然后丢弃垫圈载玻片，将阵列载玻片放入机架中，浸没在新鲜的缓冲液 1 中。在大约 700 mL 的洗涤缓冲液中洗涤阵列玻片 1 至 5 分钟，同时用跳蚤和磁性 starr 剧烈搅拌。

然后将阵列玻片转移至约 700 mL 的洗涤缓冲液中，两次洗涤 90 秒，第二次洗涤结束时更剧烈地搅拌。轻轻地将阵列玻片从缓冲液中提起。它们应该是干燥的。

然后将阵列玻片与玻片保护器一起加载到扫描仪的玻片架中，然后扫描样品。根据阵列制造商的说明，杂交阵列上的每个探针都可视化为红色和绿色荧光染料的混合物。扫描仪量化每个探针的红色与绿色荧光信号的比率，相关软件根据它们的基因组位置将它们作为对数 2 比率进行分组。

得到的阵列轨迹允许解释被鉴定为基因组不平衡的区域。例如，在来自威廉姆斯综合征儿童的这条线索中，由七号染色体近端区域的低拷贝重复介导的复发性微缺失综合征，基因组失衡由软件用红线标识。prop 荧光对数比率应紧密聚集在 0 附近，表明基因组正常区域的绿色与红色比率为 1：1。

在此扫描中观察到的散落阵列痕迹可能导致异常区域的调用不准确，或无法识别基因组失衡，并且可能由多种因素引起，包括 DNA 质量差，或存在射线，大气球中的臭氧水平。观看本视频后，您应该对如何处理患者样本以进行 A CGH 检测以及生成高质量的数据用于下游分析和拷贝数变异检测有很好的了解。