Name: 的发展体外检测以确定间充质细胞将经历上皮 - 间质转化的收缩功能 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: 学习使用凝胶收缩实验评估经历上皮-间质转化的人肺上皮细胞收缩功能。该方法无需特殊设备，可研究炎症因子诱导的EMT过程，适用于肺纤维化和哮喘等疾病的细胞生物学研究。

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感谢小山忠博士提供的技术支持。本工作部分由日本学术振兴会（JSPS）科学研究费补助金（编号23249045、15K09211、15K19172）资助；日本厚生劳动省呼吸衰竭研究组资助项目；以及日本过敏性疾病与免疫学研究基金资助项目。

1. 肺上皮细胞的准备与培养
<ol>
	<li>在添加了10%胎牛血清（FBS）、100 IU/ml 青霉素和100 µg/ml 链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养A549人肺上皮细胞（贴壁细胞系）。</li>
	<li>从培养皿中移除并弃去细胞培养液，用5–10 ml磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次。洗涤后立即吸除PBS。</li>
	<li>加入2 ml&#160;胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）（0.05%），在37 °C、5% CO2条件下孵育3分钟。</li>
	<li>将脱落的细胞收集至含有细胞培养基的离心管中，在室温下以150 × g离心4分钟。</li>
	<li>用2 ml细胞培养基重悬细胞沉淀，并取样进行细胞计数。使用台盼蓝染色和血细胞计数板测定细胞数量并检测细胞活力。</li>
	<li>在10 cm聚苯乙烯培养皿中，以每皿0.5–1.0 × 106个细胞的密度接种A549细胞，每皿加入10 ml培养基用于凝胶收缩实验；在6孔聚苯乙烯培养板中，以每孔0.5–1.0 × 105个细胞的密度接种A549细胞，每孔加入2 ml培养基用于EMT验证。在37 °C、5% CO2条件下孵育24小时。</li>
</ol>
2. EMT 实验步骤
<ol>
	<li>向第1.6步接种用于凝胶收缩实验的培养板中加入10 µl TGF-β1（5 µg/ml）和10 µl TNF-α（10 µg/ml）。向第1.6步接种用于EMT验证的培养板中加入2 µl TGF-β1（5 µg/ml）和2 µl TNF-α（10 µg/ml）。在37 °C、5% CO2条件下孵育48小时。</li>
</ol>
3. 通过 PCR 和蛋白质印迹法验证 EMT 过程
<ol>
	<li>使用相差显微镜确认经处理细胞形态的变化（从铺路石样变为纺锤形）。 
	注意：正常的 A549 细胞呈铺路石样和三角形，这是上皮细胞的特征；但在经 TGF-β1 和 TNF-α 刺激后，细胞呈现细长的纺锤形，类似于间充质细胞14,15。</li>
	<li>通过 PCR 或蛋白质印迹法检测上皮标志物（如 E-钙黏蛋白）以及间充质标志物（如 N-钙黏蛋白、波形蛋白和 α-平滑肌肌动蛋白）的表达。
	<ol>
		<li>使用 RNA 提取试剂盒16从细胞中提取总 RNA，并根据制造商说明书使用逆转录酶17合成 cDNA。</li>
		<li>根据制造商说明，使用实时 PCR 系统18和单体氰染料 PCR 试剂盒检测 mRNA 表达水平。GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、ACTA2（α-肌动蛋白-2）、CDH1（钙黏蛋白-1；E-钙黏蛋白）和 VIM（波形蛋白）的特异性引物见表 1。</li>
		<li>使用含有 1% 蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液（表 2）裂解细胞。使用蛋白定量试剂盒19,20测定所有样品的蛋白浓度，并将等量蛋白上样至聚丙烯酰胺凝胶。
		<ol>
			<li>进行 SDS 凝胶电泳，并将蛋白半干转至 PVDF 膜21。将膜在封闭缓冲液中与一抗孵育 1–2 小时。孵育后，用洗涤缓冲液洗涤膜两次，再与二抗孵育 1 小时。 
			注意：有关本研究中使用的一抗及其稀释比例，请参见材料/设备表。封闭缓冲液的成分见表 2。</li>
			<li>用洗涤缓冲液洗涤膜两次。使用冷 CCD 相机11,23和蛋白质印迹检测试剂盒22拍摄膜图像。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 用于评估 EMT 的凝胶收缩实验
<ol>
	<li>从细胞培养容器中吸除条件培养基，并用 5 - 10 ml PBS 充分洗涤以去除死细胞。洗涤后立即吸除 PBS。</li>
	<li>加入 2 ml 0.05% 胰蛋白酶/EDTA，于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 3 分钟。</li>
	<li>将脱落的细胞收集至含有添加胰蛋白酶抑制剂（1 mg/ml）的 DMEM 的离心管中，在室温下以 150 ×g 离心 4 分钟。</li>
	<li>将 I 型胶原凝胶与蒸馏水及 4× 浓缩 DMEM 混合，调节体积以获得终浓度为 1.75 mg/ml 的胶原和 1× DMEM 浓度。此步骤中务必将凝胶介质置于冰上。 
	注意：配制 6 ml 凝胶介质时，将 3.5 ml I 型胶原凝胶（3 mg/ml）、1.5 ml 4× 浓缩 DMEM 和 1 ml 蒸馏水充分混合。</li>
	<li>用 500 µl PBS 重悬细胞沉淀，并取样进行细胞计数。使用血细胞计数板结合台盼蓝染色检测细胞活力。</li>
	<li>加入凝胶介质调节体积，使细胞密度达到每孔 3.0 × 105 个细胞（6.0 × 105 个细胞/ml），并通过移液轻轻而迅速地混匀，避免发生凝胶化。</li>
	<li>迅速且小心地将 0.5 ml 混合液加入 24 孔未处理培养板的每个孔中，形成整齐的圆柱形结构。注意避免气泡污染凝胶（图 1A）。 
	注意：含细胞的凝胶介质黏稠，易发生凝胶化并在孔中形成新月形。</li>
	<li>将培养板置于细胞培养箱中，在 37 °C、5% CO2 和 95% 湿度条件下孵育 15 分钟，使其完全凝胶化。</li>
	<li>用无菌刮铲沿单一方向划圈，将凝胶从培养板上轻轻剥离而不破坏其结构。使用刮铲小心地将凝胶转移至含有 5 ml DMEM/1% FBS（可含或不含 TGF-β1（5 ng/ml）和 TNF-α（10 ng/ml））的 60 mm 组织培养皿中。</li>
	<li>轻轻摇动培养皿，确保凝胶漂浮于培养基表面。置于细胞培养箱中，在 37 °C、5% CO2 和 95% 湿度条件下继续孵育。</li>
</ol>
5. 凝胶尺寸的测量
<ol>
	<li>使用图像分析系统在 0、24、48 和 72 小时后测量胶原凝胶的尺寸。
	<ol>
		<li>打开凝胶成像系统（图 2A），将培养皿放入遮光柜中，然后在柜内取下培养皿的盖子。</li>
		<li>启动相应的凝胶分析软件。点击菜单栏中的 &#34;图像采集按钮&#34;，以显示柜内凝胶的图像。然后点击菜单栏中的 &#34;采集&#34;按钮，拍摄凝胶图像（图 2B）。</li>
		<li>点击菜单栏中的 &#34;检测按钮&#34;（图 2C），通过拖动鼠标调整测量区域（图 2C 中的黄色圆圈）。然后点击菜单栏中的 &#34;自动检测按钮&#34;（见 图 2D 中的按钮），软件将自动识别凝胶并显示热图（图 2D）。</li>
		<li>点击 &#34;确定&#34;，通过图像处理提取凝胶轮廓，并计算轮廓所包围的面积（图 2E）。面积计算完成后，结果将在单独的弹出窗口中显示。 
		注意：如果成像过程中凝胶相互重叠，请使用无菌移液器吸头轻轻移动凝胶。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本研究建立的实验方案包括两个步骤。第一步用于诱导上皮-间质转化（EMT），第二步为凝胶收缩实验。由于确认细胞是否发生EMT至关重要，因此第二步可很好地补充形态学和基因表达的变化。既往研究表明，A549细胞的EMT仅由TGF-β1诱导24；然而，正如我们先前所报道的10，TNF-α处理可增强EMT并促进间充质细胞标志物的获得。目前认为，TGF-β介导的EMT机制依赖于Smad通路25。TNF-α可增强TGF-β1诱导的EMT，从而促进凝胶收缩。已有研究报道，TNF-α增强TGF-β1诱导EMT的机制不仅涉及Smad2连接区的磷酸化，还包括对MAPK信号通路的调控26。因此，本研究建立的实验方案包含了TGF-β1和TNF-α的联合刺激。
将经历上皮-间质转化（EMT）的细胞包埋于I型胶原凝胶中，并使其在培养基中悬浮，是本实验的关键步骤（步骤4）。由于凝胶质地柔软且易受损，且各面尺寸不一，因此在将凝胶转移至培养基中以及测量其尺寸时需格外小心。若此步骤操作困难，可采用另一种替代方法，即在不将凝胶转移至6...

纤维化参与多种慢性进行性疾病的发病机制，如间质性肺病、心脏纤维化、肝硬化、终末期肾衰竭、系统性硬化症以及自身免疫性疾病1。在间质性肺病中，特发性肺纤维化（IPF）是一种慢性进行性疾病，预后较差。IPF的病理特征是出现成纤维细胞灶，其由活化的成纤维细胞和肌成纤维细胞构成，并与疾病预后相关。此类肺成纤维细胞的来源被认为可能来自多种间充质细胞，包括原本存在于肺组织中的固有成纤维细胞以及来自骨髓的循环纤维细胞。近年来，上皮-间充质转化（EMT）被认为与间充质细胞的形成有关，并可能参与纤维化疾病的发生发展过程2。
人们认为，上皮-间充质转化（EMT）在胎儿发育、伤口愈合以及癌症进展（包括肿瘤侵袭和转移）过程中发挥着重要作用3。经历EMT过程后，上皮细胞通过丢失上皮标志物（如E-钙黏蛋白）并表达间充质标志物（如波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白（SMA）），获得间充质细胞的特性4,5。先前的研究表明，EMT过程与肾脏6和肺部7组织纤维化的发生有关。此外，慢性炎症可促进纤维化疾病的发生8；并且，诸如肿瘤坏死因子超家族成员14（TNFSF14；LIGHT）、肿瘤坏死因子（TNF）-α和白细胞介素-1β等炎症性细胞因子已被证实能够增强EMT9-12。
胶原凝胶收缩实验，一种基于胶原的细胞收缩实验，其中成纤维细胞三维包埋于I型胶原凝胶中，是一种理想的 体外 用于评估收缩力的模型。收缩力是成纤维细胞的特征性功能之一，参与正常的伤口修复及纤维化过程13在此实验中，通常认为成纤维细胞通过依赖整合素的机制附着于I型胶原，在某些条件下可产生机械张力，进而导致组织收缩。
本文报道了凝胶收缩实验的建立，该方法经过改良可用于评估经历上皮-间质转化（EMT）的细胞获得收缩功能的情况。本研究表明，这种改良后的实验方法适用于评估经历EMT的间充质细胞的收缩能力。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>sigma aldrich</td><td>11965-092</td><td>用于 A549 培养基</td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td>转化生长因子-&amp;beta;1，人源，重组</td><td>Wako 实验室化学品</td><td>209-16544</td><td></td></tr><tr><td>重组人 TNF-&amp;alpha;</td><td>R&amp;D systems</td><td>210-TA/CF</td><td></td></tr><tr><td>E-钙黏蛋白 (24E10) 兔单克隆抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#3195</td><td>1:3,000 稀释</td></tr><tr><td>波形蛋白 (D21H3) 兔单克隆抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#5741</td><td>1:3,000 稀释</td></tr><tr><td>抗-&amp;alpha;-微管蛋白抗体</td><td>sigma aldrich</td><td>T9026</td><td>1:10,000 稀释</td></tr><tr><td>单克隆抗肌动蛋白，&amp;alpha;-平滑肌抗体&amp;nbsp;</td><td>sigma aldrich</td><td>A5228</td><td>1:10,000 稀释</td></tr><tr><td>抗 N-钙黏蛋白抗体</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>#610920</td><td>1:1,000 稀释</td></tr><tr><td>抗小鼠 IgG，HRP 标记全抗体（山羊）（二抗）</td><td>GE Healthcare</td><td>NA931-100UL</td><td>1:20,000 稀释</td></tr><tr><td>抗兔 IgG，HRP 标记全抗体（驴）（二抗）</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-100UL</td><td>1:20,000 稀释</td></tr><tr><td>封闭试剂</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN418</td><td>在 TBS-T 中配制成 2%</td></tr><tr><td>6 孔透明平底 TC 处理多孔细胞培养板，带盖</td><td>corning</td><td>#353046</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 细胞培养皿</td><td>TPP</td><td>#93100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM，粉末</td><td>life technologies</td><td>12100-046</td><td>用于配制 4&amp;times; DMEM</td></tr><tr><td>Ⅰ型胶原凝胶</td><td>Nitta gelatin</td><td>Cellmatrix type I-A</td><td></td></tr><tr><td>24 孔细胞培养板</td><td>AGC TECHNO GLASS</td><td>1820-024</td><td></td></tr><tr><td>凝胶成像系统&amp;nbsp;</td><td>ATTO</td><td>AE-6911FXN</td><td>凝胶成像仪</td></tr><tr><td>凝胶分析软件</td><td>ATTO</td><td>Densitograph，ver. 3.00</td><td>与 AE-6911FXN 配套的分析软件</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA (0.05%)，含酚红</td><td>life technologies</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>24 孔板，未处理</td><td>IWAKI</td><td>1820-024</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液，0.4%</td><td>life technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>RNA 提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>逆转录酶</td><td>life technologies</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>实时 PCR 系统</td><td>Stratagene</td><td>Mx-3000P</td><td></td></tr><tr><td>SYBR green PCR 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>204145</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物（100×）</td><td>life technologies</td><td>78429</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 膜</td><td>ATTO</td><td>2392390</td><td></td></tr><tr><td>蛋白定量试剂盒</td><td>bio-rad</td><td>5000006JA&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯酰胺凝胶</td><td>ATTO</td><td>2331810</td><td></td></tr><tr><td>Western 印迹检测试剂</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>冷 CCD 相机</td><td>ATTO</td><td>Ez-Capture MG/ST</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶抑制剂</td><td>sigma aldrich</td><td>T9003-100MG</td><td></td></tr><tr><td>聚氧乙烯（20）山梨醇单月桂酸酯</td><td>Wako 实验室化学品</td><td>163-11512</td><td></td></tr><tr><td>聚氧乙烯（9）辛基苯基醚</td><td>Wako 实验室化学品</td><td>141-08321</td><td></td></tr></tbody></table>

一种的开发 体外 评估经历上皮-间充质转化的间充质细胞收缩功能的实验方法

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

纤维化常参与多种慢性进行性疾病（如间质性肺病）的发病过程。其病理特征是成纤维细胞灶的形成，且与疾病的严重程度相关。构成成纤维细胞灶的间充质细胞可能来源于多种细胞前体，包括肺内原本存在的固有成纤维细胞以及来自骨髓的循环纤维细胞。近年来研究还提出，经历上皮-间充质转化（EMT）的间充质细胞也可能参与纤维化的发病机制。此外，转化生长因子β可诱导EMT，而肿瘤坏死因子α等促炎性细胞因子可增强EMT过程。凝胶收缩实验是一种理想的体外模型，可用于评估成纤维细胞特有的功能之一——收缩能力，该功能参与伤口修复及纤维化过程。本文展示了利用凝胶收缩实验来评估经历EMT的间充质细胞收缩能力的方法。

在 EMT 过程中，上皮细胞失去上皮标志物（如 E-钙黏蛋白），并获得表达间充质标志物，例如波形蛋白和 α-平滑肌肌动蛋白4,5。用 TGF-β1 和 TNF-α 孵育 A549 人肺上皮细胞可诱导 EMT。正常的 A549 细胞呈鹅卵石样或三角形，这是上皮细胞的典型特征（图 3A）；但在经 TGF-β1 和 TNF-α 刺激后，细胞形态转变为细长的梭形，类似于间充质细胞（图 3B）。
通过检测上皮和间充质标志物的表达，以确认细胞是否发生上皮-间充质转化（EMT）。相对mRNA表达量采用ΔΔCt法计算，各数据均以管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）进行标准化。经TGF-β1和TNF-α处理48小时后，A549细胞中CDH1的表达显著降低，而VIM和ACTA2的表达显著升高（图4A</st...

本文介绍了凝胶收缩实验的建立及其应用，用于评估经历上皮-间充质转化的间充质细胞的收缩功能。

纤维化常参与多种慢性进行性疾病（如间质性肺病）的发病机制。其病理学特征是……

本实验的总体目标是评估经历体外炎症细胞因子诱导的上皮-间充质转化（EMT）后间充质细胞的收缩能力。这种间充质表型是EMT后细胞基本功能的一种改变，常见于由炎症免疫反应引发的疾病过程，例如特发性肺纤维化或重症哮喘中的气道重塑。该技术的主要优势在于无需特殊设备，且具有高信息含量。演示本实验操作的将是我实验室的研究生竹岛英幸（Hideyuki Takeshima）和牧田浩介（Kosuke Makita）。首先用 5 至 10 毫升 PBS 洗涤 A-549 人肺上皮细胞培养物。接着，在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下，用 2 毫升胰蛋白酶-EDTA 消化贴壁细胞。3 分钟后，将细胞悬液转移至含有细胞培养基的锥形管中，并在离心机中离心沉淀细胞。将沉淀重悬于2 mL细胞培养基中，保留少量上清用于计数。随后，在10 cm的聚苯乙烯培养皿中，每皿加入10 mL培养基，接种0.5至1 × 10⁶个细胞，并将细胞培养物在培养箱中孵育24小时。为诱导EMT，次日用10 µL TGF beta 1和TNF alpha处理细胞，然后将培养板放回培养箱继续孵育48小时。第四天，用 5 至 10 毫升 PBS 洗涤诱导的 EMT 培养物，然后用胰蛋白酶-EDTA 消化细胞，方法如前所述。接着，将 DMEM 中的细胞悬液（含胰蛋白酶抑制剂）离心，将沉淀重悬于 500 微升 PBS 中。随后计数细胞，并加入新鲜配制的凝胶培养基，使细胞密度达到每孔 3 × 10⁵ 个细胞，使用移液器在凝胶化前轻柔而迅速地混匀溶液。迅速但小心地将 0.5 毫升细胞均匀地以圆柱形加入未经处理的 24 孔板的每个孔中。然后将该板放入细胞培养箱中孵育 15 分钟。当凝胶完全凝固后，用灭菌的刮铲沿每个凝胶的边缘单向环形移动，使凝胶与孔板脱离而不破坏凝胶结构。取出凝胶时，注意不要在孔中来回移动刮铲。然后用刮铲轻轻将凝胶转移至含有5毫升DMEM的单个16毫米组织培养皿中，DMEM中添加1% FBS，并根据需要加入TGF beta 1和TNF alpha。最后，轻轻摇动培养皿，确保凝胶漂浮在培养基中，然后将凝胶放回细胞培养箱中。未经处理的A541细胞呈现类似铺路石状和三角形的形态，这是上皮细胞的典型特征。然而，在用TGF-β1和TNF-α刺激后，这些细胞表现出细长的梭形形态，类似于间充质细胞的形态。对EMT前后上皮和间充质标志物表达进行qRT-PCR分析显示，经炎症性细胞因子处理48小时的A541细胞中，CDH1的表达显著降低，而VIM和ACTA2的表达显著升高。此外，通过蛋白质印迹分析确定，用这些细胞因子刺激会减弱E-钙黏蛋白的表达，而波形蛋白、N-钙黏蛋白以及α-平滑肌肌动蛋白的表达则被诱导。在凝胶收缩实验中，48小时后，含有经TGF-β1和TNF-α处理细胞的凝胶比含有经PBS处理细胞的对照凝胶更小。事实上，72小时后，与对照凝胶相比，含有细胞因子处理细胞的凝胶体积显著缩小，该结果通过凝胶分析仪测定。如观察所示，如果操作得当，凝胶收缩步骤可在三小时内完成。在进行该实验时，重要的是要记住，在执行凝胶收缩实验之前，必须确认上皮-间质转化（EMT）已成功诱导。经过观察，该技术为研究在炎症状态下（如纤维化或肺组织重塑）EMT过程的变化提供了一种方法。观看本视频后，您应能充分理解如何将发生上皮-间质转化（EMT）的细胞接种到某种培养板中，并在培养基中使其悬浮培养。

development-an-vitro-assay-to-evaluate-contractile-function

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

的发展<em&gt;体外</em&gt;检测以确定间充质细胞将经历上皮 - 间质转化的收缩功能

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改良的小鼠胚胎干细胞检测法用于量化心脏诱导效率

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一种用于评估颅部间充质细胞行为的组织块培养实验方法

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研究乳腺癌及正常细胞中TGF-β信号通路与TGF-β诱导的上皮-间质转化

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TGF-β介导的内皮细胞向间充质细胞转化（EndMT）及利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对EndMT效应分子的功能评估

本研究展示了一种灵活的实验方案，采用微孔板格式的荧光标记弹性可收缩表面（FLECS）技术，通过可视化荧光蛋白微图案的位移，实现对单细胞收缩力的简化、免手动定量分析。...

使用微图案化弹性体进行单细胞收缩力的简化高通量分析

本方案提供了生成三维工程化心肌和骨骼肌组织的方法，并描述了其在临床前药物筛选中的应用。所述方法利用磁感应系统，可同时平行评估24个组织。...

可扩展的三维工程化肌肉组织中的临床前药物测试

学习使用凝胶收缩实验评估经历上皮-间质转化的人肺上皮细胞收缩功能。该方法无需特殊设备，可研究炎症因子诱导的EMT过程，适用于肺纤维化和哮喘等疾病的细胞生物学研究。

一种的开发体外评估经历上皮-间充质转化的间充质细胞收缩功能的实验方法

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