的发展体外检测以确定间充质细胞将经历上皮 - 间质转化的收缩功能

该程序的总体目标是评估经过体外炎性细胞因子诱导的上皮间充质转化 （EMT） 的间充质细胞的收缩力。这种间充质是炎症免疫反应诱导的 EMT 后基本细胞功能的变化，例如在特发性肺纤维化或严重哮喘中的气道重塑期间。这种技术的主要优点是它不需要特定的设备，并且它展示了高内涵 Demoving 该程序将是我实验室的 Hideyuki Takeshima 和 Kosuke Makita 研究生。

首先用 5 到 10 毫升 PBS 洗涤 A-549 人肺上皮细胞的培养物。接下来，在 37 摄氏度和 5% 的二氧化碳下用两毫升胰蛋白酶-EDTA 分离贴壁细胞。3 分钟后，将细胞悬液转移到含有细胞培养基的锥形管中，并在离心机中离心细胞。

沉淀重悬于两毫升细胞培养基中，保留一小瓶用于计数。然后将 0.5 至 1 乘以 10 至 6 个细胞接种在每 10 厘米聚苯乙烯培养皿中 10 毫升培养基中，并将细胞培养物孵育 24 小时。对于 EMT 诱导，第二天用 10 微升 TGF β 1 和 TNF α 处理细胞，然后将板放回培养箱中再放置 48 小时。

第四天，用 5 到 10 毫升 PBS 洗涤 EMT 诱导的培养物，然后用胰蛋白酶-EDTA 分离细胞，如刚才所示。接下来，在补充有胰蛋白酶抑制剂的 DMEM 中离心细胞悬液，并将沉淀重悬于 500 微升 PBS 中。然后对细胞进行计数，并将新鲜制备的凝胶培养基加入密度为 3 乘以 10 的第 5 个细胞中，在凝胶化前用移液管轻轻但快速混合溶液。

迅速但小心地将 0.5 毫升细胞以整齐的圆柱形形式分配到未经处理的 24 孔板的每个孔中。然后将板置于细胞培养箱中 15 分钟。当凝胶完全凝固后，将灭菌的 spatuala 沿一个方向围绕每个凝胶的外部绕圈移动，以将凝胶从板中分离而不会破裂。

去除凝胶时，注意不要在孔中来回移动刮刀。然后用刮刀轻轻地将凝胶转移到单独的 16 毫米组织培养皿中，其中含有 5 毫升 DMEM，补充有 1% FBS，有或没有 TGF β 1 和 TNF α。最后，轻轻摇动培养皿，确保凝胶漂浮在培养基上，然后将凝胶放回细胞培养箱中。

未经处理的 a541 细胞呈鹅卵石状和三角形外观，这是上皮细胞的特征。然而，在用 TGF β 1 和 TNF α 刺激后，细胞表现出长梭形，类似于在同步细胞中观察到的形状。EMT 前后上皮和同步体标志物表达的 QRTCPR 显示，用炎性细胞因子处理 48 小时的 A541 细胞表现出 CDH1 表达显著降低，VIAM 和 ACTA2 表达显著增加。

此外，这些细胞因子的刺激减弱了蛋白质血液分析确定的 E-钙粘蛋白表达，而诱导波形蛋白 N-钙粘蛋白和 α 平滑肌肌动蛋白的表达。在凝胶收缩试验中，48 小时后，含有 TGF β 1 和 TNF α 处理的细胞的凝胶比含有用 PBS 处理的细胞的对照凝胶小。事实上，72 小时后，与凝胶分析仪测量的受控凝胶相比，含有细胞因子处理凝胶的凝胶的大小显著减小。

据观察，如果作得当，凝胶收缩步骤可以在 3 小时内完成。在尝试此程序时，请务必记住在进行凝胶收缩测定之前确认 EMT 已被成功诱导。经过观察，该技术提供了一种在炎症状态（如纤维化或肺重塑）期间改变 EMT 过程的方法。

看完这个视频后，您应该对如何将具有 EMT 的细胞发射到一种 cuagenter 中并在培养基中起泡有一个很好的了解。