阵列比较基因组杂交（CGH阵列），用于检测基因拷贝数变异的
2015年2月21日
阵列CGH为基因拷贝数变异的检测已经取代G-带状核型分析。本文介绍了技术及其在诊断服务实验室的应用。
该程序的总体目标是排列比较基因组杂交，以识别基因组中可能导致多种遗传疾病的不平衡。这是通过首先用荧光染料标记患者的 DNA 来实现的。在第二步中，将患者 DNA 和不同标记的参考 DNA 与阵列杂交。
接下来，扫描阵列以测量患者的数量，并参考每个探针的 DN 比比皆是。在最后一步中，对扫描图像进行处理，以识别基因组中患者 DNA 的物质多于或少于参考 DNA 最终阵列的区域。比较基因组杂交用于确定患者是否携带导致遗传综合征的拷贝数变异。
这种方法的视觉演示至关重要，因为阵列玻片的组装可能很困难，而且很容易杂交。混合从腔室中溢出的物质 在开始标记反应之前。在 4 摄氏度下解冻即用型 96 孔板的核苷酸和引物，并避光约一小时。
解冻后，在室温下再平衡覆盖的板 30 分钟，此时在 60 摄氏度下平衡 DNA 样品 15 分钟。当样品加热时，使用液体处理机器人将足够的无核酸酶水分配到新 96 孔板的每个孔中。然后，当 DNA 准备好时，将每孔 1 μg 样品转移到 96 孔板水中。
现在将 20 μL 的平衡核苷酸和引物转移到含有稀释 DNA 样品的每个板中，并用条带盖密封板，注意进行紧密密封。接下来，在带有加热盖的 PCR 机器中，在 99 摄氏度下使 DNA 变性 10 分钟，并将板在冰上快速冷却 5 分钟，使引物屈膝。然后使用液体处理机器人向每个样品中加入 10 μL 的清除 exo DNA 聚合酶。
用移液管混合样品，然后密封板并在 37 摄氏度下孵育 16 小时。第二天，用每孔 5 μL 终止缓冲液终止反应，然后去除未掺入的核苷酸。将每个孔的内容物转移到单独的预先标记的 2 ml 试管中。
将样品和 DNA 纯化离心柱以及适当的相关缓冲液加载到离心柱处理机器人中。根据制造商的说明，离心柱处理机器人将使用每管 250 微升高盐 DNA 结合缓冲液将标记的 DNA 结合到硅胶膜上，然后用 500 微升洗涤缓冲液洗涤两次从膜上去除杂质。然后，机器人将向膜中加入 15 μL 低盐溶液缓冲液，以回收约 12 μL 体积的纯化标记 DNA 样品，以杂交样品。
接下来，将杂交炉预热至 65 摄氏度，并预热背衬玻片和杂交室。为了制备杂交混合物，将 1.1 微升 cot 1D NA、4.95 微升制造商提供的封闭混合物和 24.75 微升杂交缓冲液混合。使用液体处理机器人将此混合物分配到新的 96 孔板的每个孔中，并预润湿每个吸头以提高转移准确性。
接下来吸取 9.35 微升适当的签名，三个标记的 DNA，然后移取 9.35 微升适当的签名，五个标记的 DNA。对于每个孔，密封板，将样品四次密封 1 分钟，然后快速旋转板以收集每个孔底部的内容物。在预杂交培养箱中使标记的 DNA 变性。
首先在 95 摄氏度下持续 3 分钟，然后在 37 摄氏度下持续 30 分钟。然后在 42 摄氏度的加热平台上工作。将背衬滑片放入杂交室中，确保垫圈的透明部分与杂交室的开窗部分对齐使用预湿吸头。
现在慢慢地将 42 μL 杂交混合物移液到阵列背衬玻片适当位置的中心。注意液体不要接触橡胶圈边界。一旦所有位置都填满，小心地将阵列载玻片放到背衬载玻片上，然后组装杂交室。
注意带有写入的阵列的一面朝向背衬玻片，然后完全拧紧杂交室螺钉并检查组装好的杂交室，确认没有杂交泄漏。在橡胶圈边界之外混合，每个气泡的高度约为 4 毫米。当杂交室垂直放在其末端时，旋转杂交室以检查这一点。
每个位置的所有气泡都在移动。如果有任何气泡卡住，请用力敲击腔室的工作台。然后将杂交室放入 65 摄氏度的旋转烘箱中 24 小时。
第二天，将杂交室浸入洗涤缓冲液 1 中，并使用一对塑料平边镊子将载玻片撬开。然后丢弃垫圈载玻片，将阵列载玻片放入机架中，浸没在新鲜的缓冲液 1 中。在大约 700 mL 的洗涤缓冲液中洗涤阵列玻片 1 至 5 分钟，同时用跳蚤和磁性 starr 剧烈搅拌。
然后将阵列玻片转移至约 700 mL 的洗涤缓冲液中，两次洗涤 90 秒，第二次洗涤结束时更剧烈地搅拌。轻轻地将阵列玻片从缓冲液中提起。它们应该是干燥的。
然后将阵列玻片与玻片保护器一起加载到扫描仪的玻片架中，然后扫描样品。根据阵列制造商的说明，杂交阵列上的每个探针都可视化为红色和绿色荧光染料的混合物。扫描仪量化每个探针的红色与绿色荧光信号的比率，相关软件根据它们的基因组位置将它们作为对数 2 比率进行分组。
得到的阵列轨迹允许解释被鉴定为基因组不平衡的区域。例如，在来自威廉姆斯综合征儿童的这条线索中，由七号染色体近端区域的低拷贝重复介导的复发性微缺失综合征，基因组失衡由软件用红线标识。prop 荧光对数比率应紧密聚集在 0 附近，表明基因组正常区域的绿色与红色比率为 1：1。
在此扫描中观察到的散落阵列痕迹可能导致异常区域的调用不准确，或无法识别基因组失衡，并且可能由多种因素引起，包括 DNA 质量差，或存在射线，大气球中的臭氧水平。观看本视频后，您应该对如何处理患者样本以进行 A CGH 检测以及生成高质量的数据用于下游分析和拷贝数变异检测有很好的了解。
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概览
本文讨论了阵列比较基因组杂交（aCGH）作为检测基因组拷贝数变异的一种方法，该方法在很大程度上取代了传统的G带染色体核型分析。该程序旨在识别可能导致各种遗传疾病的基因组不平衡。
关键研究组成部分
科学领域
- 基因组学
- 遗传诊断
- 比较基因组杂交
背景
- 阵列CGH是一种用于分析基因组变异的现代技术。
- 它提供了比传统方法更详细的基因组不平衡视图。
- 该技术对诊断遗传综合征至关重要。
- DNA的荧光标记是该过程中的一个关键步骤。
研究目的
- 识别患者基因组中的拷贝数变异。
- 提高遗传疾病的诊断准确性。
- 展示aCGH在临床实验室环境中的应用。
使用的方法
- 用荧光染料标记患者DNA。
- 将患者和参考DNA杂交到阵列上。
- 扫描阵列以测量DNA与探针的结合。
- 处理扫描图像以识别基因组不平衡区域。
主要结果
- 识别具有拷贝数变异的基因组区域。
- 展示aCGH在诊断遗传综合征方面的有效性。
- 将患者DNA与参考进行比较以检测不平衡。
- 在诊断环境中验证该方法的可靠性。
结论
- 阵列CGH是遗传诊断的强大工具。
- 该技术增强了对遗传疾病的理解。
- 它代表了相对于传统核型分析方法的重大进步。
常见问题
Executive Industry Relevance
Array CGH enables high-resolution detection of genomic copy number variants, supporting target validation in genetic disease research by providing quantitative, genome-wide imbalance data. This method enhances predictive confidence in preclinical models by identifying pathogenic variants linked to syndromes, informing mechanistic de-risking and portfolio prioritization in early discovery. Its clinical diagnostic utility translates to biomarker-aligned assay development for rare disease programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by detecting pathogenic copy number variants across the genome.
- Operational Value: Provides quantitative red-to-green fluorescence ratios for precise imbalance measurement per probe.
- Scientific Value: Supports biological de-risking through high-density oligonucleotide arrays targeting clinically relevant loci.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows via purified, labeled DNA hybridization.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through controlled washing, scanning, and log-two ratio analysis.
- Scientific Value: Enables reliable compound evaluation by detecting genomic imbalances that may confound phenotypic screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by identifying syndromes like Williams syndrome through recurrent microdeletion detection.
- Operational Value: Ensures translational continuity from discovery to preclinical validation via consistent reference DNA comparison.
- Scientific Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by validating genomic stability in model systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical research, where genomic integrity assessment informs lead identification and disease model suitability.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by identifying copy number alterations in disease-associated genes.
- Screening: Describes assay readiness through hybridization buffer preparation and probe-level signal quantification.
- Analytics: Highlights log-two ratio outputs that enable comparison of patient versus reference DNA across genomic positions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by validating genomic backgrounds in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Positions the method as a reusable capability for batch processing of patient or model system samples.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid labeling, hybridization, and fluorescence imaging.
- Needs microarray scanner, liquid handling robot, and hybridization oven infrastructure.
- Demands cross-team standardization for probe selection, washing protocols, and ratio threshold setting.
- Requires adaptation considerations for varying DNA input quality and sample types (blood, saliva, tissue).
- Practical limitations include sensitivity to DNA purity, ozone levels, and bubble formation during hybridization.
