利用定制设计的趋电钱伯斯研究前列腺细胞定向迁移
2014年12月7日
我们提出了一种方法，将生理电场施加到定制的电流调节室中迁移的永生化前列腺细胞。使用这种方法，我们证明 2 系非致瘤性前列腺细胞在该领域表现出不同程度的迁移方向性。
该程序的总体目标是执行 Galvan Axxis，这是一种评估细胞在外加电场中定向迁移的测定。这是通过首先组装然后用感兴趣的细胞接种 Galvan axxis 室来实现的。在第二步中，密封腔室并施加电场进行延时成像。
在最后一步中，跟踪单个电池的迁移速度和相对于电场的角度。最终 cosign。这可用于显示电池如何响应电场以及它们是否定向迁移到阴极。
该技术的主要优点是在给予 Texas 进行二次分析后易于检索细胞，并且易于在高放大倍率和荧光标记的细胞下拍摄迁移。这种方法的可视化至关重要，因为如果没有演示，很难学习腔室组装步骤组装底部腔室。首先用两个丙醇擦拭塑料电镀 axxis 腔室。
然后使用注射器在腔室底部的圆形开口周围涂抹船用级硅密封剂。在密封剂上放置一个大盖玻片，然后用棉签的末端将其压入到位，用棉签擦去多余的胶水。然后用菱形点标记切割一个小盖玻片，形成 6 x 25 毫米的间距，然后翻转腔室。
接下来，使用注射器涂抹两条硅胶条，在底部玻璃的两个圆形开口之间创建一个 10 x 25 毫米的通道表面，用于细胞附着。然后在圆形开口之间粘上两个玻璃空间，用新的棉签将空间向下推，并擦去多余的胶水，就像刚才演示的那样。尝试腔室 24 小时，直到硅胶固化。
第二天，将腔室浸泡在蒸馏水中过夜，以去除胶水中的乙酸残留物，然后将细胞接种到腔室中。如刚才所示，用两种丙醇擦干腔室。用无菌 PB S3 洗涤它们 2 次，然后检查腔室中两个圆形开口之间的液体流量。
确认腔室处于良好工作状态后，将其封装在无菌培养皿中，并将腔室置于 37 摄氏度下 15 分钟。当腔室平衡时，在 37 摄氏度下用 5 毫升胰蛋白酶 EDTA 将前列腺细胞从培养皿中分离出来。5 分钟后，用 5 毫升 10% FBS 中和反应物。
在 PBS 中，将分离的细胞转移到 15 mL 试管中，然后离心 5 分钟。在 200 次 G 时吸出培养基，然后将沉淀重悬于 1 毫升培养基中。然后，在对细胞进行计数后，用培养基和种子将细胞浓度调整为 8 x 10 至每毫升 4 个细胞。
将 350 μL 细胞悬液放到每个腔室中。将细胞在培养皿中用湿 Kim 抹布在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳中孵育过夜。第二天，首先将每个镀锌 AXS 腔室的 10 毫升培养物加热至 37 摄氏度，开始组装顶部腔室。
当培养基加热时，将 Galvan axxis 腔室从培养箱转移到 37 摄氏度的加热板上，并用培养基冲洗腔室。要去除未附着的细胞，请在腔室中留下 400 微升培养基，然后使用注射器在两个玻璃空间的顶部涂抹高真空润滑脂。用盖玻片和棉布涂抹器密封腔室，然后干燥玻璃表面。
接下来，用注射器涂抹高真空润滑脂，以密封盖玻片和腔室之间的间隙。然后将培养基添加到内部储液器中。去除气泡并检查储液槽之间的液体流动。
要使琼脂桥切成一对两英寸的 PVC 管，请翻转它们，然后将碎片放入 100 毫升烧杯中。接下来，将 200 毫克 bact toe 琼脂加入装有 10 毫升培养基的 50 毫升培养瓶中，制成 2% 琼脂凝胶。微波加热 30 秒后，使用移液管将琼脂凝胶加载到塑料管中，并将琼脂桥在室温下放置 10 分钟以使琼脂凝固。
然后将 2 毫升培养基加入 gal 室的外部储液器中，并将琼脂桥插入内部和外部培养基储液器中以传导电流以执行迁移的延时成像。首先将 Galvan 室转移到显微镜载物台上的 37 摄氏度环境室中，用胶带固定腔室并在 10 倍物镜下聚焦细胞。接下来，将 Galvan Axxis 电极插入外部储液器中，阴极在右侧，用胶带固定电线和电极。
然后打开电源箱，向暗室施加电场，并使用电压计测量整个暗室的输出电压，使 25 毫米长的暗室达到 2.5 伏特。现在选择整个暗室的 10 个点以生成 10 个延时短片，并将采集条件设置为间隔 10 分钟，持续 2 小时。然后开始拍摄并根据需要调整输出电流，以保持实验过程中的场强。
在实验结束时，从载物台上取下腔室并将细胞固定在 95% 酒精中。然后打开腔室。封面可以保存以备后用。
染色和成像。为将来几年清洁腔室。要量化 Galvan Axxis，请旋转延时电影以将阴极定向到图像的顶部。
将电影导出到细胞跟踪软件中，并从每个电影的每个时间点手动跟踪 10 到 20 个细胞的 XY 位置、迁移距离和相对于南北方向的角度，电场的相同方向将在细胞跟踪软件中计算。最后，保存测量值并将数据导入数据库应用程序以计算组合结果。在这个具有代表性的 Galvan Axxis 实验中，确定前列腺细胞系在两个小时内以相似的速度迁移。
然而，PRNS 一条线的电场方向性为 0.7 加负 0.3，PNT 两条线为 0.2 加负 0.8，表明这两种细胞系的 Galvan 轴存在显着差异，表明它们的细胞信号传导机制直接对电场的差异迁移响应在 Govan Texas 方法开发后。该技术有助于研究人员探索电场中细胞定向迁移的机制。
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概述
本研究提出了一种使用定制的电泳池对迁移的永生前列腺细胞施加生理电场的方法。结果表明，两种非肿瘤前列腺细胞在电场刺激下表现出不同程度的迁移定向性。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞迁移
- 电生理学
- 前列腺癌研究
背景
- 电泳是细胞在电场刺激下的定向移动。
- 该方法可以帮助理解癌症研究中的细胞行为。
- 永生前列腺细胞作为研究非肿瘤细胞行为的模型。
- 不同的细胞系可能对电场的响应各不相同。
研究目的
- 评估前列腺细胞在电场中的定向迁移。
- 比较不同非肿瘤前列腺细胞系的迁移行为。
- 建立一种研究体外电泳的可靠方法。
使用的方法
- 组装定制的电泳池。
- 在电泳池中接种永生前列腺细胞。
- 在时间跨度成像过程中施加电场。
- 跟踪单个细胞相对于电场的迁移速度和方向。
主要结果
- 两种非肿瘤前列腺细胞显示出不同程度的定向迁移。
- 细胞向阴极迁移，表明对电场的响应。
- 进行了迁移速度和角度的定量分析。
- 该方法提供了对电场下前列腺细胞行为的洞察。
结论
- 电泳池是研究细胞迁移的有效工具。
- 不同的前列腺细胞系在电场刺激下表现出不同的迁移模式。
- 这项研究有助于理解电场在细胞行为中的作用。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables mechanistic de-risking of prostate cell migration phenotypes by quantifying directional responses to physiological electric fields, supporting target validation in early discovery. The custom galvanotaxis chamber provides a reproducible, disease-relevant system for assessing intrinsic migratory behavior, which can inform lead identification strategies by highlighting functional differences between cell models. Such electrophysiological profiling adds predictive confidence to preclinical models by linking cellular signaling mechanisms to functional outputs under controlled stimuli.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by revealing differential intrinsic features governing directional migratory responses between prostate cell lines.
- Operational Value: Enables biological de-risking through quantitative measurement of migration speed and angle relative to cathode-directed galvanotaxis.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying cell line-specific signaling mechanisms that modulate electrotaxis, informing target confidence assessments.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems using low-cytotoxicity, reusable PVC chambers and platinum electrodes for standardized electrotaxis screening.
- Quantitative Outputs: Generates migration speed and directional persistence metrics via time-lapse imaging and cell tracking software, enabling reliable compound evaluation.
- Scalability: Facilitates platform reuse through agar bridge-mediated current conduction and motorized stage imaging, supporting assay standardization across runs.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses SV40-immortalized prostate cell lines (pRNS-1-1 and PNT2) as a disease-relevant system to model non-tumorigenic cell behavior under electrophysiological cues.
- Translational Continuity: Links discovery-stage galvanotaxis measurements to preclinical risk-adjusted advancement by revealing differential electrotaxis that may reflect underlying pathway activity.
- Mechanistic De-risking: Highlights how cellular signaling mechanisms direct differential migration responses to electric fields, reducing ambiguity in target validation.
Pipeline & Workflow Integration
The galvanotaxis assay integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, providing electrophysiological readouts that complement biochemical and imaging-based screening cascades.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying how prostate cell lines directionally migrate in applied electric fields, clarifying pathway-dependent migratory phenotypes.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized chamber assembly, sterile equilibration, and time-lapse imaging under controlled field strength (2.5 V across 25 mm chamber).
- Analytics: Enables comparative analysis via exported time-lapse movies, manual XY tracking, and calculation of migration angles relative to the electric field north-south orientation.
- Translational Research: Connects galvanotaxis outcomes to preclinical continuity by identifying intrinsic migratory differences that may predict differential responses in complex microenvironments.
- Enterprise Reuse: Positions the chamber as a reusable capability due to affordable, autoclavable components and modular design allowing glass surface modifications and cell treatments.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through quantitative galvanotaxis metrics that reduce mechanistic ambiguity in cell migration studies.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via sealed chambers, agar bridges, and motorized stage imaging, minimizing variability in electrotaxis measurements.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by revealing cell line-specific electrotaxis profiles that inform capital allocation in early-stage target programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through differential directionality measurements (e.g., 0.7±0.3 vs 0.2±0.8) that reflect intrinsic migratory phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, microfluidic chamber assembly, and time-lapse microscopy for reliable galvanotaxis execution.
- Dependent on instrumentation including motorized microscope stages, voltage meters, and cell tracking software for quantitative directional analysis.
- Necessitates cross-team standardization of chamber sealing protocols (silicone application, agar bridge preparation) to ensure consistent current conduction.
- Involves adaptation considerations when modifying glass surfaces or testing extracellular matrix coatings on chamber substrates for cell attachment studies.
- Includes practical limitations such as the 24-hour silicone curing time and overnight chamber soaking to remove acetic acid residue before cell seeding.
