微型硅悬臂梁的利用率，评估细胞收缩功能在体外

以下实验的目的是在受控的体外环境中测量培养的肌纤维对刺激的收缩活性。这是通过将解离的肌肉细胞接种在微型硅悬臂上，并诱导这些单核细胞融合形成称为肌管的纤维来实现的。然后将这些支持分化肌肉细胞的悬臂芯片转移到电生理显微镜中，该显微镜经过修改以支持激光和光电探测器，用于测量将芯片放入钻机后响应肌肉收缩的悬臂偏转。

激光的位置使其聚焦在悬臂的尖端，而光电探测器同样对齐，以便捕捉到偏转的光束 获得显示悬臂偏转程度的结果，这是由响应电或化学处理的肌肉收缩引起的，提供实时接种细胞收缩曲线的直接测量。最终，可以处理悬臂位移以提供力的读数。该系统是多路复用的，提供了一个潜在的高通量测试台，用于评估响应药物治疗、疾病、状态或运动方案的收缩功能变化。

与膜片钳电生理学等现有方法相比，该技术的主要优点是这种功能分析方法是无创的，并且易于适应高通量研究。这种方法可以帮助回答药物开发领域的关键问题，例如在临床评估之前确定适当的剂量反应浓度。这项技术的影响延伸到多种肌肉疾病的治疗，因为它提供了实时研究来自不同病理表型的细胞功能表现的方法，但是，这种方法可以提供对骨骼肌病理的见解。

它也可用于其他组织系统，例如心脏和平滑肌消毒，预先准备好的悬臂芯片和 13 F 盖玻片在 70% 乙醇溶液中，并允许在流动罩中风干。然后将单个悬臂芯片放在 13 F 盖玻片的顶部。在标准的 12 孔板内，用针对所用细胞类型优化的生物聚合物或表面改性包被悬臂根据标准细胞培养方案，使用我们的制备方法进行表面涂层需要 30 分钟，但可能会根据研究者的具体培养方案而改变。

Reese 已将细胞在其特定生长培养基中达到所需浓度，然后将 100 微升细胞悬液喷到悬臂芯片表面，确保培养基的气泡完全覆盖悬臂窗口。将含有芯片的板转移到培养箱中，让细胞在此铺板期后粘附至少 1 小时。使用无菌镊子将芯片转移到没有 13 F 盖玻片的干净孔中，并向每个孔中加入 1 毫升生长培养基。

将板放回培养箱中，根据其体外维持的标准方案维持细胞。在盖玻片上，将加热的培养皿放在正置电生理显微镜的载物台上。将 3 毫升当前细胞饲养培养基添加到加热的显微镜中。

将载物台安装不锈钢电极安装在加热的培养皿内部，间隔距离为 15 毫米。将它们连接到能够产生场刺激的脉冲发生器，即不同强度、频率和波形的脉冲，以允许系统在适当的时候对细胞产生场刺激。将安装在 XY 平移台上的氦氖激光器栓入显微镜台的底部。

然后调整激光，使激光束以相对于悬臂平面 30 度角穿过加热的培养皿的底部。下一个螺栓，安装在 XY 平移台上的象限光电探测器模块，到显微镜载物台的底部。调整其位置，使反射的激光束落在四个象限的中心。

编写一个软件程序来控制线性执行器，该执行器参考文本协议中提供的流程图扫描悬臂。打开悬臂分析硬件和相关软件。将加热的载物台 ther mrta 插入培养基中，等待其读数为 37 摄氏度。

接下来，将悬臂芯片插入载物台，使悬臂朝向载物台的右侧。打开显微镜光源。聚焦显微镜以使悬臂的边缘进入视野，并使用激光光电探测器控制软件将激光束定位在悬臂一的尖端，假设悬臂的方向位于载物台悬臂的右侧。

一个是位于数组左上角的那个，数字向下延伸到 16。在左下角。悬臂 17 位于右上角位置，并运行到 32。

在右下角，按 播放 在录制软件上。通过调整控制光电探测器的步进电机，定位光电探测器，使信号在 x 和 y 帧中均读取为零。然后在激光光电探测器控制软件中将悬臂设置一个位置。

接下来，将激光器移动到悬臂 16 的尖端。重复光电探测器的定位，并在激光光电探测器控制软件中设置悬臂 16 位置。现在将激光器移动到悬臂 32 的尖端。

重复光电探测器的定位，并在激光光电探测器控制软件中设置悬臂 32 位置。最后，将激光器移动到悬臂 17 的尖端。重复光电探测器的定位，并在激光光电探测器控制软件中设置悬臂 17 位置。

关闭实验室中的显微镜光源，然后关闭顶灯。按 Record 在录音软件上。将脉冲发生器硬件设置为 40 毫秒和 5 伏脉冲，频率为 1 赫兹。

然后打开机器 使用激光光电探测器控制软件，设置硬件以扫描 32 个悬臂阵列。每一次停下来 5 秒钟。当 32 个悬臂的扫描完成后，关闭刺激器。

然后停止录制软件并调出数据文件。检查每个悬臂的记录轨迹。用于收缩活动的证据。

收缩定义为峰值。如果偏转至少比基线高 0.1 伏，请记下每个响应为正的悬臂。从激光光电探测器控制软件的扫描协议中删除任何无响应的悬臂。

然后可以在没有刺激的情况下重新扫描主动悬臂，以获得细胞自发收缩活动的读数。接下来，向培养基中加入治疗性化合物，以观察其对培养细胞功能输出的影响。在添加复合运行扫描后，有或没有宽场电刺激，通过长时间电刺激细胞来进行疲劳评估，然后扫描收缩水平以测量峰值力下降到特定阈值以下需要多长时间。

在运动神经元与肌肉共培养中维持的运动神经元与肌肉测量神经肌肉接头形成的实验中，通过处理运动神经肌管悬臂与神经元兴奋剂或突触抑制剂共培养并扫描自发活动的增加和减少，继续分析悬臂偏转数据如文本协议中所述。在悬臂上成功培养收缩细胞是使用标准细胞培养技术的一种相对简单的程序。标准电生理学软件可用于分析原始数据，有助于计算相关功能特性，例如峰值力、峰值力的时间和半弛豫时间。

扩展刺激方案提供了评估培养细胞疲劳率的方法，从而拓宽了可从该系统获得的生理数据水平。可以修改悬臂培养系统，将运动神经元包含在具有骨骼肌肌管的培养系统中，以便允许在体外评估神经肌肉突触的形成。在此类培养物中，将自发收缩活动的速率与神经元特异性兴奋剂（如谷氨酸）治疗的反应性收缩速率进行比较。

任何观察到的谷氨酸诱导的收缩率增加都表明培养的神经元激活导致乙酰胆碱释放和随后的肌管激活 用突触抑制剂（如乙酰胆碱受体阻滞剂、dtu rine）处理导致谷氨酸诱导活性停止，为这些培养物中存在功能性神经肌肉突触提供了进一步的证据。看完这个视频，你应该对如何使用微尺度硅悬臂来评估培养骨骼肌的功能特性有了很好的了解。