一种基于阵列的比较基因组杂交平台, 有效检测快中子诱导的苜蓿蒺藜突变体的拷贝数变化

这种基于阵列的比较基因组杂交方案的总体目标是快速识别豆科植物 Medicago truncatula 的快速中子轰击诱导的突变体中的拷贝数变化。这种方法有助于回答豆类生物学领域的关键问题。例如，促进识别参与调节豆科植物根瘤发育的低位点的移情原。

该技术的主要优点是它在检测豆科植物 Medicago truncatula 的中子轰击突变体中的拷贝数变化（例如缺失突变）方面具有最高声誉和灵敏度。演示此程序的是我自己和遗传实验室的主持博士 Hongcheng Wang。将从单株植物收集的一克幼叶组织在液氮中快速冷冻。

然后，使用研钵和研杵，在液氮中将冷冻的叶组织研磨成细粉。使用 DNA 分离试剂盒从细粉中提取野生型和突变型基因组 DNA 样品。使用 500 μL 离心管用双蒸水稀释每种野生型和突变基因组 DNA 的 1 μg，最终体积为 20 μL。

然后，向离心管中加入 5 μL 随机引物。快速涡旋试管，快速离心后，将其放入热循环仪中 10 分钟，使 DNA 样品在 98 摄氏度下变性。10 分钟后，从热循环仪中取出试管，并立即将它们放在冰水中 5 分钟。

然后，准备两种标记混合物，并将 25 微升标记混合物分别作为 1 和 2 添加到野生型和突变型 DNA 管中。吸取 DNA 和标记混合物 3 次，然后短暂旋转试管。旋转后，将试管在热循环仪中于 37 摄氏度孵育 2 小时，然后在 65 摄氏度下孵育 20 分钟，以灭活 exo Klenow 酶。

然后，加入 430 μL One X TE 缓冲液，混合每管中的内容物。接下来，短暂旋转试管并将试管中的溶液转移到带有两毫升收集管的纯化柱中。将纯化柱以 14， 000 倍 G 离心 10 分钟，然后弃去流出物。

向每根色谱柱中加入 480 μL One X TE 缓冲液，然后再次以 14， 000 倍 G 离心 10 分钟。丢弃流出。将每种野生型和突变型标记的 DNA 从层析柱底部转移到新的离心管中。

用移液管测量每个标记 DNA 的体积后，用 One X TE 缓冲液将最终体积调节至 80 微升，然后在分光光度计中测量标记 DNA 的浓度。接下来，混合等体积的突变型和野生型 DNA，在微阵列芯片上与探针杂交，进行比较杂交。使用 One X TE 缓冲液将最终体积降至 160 μL。

接下来，准备杂交溶液并移液 3 次，使三种试剂与混合 DNA 充分混合。短暂旋转试管后，将它们在 98 摄氏度的热循环仪中孵育 10 分钟，然后在 37 摄氏度下孵育 20 分钟。请记住将温度设置为 67 摄氏度，以便在杂交前 4 小时预热杂交炉。

然后，在杂交室的底部放置一个垫圈滑块，并在热循环仪中于 37 摄氏度孵育 20 分钟后，将 490 微升杂交溶液加载到其上。为了形成杂交室，用 Medicago truncatula 基因组微阵列芯片盖住垫圈幻灯片，然后盖住杂交室并用夹具牢固地拧紧。将组装好的杂交室在 67 摄氏度的杂交炉中孵育 40 至 48 小时。

同时，用 250 毫升保存在室温下的 Washing Buffer One 准备两个载玻片洗涤皿。然后，用 Washing Buffer Two 保持在 37 摄氏度制作一个载玻片洗涤皿。然后，准备一个装有 70 毫升乙腈的载玻片洗涤罐和另一个装有 70 毫升稳定剂和拉丝溶液的载玻片洗涤罐。

将两个载玻片清洗罐放入室温下的通风橱中。孵育后，从杂交炉中取出杂交室，松开腔室夹以打开盖子。然后，去除垫圈载玻片中的微阵列芯片，并将它们放在装有 Wash Buffer One 的载玻片洗涤皿上。

微阵列芯片与盖玻片隔离。接下来，使用 Wash Buffer One 将微阵列芯片转移到第二个载玻片洗涤皿中。使用搅拌棒，在室温下轻轻搅拌磁力搅拌板上的溶液 5 分钟。

将微阵列芯片放在装有预热洗涤缓冲液 Two 的载玻片洗涤皿上，然后用搅拌棒搅拌，在 37 摄氏度下洗涤溶液 1 分钟。取出微阵列芯片，将其放入通风橱中装有载玻片洗涤罐的乙腈中，在通风橱中洗涤 30 秒。将微阵列芯片转移到装有稳定和干燥溶液的玻片洗涤罐中，然后再次洗涤 30 秒。

小心取出芯片，并在通风橱内干燥 1 分钟。使用扫描仪以两种微米的分辨率扫描微阵列芯片。使用信号映射软件作为界面来分析突变体与野生型信号在 8 条染色体上的归一化对数 2 比率的分布。

对于推定的缺失，考虑对数 2 比值等于或小于负 2 点 5 标准差。软件的分割分析表明，图中所示的 4 号染色体上估计有 22 kb 碱基缺失区。对微阵列探针两侧缺失边界的分析显示平均归一化对数 2 比率降低。

该图还显示了其他 6 个注释基因，包括包含缺失区域的 son 基因。Son 基因负责控制 Metecago truncatula 的结瘤。接下来，为确认缺失边界而进行的 PCR 扩增显示从 FN6191 突变体扩增的 1 点 5 kb 产物，但不是野生型。

进行 DNA 测序以显示黑色箭头所示的 FN6191 突变体中的缺失连接。还进行了测序，确认了缺失边界的位置。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 72 小时内完成。

为了获得高质量的数据，请记住在执行程序的房间内保持较低的臭氧浓度。按照此程序，可以执行其他措施，例如所有基因组测序的聚合酶链反应，以回答其他问题，例如基因组的大小和拷贝数变化。该技术的事件和验证为研究人员探索它们诱导的突变体拷贝数变异以及不适合插入诱变的植物物种（如 Garden P）中的自然变异铺平了道路。

预防措施，例如佩戴护眼装置、避免直接接触药剂和小心工作是绝对必要的。