Name: 微型硅悬臂梁的利用率，评估细胞收缩功能在体外 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: 了解利用微型硅悬臂梁评估体外肌肉细胞收缩功能的方法。该技术通过激光和光电探测器测量悬臂梁偏转，实现非侵入性实时监测肌管收缩力，适用于高通量药物筛选和肌肉生理学研究。

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本研究由美国国立卫生研究院资助，资助编号为 R01NS050452 和 R01EB009429。悬臂芯片的制备由康奈尔大学纳米加工设施的合作人员在外部完成。悬臂制备过程中使用的所有设备均位于该设施内。特别感谢 Mandy Esch 和 Jean-Matthieu Prot 在悬臂微加工方面的协助。悬臂功能的视频动画由中佛罗里达大学合成现实实验室的 Charles Hughes、Alex Zelenin 和 Eric Imperiale 制作。

1. 悬臂梁芯片的制备
所描述的制备步骤的图示细节如下所示 图1.
<ol>
	<li>将绝缘体上硅（SOI）晶圆放入烘箱中，在 125 °C 下烘烤 20 分钟以去除水分。</li>
	<li>使用等离子体增强化学气相沉积（PECVD）设备在脱水后的 SOI 晶圆的衬底层上沉积一层 1.5 µm 厚的二氧化硅层。</li>
	<li>将晶圆放置在匀胶机卡盘上，器件层朝上。确保晶圆居中，在晶圆中心滴加 2 ml P20 底层试剂，以 1,000 rpm/sec 的加速度在 3,000 rpm 下旋转 60 秒。P20 底层试剂可促进光刻胶在器件层上的附着。</li>
	<li>晶圆仍在匀胶机卡盘上时，在晶圆中心滴加 2 ml S1818 光刻胶，以 1,000 rpm/sec 的加速度在 3,000 rpm 下旋转 60 秒，形成一层 1.5 µm 厚的光刻胶层。</li>
	<li>将晶圆置于热板上，在 115 °C 下进行 1 分钟的前烘。</li>
	<li>使用光刻接触式掩模对准仪进行硬接触紫外曝光，将悬臂梁掩模的图形转移到器件层的光刻胶上。根据 S1818 光刻胶的曝光能量值 125 mJ/cm2 计算曝光时间。</li>
	<li>将晶圆浸入 726 MIF 光刻胶显影液中 1 分钟，并轻轻前后晃动晶圆以完成显影。</li>
	<li>用去离子水（DI）冲洗晶圆并干燥，建议使用旋转冲洗干燥机（SRD）设备。</li>
	<li>使用浸有丙酮的棉签去除晶圆边缘（距边缘 5 mm 范围内）的光刻胶。</li>
	<li>将晶圆装入深反应离子刻蚀（DRIE）设备中，光刻胶面朝上，运行刻蚀程序，将图案化的硅层贯穿器件层进行刻蚀。埋入的氧化层作为刻蚀停止层，因此应执行比预期所需多 50% 至 100% 的刻蚀循环，以确保完全刻蚀。</li>
	<li>将晶圆放入热的光刻胶去除液中浸泡 20 分钟以去除光刻胶。将晶圆转移至快速倾倒冲洗机（QDR）中用去离子水冲洗。完成光刻胶去除后，将晶圆装入 SRD 设备中进行冲洗和干燥。在显微镜下检查晶圆，确保悬臂梁图案符合预期。</li>
	<li>使用 PECVD 设备在晶圆的器件层上沉积一层 1 µm 厚的未掺杂二氧化硅层。该氧化层在后续加工步骤中作为悬臂梁的保护层。</li>
	<li>将晶圆放置在匀胶机卡盘上，衬底层朝上，开始处理晶圆背面。确保晶圆居中，在晶圆中心滴加 2 ml P20 底层试剂，以 1,000 rpm/sec 的加速度在 3,000 rpm 下旋转 60 秒。</li>
	<li>晶圆仍在匀胶机卡盘上时，在晶圆中心滴加 2 ml SPR220-4.5 光刻胶，以 1,000 rpm/sec 的加速度在 2,000 rpm 下旋转 45 秒，形成一层 6.5 µm 厚的光刻胶层。</li>
	<li>将晶圆置于接近式热板上，在 115 °C 下进行 2 分钟的前烘。</li>
	<li>使用具备正反面对准功能的光刻接触式对准仪，将背面窗口掩模与正面悬臂梁图案对准，并进行硬接触紫外曝光，将背面窗口掩模的图形转移到衬底层的光刻胶上。根据 SPR220-4.5 光刻胶的曝光能量值 480 mJ/cm2 计算曝光时间。</li>
	<li>紫外曝光后，将晶圆在暗处静置 30 分钟，再进行下一步处理。</li>
	<li>将晶圆浸入 726 MIF 光刻胶显影液中 2 分钟，并轻轻前后晃动晶圆以完成显影。</li>
	<li>用去离子水（DI）冲洗晶圆并干燥，建议使用旋转冲洗干燥机（SRD）设备。</li>
	<li>将晶圆置于 90 °C 的烘箱中保持 12 小时。</li>
	<li>使用含氟气体和氧化物刻蚀工艺的反应离子刻蚀（RIE）系统刻蚀晶圆背面的二氧化硅层。晶圆背面的图案化氧化层在后续加工中作为刻蚀掩模。在显微镜下检查晶圆，确保暴露窗口区域的二氧化硅已完全刻蚀。</li>
	<li>使用浸有丙酮的洁净室棉签去除晶圆边缘（距边缘 5 mm 范围内）的光刻胶。</li>
	<li>将晶圆装入 DRIE 设备中，运行刻蚀程序，将图案化的衬底层刻蚀至 500 µm 深度，以埋入的氧化层作为刻蚀停止层。将该刻蚀步骤分为多次运行，以防止晶圆过度加热，从而避免硅刻蚀不均匀。此刻蚀步骤将完全去除悬臂梁下方的硅材料。</li>
	<li>使用 25% 稀释的氢氟酸（HF）蚀刻液进行湿法刻蚀，去除悬臂梁下方的埋入氧化层以及悬臂梁上方的保护性氧化层。 
	注：此步骤释放硅悬臂梁的底面，并在下方打开窗口，以便激光探针可接触悬臂梁。</li>
	<li>使用一系列去离子水浴冲洗晶圆，并用氮气小心干燥。由于悬臂梁仅在其基部受到支撑，切勿对悬臂梁直接使用强力的去离子水或惰性气体喷射。</li>
	<li>沿衬底层刻蚀步骤中形成的切割线将单个芯片从晶圆上分离。</li>
</ol>
2. 细胞培养
<ol>
	<li>根据已发表的方法制备13F盖玻片17. 
	注意：如果无法获得13F盖玻片，可使用任何接触角高于 95° 可以使用。</li>
	<li>将悬臂梁芯片和13F盖玻片置于70%乙醇溶液中灭菌，并在超净工作台中自然晾干。</li>
	<li>将单个悬臂梁芯片放置于标准12孔板内13F盖玻片的上方。</li>
	<li>根据标准细胞培养方案，使用针对所用细胞类型优化的生物聚合物或表面修饰材料对悬臂梁进行包被。</li>
	<li>用特定的生长培养基将细胞重悬至所需浓度。 
	注意：本方案会导致大量细胞穿过悬臂梁窗口，无法附着于目标悬臂梁表面。因此，细胞悬液的浓度应比标准盖玻片培养所需浓度高3-4倍。例如，大鼠骨骼肌卫星细胞的接种密度通常为每平方毫米500至700个细胞15,16，并与悬臂基底一起在每平方毫米2,000个细胞的密度下使用。对于新的细胞来源，应进行优化实验以确定合适的接种密度。</li>
	<li>移液器 200 μl 将细胞悬液加至悬臂梁芯片表面，确保培养基气泡完全覆盖悬臂梁窗口。若培养基渗过窗口且未能在悬臂梁上方形成稳定的气泡，则更换13F盖玻片并重新进行接种。</li>
	<li>将含有芯片的培养板转移至培养箱中，使细胞贴壁至少1小时（建议2-3小时）。</li>
	<li>孵育结束后，使用无菌镊子将芯片转移至一个无13F盖玻片的洁净孔中，并加入1 ml培养基补满培养液。</li>
	<li>将培养板放回培养箱。</li>
	<li>根据细胞的标准操作流程进行培养 体外 在盖玻片上进行培养。对于骨骼肌细胞，当细胞达到汇合状态后，需更换培养基成分以诱导肌管形成。</li>
</ol>
3. 悬臂梁偏转分析的硬件与软件设置
<ol>
	<li>将加热的培养皿放入直立式电生理显微镜的载物台上。</li>
	<li>向加热的显微镜载物台中加入 3 ml 细胞当前悬浮所用的培养基（含 10 mM HEPES）。</li>
	<li>将不锈钢电极安装在加热培养皿内侧，电极间距为 15 mm，并将其连接至脉冲发生器；该脉冲发生器应能够产生强度、频率和波形可调的电场刺激脉冲，以便在适当条件下对细胞施加电场刺激。</li>
	<li>将安装在 XY 平移平台上的氦氖激光器固定在显微镜台下方，并调节其位置，使激光束以相对于悬臂平面 30° 的角度穿过加热培养皿的底部。</li>
	<li>将安装在 XY 平移平台上的四象限光电探测器模块固定在显微镜载物台下方，并调节其位置，使反射的激光束准确落在四个象限的中心。图 2 展示了实施本方案所需硬件设置的概览。</li>
	<li>编写软件程序以控制扫描悬臂的线性驱动器。编写该软件程序时应参考 图 3 所示的流程图。本系统所用的图形化界面如 图 4 所示。</li>
</ol>
4. 记录悬臂梁偏转数据
<ol>
	<li>打开悬臂梁分析硬件及相关软件。</li>
	<li>将加热台热敏电阻插入培养基中，并等待其读数达到 37 °C。</li>
	<li>将悬臂梁芯片插入载台，使悬臂梁朝向载台的右侧。</li>
	<li>打开显微镜光源。</li>
	<li>调节显微镜焦距，使悬臂梁边缘清晰可见，并使用激光/光电探测器控制软件将激光束定位在悬臂梁 1 的尖端。注意：假设悬臂梁朝向载台右侧，则悬臂梁 1 位于阵列的左上角，编号从左上至左下依次为 1 至 16；悬臂梁 17 位于右上角，编号至右下角的 32（图 5A）。</li>
	<li>在记录软件中点击“播放”。</li>
	<li>通过调节控制光电探测器的步进电机，调整光电探测器位置，使信号在 x 和 y 方向上均显示为“0”。</li>
	<li>在激光/光电探测器控制软件中设置悬臂梁 1 的位置（图 4）。</li>
	<li>将激光移至悬臂梁 16 的尖端，重复步骤 4.7，并在激光/光电探测器控制软件中设置悬臂梁 16 的位置。</li>
	<li>将激光移至悬臂梁 32 的尖端，重复步骤 4.7，并在激光/光电探测器控制软件中设置悬臂梁 32 的位置。</li>
	<li>将激光移至悬臂梁 17 的尖端，重复步骤 4.7，并在激光/光电探测器控制软件中设置悬臂梁 17 的位置。</li>
	<li>关闭显微镜光源及实验室的顶灯。</li>
	<li>在记录软件中点击“记录”。</li>
	<li>将脉冲发生器硬件设置为 40 毫秒、5 V 的脉冲，频率为 1 Hz，并开启设备。 
	注意：可选择在此处采用针对特定细胞来源优化的刺激方案；此处所述参数是基于使用人源和啮齿类细胞来源所收集数据的参考设置12,13,15,16。</li>
	<li>使用激光/光电探测器控制软件，设置硬件对 32 个悬臂梁组成的阵列进行扫描，每个悬臂梁停留 5 秒。</li>
	<li>当完成对 32 个悬臂梁的扫描后，关闭刺激器，停止记录软件，并调出数据文件。</li>
	<li>检查每个悬臂梁记录的轨迹，寻找收缩活动的证据。记录所有产生阳性反应的悬臂梁。若偏转幅度比基线高出至少 0.1 V，则定义为一次收缩峰。</li>
	<li>在激光/光电探测器控制软件中，从扫描程序中移除所有无响应的悬臂梁。</li>
	<li>随后可对有活性的悬臂梁在无刺激条件下重新扫描，以获取细胞自发性收缩活动的读数。</li>
	<li>在向培养基中添加治疗性化合物后，可进行有或无广域电刺激的扫描，以观察该化合物对培养细胞功能输出的影响。</li>
	<li>通过长时间电刺激细胞并扫描收缩力水平，进行疲劳评估，测量峰值力下降至特定阈值以下所需的时间。</li>
	<li>在运动神经元与肌肉共培养的实验中，可通过向运动神经元-肌管悬臂梁共培养体系施加神经刺激剂（如谷氨酸）或突触抑制剂（例如，D-筒箭毒碱），分别扫描自发活动的增加或减少，从而评估神经肌肉接头的形成情况16。</li>
	<li>根据计划实验的具体需求，执行特定的扫描程序。</li>
</ol>
5. 悬臂梁偏转数据的分析
<ol>
	<li>使用修正的Stoney方程15（如下所述）将原始悬臂梁偏转数据（单位：伏特）转换为细胞层或肌管产生的应力读数（单位：帕斯卡），以及细胞收缩力的直接测量值（单位：纳牛顿）： 
	<img alt="科学公式显示的复杂光学公式 δ=2L/3 tan(θ/2)。" fo:content-width="3in" width="400" src="/files/ftp_upload/51866/51866eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="公式 1"> 公式 1 
	<img alt="静态平衡方程，σc = (Esi tsi³ / 6tf (1-vsi)(tf+tsi)) (3δ / 2L²)，应力分析方程。" fo:content-width="2in" width="300" src="/files/ftp_upload/51866/51866eq2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="公式 2"> 公式 2</li>
	<li>其中 δ = 悬臂梁尖端偏转量及肌管产生的应力，σc = 肌管产生的应力（假设为与悬臂梁等宽的均匀厚膜），Cdetector = 将电压与光电探测器上激光位置相关联的系统特异性系数，θ = 激光与探测器相对于悬臂梁平面的角度，ESi = 硅的弹性模量，tSi = 悬臂梁的厚度，tf= 肌管厚度，vSi = 硅的泊松比，L = 悬臂梁长度，P = 激光从悬臂梁尖端到探测器的光路长度，wSi = 悬臂梁的宽度。这些方程中所用术语的示意图见图6。</li>
	<li>假设肌管为均匀薄膜，则肌管内的力等于薄膜中的力，通过将应力计算出的力与应用Stoney方程时所假设的细胞横截面积相等，可得公式3。 
	<img alt="碳纳米管受力计算公式：F&lt;sub&gt;myotube&lt;/sub&gt; = σ&lt;sub&gt;c&lt;/sub&gt; × t&lt;sub&gt;f&lt;/sub&gt; × W&lt;sub&gt;si&lt;/sub&gt;。" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/51866/51866eq3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="公式 3"> 公式 3</li>
	<li>在完成功能数据采集后，采用标准技术对悬臂梁芯片进行固定，用于免疫细胞化学分析，或收集细胞用于蛋白质或DNA分析。</li>
	<li>可选地，不进行分子分析前处理，而是将细胞重新放回培养箱，以便在后续时间点重新评估其功能表现。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

分析微尺度悬臂梁以检测细胞收缩的关键步骤，是将悬臂梁芯片准确放置于显微镜载物台上，并对准激光束与光电探测器与阵列中角落悬臂梁尖端的位置。如果该操作不够精确，软件将无法推算阵列中其余悬臂梁的位置，可能导致数据采集过程中出现大量假阴性结果。操作人员在校准激光位置前，应确保悬臂梁芯片与培养皿底部完全贴合。若芯片在培养皿中倾斜放置，将改变偏转激光束的路径，干扰数据采集。
必须使用功能正常的气浮台，以在数据采集期间消除背景振动。本研究中所用悬臂梁的厚度较小（约 4 µm），对收缩活动具有高灵敏度，但副作用是增强了对振动的敏感性。操作人员在记录数据期间应尽量减少在设备周围的移动，以降低背景信号干扰。最后，在将悬臂梁芯片放置于载物台时，需注意确保芯片不与培养孔中的刺激银电极接触。若电极接触芯片并施加全场刺激，将改变电流路径，从而对系统有效刺激培养细胞的能力产生负面影响。
为了更准确地测量骨骼肌成肌细胞的力输出，强烈建议在完成功能分析后对培养的细胞进行免疫染色。所列出的公式需要输入成肌细胞的横截面积（CSA）以计算力。虽然可以根据先前的数据使...

几十年来，已能够实现人类和啮齿类动物来源的肌肉细胞的体外培养1,2。然而，尽管标准的盖玻片培养方法适用于生化分析，却无法有效评估细胞的主要功能输出（即收缩能力），因此在评估细胞成熟度和功能表现方面具有一定的局限性。为了最大限度地获取此类体外培养体系中的数据，有必要推进能够以特定构型培养这些细胞并实现实时功能评估的系统开发。多种三维肌肉模型的建立已在一定程度上满足了这一需求，此类系统已在多项研究中被用于评估培养肌肉细胞的体外收缩能力3-5。尽管这些系统在组织建模与重建研究中具有重要价值，但在单细胞反应研究中的适用性仍受限。在必须开展单根肌纤维研究的情况下，目前仍只能依赖复杂且劳动密集型的离体方法6-10。此外，当前药物开发与筛选方案正朝着构建复杂的多器官平台方向发展，这要求建立具有非侵入性、易于扩展，并能与支持性细胞及组织模型便捷整合的系统11。
微尺度悬臂梁为评估单个细胞或少量细胞群体的功能性收缩能力提供了一种简便的方法12,13。该技术基于改进的原子力显微镜（AFM）技术14，利用激光和光电探测系统测量微尺度悬臂梁在培养的肌管收缩活动作用下的偏转。随后采用改进的Stoney方程计算肌管产生的应力及其引起基底偏转所施加的力15。已开发出一种扫描程序，可实现对多重悬臂梁阵列的同步评估，为药物毒性/有效性研究提供中等到高通量的应用潜力15,16。此类技术在开发功能性、临床前药物疗效预测体外检测方法方面可能具有重要价值。此外，硅基悬臂梁芯片的制备不会影响后续对细胞进行免疫染色、蛋白质印迹和PCR等常规生物分子检测的处理。
本文提供了微米级硅悬臂梁的制备与加工、硬件与软件系统的搭建，以及用于评估培养于这些芯片上收缩性细胞功能的操作指南的详细说明。该系统可采用标准细胞培养技术进行细胞的接种与日常维护，因此，只要具备可靠的培养参数，任何类型的收缩性细胞均可轻松整合至该装置中。本系统所采用的相对简单的二维培养参数，使得其他细胞模型的整合或可与肌肉相互作用的细胞类型（如支配性神经元）的引入变得直接可行，从而显著提升了该模型在构建更复杂功能性组织中的适用性 体外 哺乳动物系统的检测方法与多器官模型

<table><tbody><tr><td>大鼠原代肌肉生长培养基</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27（50倍浓缩液）</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>1倍</td></tr><tr><td>Glutamax（100倍浓缩液）</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td>1倍</td></tr><tr><td>G5 添加剂</td><td>Life Technologies</td><td>17503-012</td><td>1倍</td></tr><tr><td>胶质细胞源性神经营养因子</td><td>Cell sciences</td><td>CRG400B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>脑源性神经营养因子</td><td>Cell sciences</td><td>CRB600B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>睫状神经营养因子</td><td>Cell sciences</td><td>CRC400A</td><td>40 ng/ml</td></tr><tr><td>神经营养素-3</td><td>Cell sciences</td><td>CRN500B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>神经营养素-4</td><td>Cell sciences</td><td>CRN501B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>酸性成纤维细胞生长因子</td><td>Life Technologies</td><td>13241-013&amp;nbsp;</td><td>25 ng/ml</td></tr><tr><td>心肌营养素-1</td><td>Cell sciences</td><td>CRC700B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>硫酸肝素</td><td>Sigma</td><td>D9809&amp;nbsp;</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>白血病抑制因子</td><td>Sigma</td><td>L5158&amp;nbsp;</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>玻璃粘连蛋白</td><td>Sigma</td><td>V0132</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>大鼠原代肌肉分化培养基</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NB Activ 4</td><td>Brain Bits LLC</td><td>NB4-500</td><td></td></tr><tr><td>设备</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>II 类红色二极管激光器</td><td>Newport</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光电探测器</td><td>Noah Industries</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Model 2100 脉冲刺激器</td><td>A-M systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiclamp 700B 数字转换器</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>膜片钳显微镜及载物台</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Delta T4 培养皿温控系统</td><td>Bioptechs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axoscope 软件</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW 软件</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&lt;sup&gt; o&lt;/sup&gt;C, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>NAPCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>II 类微生物操作台</td><td>Labconco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器及吸头</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用微尺度硅悬臂梁评估细胞收缩功能 体外

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

更具预测性和生物学相关性的开发 体外 检测方法的建立依赖于多功能细胞培养系统的进步，这些系统有助于对种植细胞的功能进行评估。为此，微尺度悬臂梁技术提供了一个平台，可通过测量细胞收缩引起的基底弯曲，来评估包括骨骼肌、心肌和平滑肌细胞在内的多种细胞类型的收缩功能。多路复用悬臂梁阵列的应用为建立中高通量的实验方案提供了可能，可用于评估药物疗效与毒性、疾病表型及其进展，以及神经肌肉和其他细胞间相互作用。本文详细介绍了为此目的制备可靠悬臂梁阵列的工艺，以及在这些表面成功培养细胞所需的方法。此外，还进一步描述了利用一种新型激光与光电探测系统对维持在该阵列上的收缩型细胞进行功能分析所必需的操作步骤。所提供的代表性数据突显了该系统在收缩功能分析方面所具备的高精度与可重复性，以及该技术可广泛应用于多种研究领域。该系统的成功广泛应用有望为研究人员提供一种快速、低成本的功能研究手段。 体外 从而实现对组织功能、疾病发展以及对新型治疗手段反应的更准确预测。

在悬臂梁上成功培养具有收缩功能的细胞是一种相对简单的过程，可利用标准的细胞培养技术完成（图5）。支持细胞收缩的悬臂梁比例会因所研究的细胞类型及所采用的具体培养技术而异。使用来自大鼠后肢的原代胚胎细胞时，在检测的悬臂梁中有12%可观察到收缩活动（n = 4）。利用文中所述的激光与光电探测器系统对收缩功能进行分析，可获得与接种细胞功能成熟度相关的准确实时数据。随后可使用标准的电生理学软件对原始数据进行分析，便于计算诸如峰值力、达到峰值力的时间以及半松弛时间等关键功能参数，如图7所示。对经治疗性化合物处理的培养细胞进行后续数据采集，可比较加药与未加药条件下的功能特性，从而评估化合物的活性，并进一步预测其体内反应。此外，通过延长刺激方案，还可评估培养细胞的疲劳速率，从而拓展本系统所能获取的生理学数据范围（图8）。
悬臂培养系统可经改良，以在含有骨骼肌肌管的培养体系中引入运动神经元16，以便评估神经肌肉突触的形成 体外 (<stron...

本方案描述了使用微尺度硅悬臂梁作为可变形培养表面，用于测量肌细胞收缩力的方法。 体外细胞收缩引起悬臂弯曲，该弯曲可被测量、记录并转换为力的读数，从而提供一种用于测量收缩功能的非侵入性且可扩展的系统 体外

更具有预测性和生物学相关性的体外检测方法的开发，依赖于多功能细胞培养系统的进步，这些系统能够……

以下实验的目的是在受控的体外环境中，通过刺激来测量培养的肌纤维的收缩活性。该目标通过将解离的肌细胞接种于微尺度硅悬臂梁上，并诱导这些单核细胞融合形成称为肌管的纤维来实现。随后，将承载已分化肌细胞的悬臂梁芯片转移至经过改造的电生理显微镜系统中，该系统配备激光器和光电探测器，用于在芯片安装至装置后，测量肌肉收缩引起的悬臂梁偏转。激光的位置应调整至聚焦在悬臂梁的尖端，同时对准光电探测器，使其能够接收到偏转的光束。由此获得的结果可显示悬臂梁的偏转程度，该偏转由细胞在电刺激或化学处理下的肌肉收缩引起，从而实时直接测量接种细胞的收缩特性。最终，悬臂梁的位移可进一步处理，以输出力的读数。该系统具备多重检测能力，可为评估药物处理、疾病状态或运动方案引起的收缩功能变化提供潜在的高通量测试平台。与现有的膜片钳电生理学等方法相比，该技术的主要优势在于，这种功能分析方法具有非侵入性，且易于适应高通量研究。该方法有助于回答药物开发领域中的关键问题，例如在临床评估前确定合适的剂量-反应浓度。该技术的应用前景广泛，可拓展至多种肌肉疾病的治疗，因为它能够在实时条件下研究不同病理表型细胞的功能表现。此外，该方法可为骨骼肌病理机制提供深入见解。该方法也可用于其他组织系统，如心肌和平滑肌。将已灭菌的预处理悬臂芯片和13 F盖玻片置于70%乙醇溶液中，然后在通风橱中自然晾干。随后将单个悬臂芯片放置在13 F盖玻片上。在标准的12孔板内，用适合所用细胞类型的生物聚合物或表面修饰剂对悬臂进行包被。根据标准细胞培养方案，采用我们的制备方法表面包被需30分钟，但可根据研究者特定的培养方案进行调整。将细胞在特定的生长培养基中培养至所需浓度后，取100 µL细胞悬液加入悬臂梁芯片表面，确保培养基气泡完全覆盖悬臂梁窗口。将含有芯片的培养板转移至培养箱中，使细胞贴壁至少一小时。使用无菌镊子将芯片转移至不含13 F盖玻片的洁净孔中，并向每孔加入1 mL生长培养基。将培养板放回培养箱，根据标准体外培养方案维持细胞生长。在盖玻片上，将预热的培养皿置于直立式电生理显微镜的载物台上。向预热的显微镜中加入三毫升当前使用的细胞培养液。 将不锈钢电极安装在加热培养皿内部，电极间距为15毫米。将电极连接至脉冲发生器，该发生器应能够产生电场刺激，输出强度、频率和波形可调的脉冲，以便系统在适当时对细胞施加电场刺激。将安装在XY平移平台上的氦氖激光器固定在显微镜载物台的下方。然后调节激光器，使激光束以相对于悬臂平面30度的角度穿过加热培养皿的底部。接着，将安装在XY平移台上的四象限光电探测模块固定在显微镜载物台的下方。调节其位置，使反射的激光束落在四个象限的中心。编写一个软件程序，根据文本方案中提供的流程图，控制线性执行器在悬臂梁上进行扫描。打开悬臂梁分析硬件及其相关软件。将加热台 ther mrta 插入培养基中，并等待其温度达到 37 摄氏度。接下来，将悬臂芯片插入载物台，使悬臂朝向载物台的右侧。打开显微镜光源。调节显微镜焦距，使悬臂边缘清晰可见，并使用激光光电探测器控制软件将激光束对准第一个悬臂的尖端，假设悬臂朝向载物台右侧。其中一个位于阵列的左上角，编号向下延伸至16，位于左下角。悬臂17位于右上角位置，并延伸至32。在右下角点击录制软件的播放按钮。通过调节控制光电探测器的步进电机，使光电探测器的位置在 x 和 y 两个方向上的信号读数均为零。然后在激光光电探测器控制软件中将悬臂梁设置到第一个位置。接下来，将激光移动到悬臂16的尖端。重复光电探测器的定位，并在激光光电探测器控制软件中设置悬臂16的位置。现在将激光移动到悬臂32的尖端。重复调整光电探测器的位置，并在激光光电探测器控制软件中设置悬臂梁32的位置。最后，将激光移至悬臂梁17的尖端。重复调整光电探测器的位置，并在激光光电探测器控制软件中设置悬臂梁17的位置。关闭显微镜光源，然后关闭实验室的顶灯。启动记录软件的记录功能。将脉冲发生器硬件设置为40毫秒、5伏脉冲，频率为1赫兹。然后打开仪器，使用激光光电探测器控制软件，设置硬件以扫描全部32个悬臂梁阵列，每个悬臂梁停留5秒。完成对32个悬臂梁的扫描后，关闭刺激器。然后停止录制软件并打开数据文件。检查每个悬臂梁记录的轨迹，以寻找收缩活动的证据。收缩定义为一个峰。如果偏转幅度比基线高出至少0.1伏特，则记录每个产生阳性反应的悬臂。从激光光电探测器控制软件的扫描程序中移除所有无反应的悬臂。随后可在无刺激条件下重新扫描有活性的悬臂，以获取细胞自发收缩活性的读数。接下来，向培养基中加入治疗性化合物，以观察其对培养细胞功能输出的影响。加入化合物后，进行有或无广域电刺激的扫描，并通过长时间电刺激细胞以进行疲劳评估，随后扫描收缩力水平，测量峰值力下降至特定阈值以下所需的时间。在运动神经元与肌肉共同培养的实验中，通过使用神经刺激剂或突触抑制剂处理运动神经元-肌管悬臂共培养体系，并监测自发活动的增强或减弱，以评估神经肌肉接头的形成情况，随后按照文本方案中详述的方法分析悬臂偏转数据。将具有收缩功能的细胞成功培养于悬臂上，是一项利用标准细胞培养技术即可实现的相对简单的过程。可使用标准的电生理学软件分析原始数据，从而便于计算相关功能参数，如峰值力、达峰时间以及半松弛时间。延长刺激方案可用于评估培养细胞的疲劳速率，从而拓展从此系统中可获得的生理学数据的层次。悬臂培养系统可进行改进，将运动神经元与骨骼肌肌管共同培养，以实现在体外评估神经肌肉突触的形成。在此类培养中，可比较自发收缩活动的频率与经神经元特异性刺激剂（如谷氨酸）处理后收缩反应的频率。任何观察到的谷氨酸诱导的收缩频率增加，均表明培养的神经元被激活，从而导致乙酰胆碱释放及随后的肌管激活。使用突触抑制剂（如乙酰胆碱受体阻断剂 dtu rine）处理后，谷氨酸诱导的活动停止，进一步证明这些培养物中存在功能性的神经肌肉突触。观看本视频后，您应能充分理解如何利用微尺度硅悬臂梁评估培养骨骼肌的功能特性。

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利用微吸管对贴壁细胞进行吸吮以评估细胞刚性

本视频介绍了利用细胞电极基底阻抗传感技术（ECIS）测量主动脉平滑肌细胞（SMC）收缩的方法。ECIS可检测细胞的运动，是测量细胞收缩的可靠方法。...

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本研究开发了一种新型成像方案，采用定制的电机驱动机械执行器，可实现对活细胞在机械应变下的实时响应进行测量。该系统适用于力学生物学研究，能够施加高达20%的应变，同时支持使用共聚焦显微镜或原子力显微镜进行近实时成像。...

活细胞成像在机械拉伸过程中的应用

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一种的开发 体外 评估经历上皮-间充质转化的间充质细胞收缩功能的实验方法

机械力在调控细胞迁移过程中起着重要作用。本实验方案展示了如何使用可变形的弹性水凝胶，通过玻璃微移液管和显微操作器施加局部刚度梯度，从而刺激细胞并诱导其结构和迁移行为的改变。...

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使用微图案化弹性体进行单细胞收缩力的简化高通量分析

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