利用微尺度硅悬臂梁评估细胞收缩功能 体外

以下实验的目的是在受控的体外环境中，通过刺激来测量培养的肌纤维的收缩活性。该目标通过将解离的肌细胞接种于微尺度硅悬臂梁上，并诱导这些单核细胞融合形成称为肌管的纤维来实现。随后，将承载已分化肌细胞的悬臂梁芯片转移至经过改造的电生理显微镜系统中，该系统配备激光器和光电探测器，用于在芯片安装至装置后，测量肌肉收缩引起的悬臂梁偏转。

激光的位置应调整至聚焦在悬臂梁的尖端，同时对准光电探测器，使其能够接收到偏转的光束。由此获得的结果可显示悬臂梁的偏转程度，该偏转由细胞在电刺激或化学处理下的肌肉收缩引起，从而实时直接测量接种细胞的收缩特性。最终，悬臂梁的位移可进一步处理，以输出力的读数。该系统具备多重检测能力，可为评估药物处理、疾病状态或运动方案引起的收缩功能变化提供潜在的高通量测试平台。

与现有的膜片钳电生理学等方法相比，该技术的主要优势在于，这种功能分析方法具有非侵入性，且易于适应高通量研究。该方法有助于回答药物开发领域中的关键问题，例如在临床评估前确定合适的剂量-反应浓度。该技术的应用前景广泛，可拓展至多种肌肉疾病的治疗，因为它能够在实时条件下研究不同病理表型细胞的功能表现。此外，该方法可为骨骼肌病理机制提供深入见解。

该方法也可用于其他组织系统，如心肌和平滑肌。将已灭菌的预处理悬臂芯片和13 F盖玻片置于70%乙醇溶液中，然后在通风橱中自然晾干。随后将单个悬臂芯片放置在13 F盖玻片上。在标准的12孔板内，用适合所用细胞类型的生物聚合物或表面修饰剂对悬臂进行包被。根据标准细胞培养方案，采用我们的制备方法表面包被需30分钟，但可根据研究者特定的培养方案进行调整。

将细胞在特定的生长培养基中培养至所需浓度后，取100 µL细胞悬液加入悬臂梁芯片表面，确保培养基气泡完全覆盖悬臂梁窗口。将含有芯片的培养板转移至培养箱中，使细胞贴壁至少一小时。使用无菌镊子将芯片转移至不含13 F盖玻片的洁净孔中，并向每孔加入1 mL生长培养基。

将培养板放回培养箱，根据标准体外培养方案维持细胞生长。在盖玻片上，将预热的培养皿置于直立式电生理显微镜的载物台上。向预热的显微镜中加入三毫升当前使用的细胞培养液。

将不锈钢电极安装在加热培养皿内部，电极间距为15毫米。将电极连接至脉冲发生器，该发生器应能够产生电场刺激，输出强度、频率和波形可调的脉冲，以便系统在适当时对细胞施加电场刺激。将安装在XY平移平台上的氦氖激光器固定在显微镜载物台的下方。

然后调节激光器，使激光束以相对于悬臂平面30度的角度穿过加热培养皿的底部。接着，将安装在XY平移台上的四象限光电探测模块固定在显微镜载物台的下方。调节其位置，使反射的激光束落在四个象限的中心。

编写一个软件程序，根据文本方案中提供的流程图，控制线性执行器在悬臂梁上进行扫描。打开悬臂梁分析硬件及其相关软件。将加热台 ther mrta 插入培养基中，并等待其温度达到 37 摄氏度。

接下来，将悬臂芯片插入载物台，使悬臂朝向载物台的右侧。打开显微镜光源。调节显微镜焦距，使悬臂边缘清晰可见，并使用激光光电探测器控制软件将激光束对准第一个悬臂的尖端，假设悬臂朝向载物台右侧。

其中一个位于阵列的左上角，编号向下延伸至16，位于左下角。悬臂17位于右上角位置，并延伸至32。

在右下角点击录制软件的播放按钮。通过调节控制光电探测器的步进电机，使光电探测器的位置在 x 和 y 两个方向上的信号读数均为零。然后在激光光电探测器控制软件中将悬臂梁设置到第一个位置。

接下来，将激光移动到悬臂16的尖端。重复光电探测器的定位，并在激光光电探测器控制软件中设置悬臂16的位置。现在将激光移动到悬臂32的尖端。

重复调整光电探测器的位置，并在激光光电探测器控制软件中设置悬臂梁32的位置。最后，将激光移至悬臂梁17的尖端。重复调整光电探测器的位置，并在激光光电探测器控制软件中设置悬臂梁17的位置。

关闭显微镜光源，然后关闭实验室的顶灯。启动记录软件的记录功能。将脉冲发生器硬件设置为40毫秒、5伏脉冲，频率为1赫兹。

然后打开仪器，使用激光光电探测器控制软件，设置硬件以扫描全部32个悬臂梁阵列，每个悬臂梁停留5秒。完成对32个悬臂梁的扫描后，关闭刺激器。

然后停止录制软件并打开数据文件。检查每个悬臂梁记录的轨迹，以寻找收缩活动的证据。

收缩定义为一个峰。如果偏转幅度比基线高出至少0.1伏特，则记录每个产生阳性反应的悬臂。从激光光电探测器控制软件的扫描程序中移除所有无反应的悬臂。

随后可在无刺激条件下重新扫描有活性的悬臂，以获取细胞自发收缩活性的读数。接下来，向培养基中加入治疗性化合物，以观察其对培养细胞功能输出的影响。加入化合物后，进行有或无广域电刺激的扫描，并通过长时间电刺激细胞以进行疲劳评估，随后扫描收缩力水平，测量峰值力下降至特定阈值以下所需的时间。

在运动神经元与肌肉共同培养的实验中，通过使用神经刺激剂或突触抑制剂处理运动神经元-肌管悬臂共培养体系，并监测自发活动的增强或减弱，以评估神经肌肉接头的形成情况，随后按照文本方案中详述的方法分析悬臂偏转数据。将具有收缩功能的细胞成功培养于悬臂上，是一项利用标准细胞培养技术即可实现的相对简单的过程。可使用标准的电生理学软件分析原始数据，从而便于计算相关功能参数，如峰值力、达峰时间以及半松弛时间。

延长刺激方案可用于评估培养细胞的疲劳速率，从而拓展从此系统中可获得的生理学数据的层次。悬臂培养系统可进行改进，将运动神经元与骨骼肌肌管共同培养，以实现在体外评估神经肌肉突触的形成。在此类培养中，可比较自发收缩活动的频率与经神经元特异性刺激剂（如谷氨酸）处理后收缩反应的频率。

任何观察到的谷氨酸诱导的收缩频率增加，均表明培养的神经元被激活，从而导致乙酰胆碱释放及随后的肌管激活。使用突触抑制剂（如乙酰胆碱受体阻断剂 dtu rine）处理后，谷氨酸诱导的活动停止，进一步证明这些培养物中存在功能性的神经肌肉突触。观看本视频后，您应能充分理解如何利用微尺度硅悬臂梁评估培养骨骼肌的功能特性。