Name: 利用定制设计的趋电钱伯斯研究前列腺细胞定向迁移 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: 了解利用定制趋电钱伯斯研究前列腺细胞定向迁移的方法。该技术通过施加生理电场评估非致瘤性前列腺细胞的迁移方向性，为癌症研究中的细胞行为机制提供重要见解。

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前列腺细胞系由加州大学戴维斯分校癌症中心的王凌宇博士和龚兴坚博士惠赠。本项目由美国国立卫生研究院（NIH）电趋化性研究基金4R33AI080604资助。

1. 前列腺细胞的培养
<ol>
	<li>将pRNS-1-1和PNT2前列腺细胞在含10%胎牛血清和抗生素-抗真菌剂的RPMI 1640培养基中，于37 °C、5% CO2条件下接种于100 mm培养皿中进行培养。每日更换培养基，直至细胞在电趋化实验前达到80%汇合度。</li>
</ol>
2. 组装趋电性实验装置
<ol>
	<li>组装底部腔室
	<ol>
		<li>用异丙醇擦拭塑料电趋性腔室。使用注射器将海洋级硅胶密封剂涂抹在腔室底面的圆形开口周围，并贴附一块大盖玻片（图1）。用棉签的背面压紧盖玻片，并用棉签擦去多余的胶水。圆形开口可使培养基和电流流经位于两个内侧培养基储液池之间的细胞。</li>
		<li>使用金刚石笔在小盖玻片上划线，切割出6 mm × 25 mm的间隔片。</li>
		<li>将腔室翻转。使用注射器和/或金属刮刀在底部玻璃的两个圆形开口之间涂上两条硅胶，形成一个10 mm × 25 mm的细胞贴附通道表面。在两个圆形开口之间粘贴两片玻璃间隔片。使用棉签背面压紧间隔片，并用棉签和/或牙签擦去多余的胶水。</li>
		<li>将腔室干燥24小时，直至硅胶完全固化。将腔室浸泡在蒸馏水中过夜，以去除胶水中的乙酸残留。干燥后可立即使用，或将其存放在洁净容器中以备后续使用。 
		<img alt="电趋性腔室示意图，显示用于细胞迁移研究的盖玻片和间隔片组装方式。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
		图1：底部电趋性腔室的组装。A) 将一块大盖玻片粘附在洁净腔室的底部。B) 在两个圆形开口之间粘贴两片玻璃间隔片，形成一个10 mm × 25 mm的细胞贴附通道。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在电趋性腔室中接种细胞
	<ol>
		<li>根据实验需要准备相应数量的电趋性腔室。每种细胞系或处理条件需使用一个独立的电趋性腔室。用异丙醇擦拭电趋性腔室，用无菌PBS清洗3次，并检查腔室中两个圆形开口之间的液体流动情况。</li>
		<li>将腔室置于无菌细胞培养皿中，在37 °C下平衡15分钟。使用5 ml 0.25%胰蛋白酶-EDTA在37 °C下消化5分钟，使前列腺细胞从培养皿中脱离。加入5 ml含10%胎牛血清（FBS）的PBS中和胰蛋白酶-EDTA。</li>
		<li>将细胞转移至15 ml离心管中，在200 × g、37 °C条件下离心5分钟。吸除上清液，并用1 ml培养基重悬细胞。</li>
		<li>取20 µl细胞悬液加入计数室，计算细胞数量。用培养基将细胞浓度调整至8 × 104 个细胞/ml。</li>
		<li>从37 °C培养箱中取出电趋性腔室，向每个腔室接种350 µl细胞悬液。</li>
		<li>将接种细胞的腔室置于培养皿中，在37 °C、5% CO2条件下过夜培养；可在培养皿中放置湿润的Kimwipe纸或使用湿度培养箱以维持湿度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
	<img alt="显示体外分析孵育和设置的前列腺细胞迁移过程示意图。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
	图 2：将细胞接种至小室中。 下层小室经干燥并清洁。A) 前列腺细胞经胰蛋白酶消化、计数后转移至小室中，并过夜孵育。B) 在开始成像前，将上层盖玻片固定以密封小室。
<ol start="3">
	<li>组装上层腔室
	<ol>
		<li>在开始成像前组装上层腔室。显微镜一次只能容纳一个电趋性腔室进行成像。为每个电趋性腔室预热 10 ml 培养基至 37 °C。将电趋性腔室从培养箱转移至 37 °C 预热板上。</li>
		<li>用培养基冲洗细胞，去除未贴壁的细胞。在腔室内保留 400 µl 培养基。使用注射器将高真空油脂涂布在两块玻璃垫片的顶部。</li>
		<li>添加一小块盖玻片以密封腔室。用棉签的背面轻轻按压盖玻片。用棉签擦去多余的培养基。</li>
		<li>将玻璃表面干燥，并涂抹高真空油脂以密封盖玻片与腔室之间的缝隙。使用金属刮刀将油脂均匀铺开。向内侧储液槽中加入 4 ml 培养基，并检查储液槽之间的液体流动情况。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备琼脂桥
	<ol>
		<li>剪取一段长约 2 英寸的 PVC 管（503/16 内径 × 5/16 外径 × 1/16 壁厚），翻转后插入 100 ml 烧杯中。</li>
		<li>称取 200 mg Bacto-Agar，加入含 10 ml 培养基的 50 ml 三角瓶中，配制成 2% 琼脂凝胶。微波加热 30 秒。使用移液管将琼脂凝胶注入塑料管中。将琼脂桥在室温下静置 10 分钟，使其凝固。</li>
		<li>向电趋性腔室的外侧储液槽中加入 2 ml 培养基。将琼脂桥插入内侧和外侧的培养基储液槽中，以传导电流。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
	<img alt="显示用于细胞迁移和电流流动的琼脂桥装置的电趋化室示意图。" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig3highres.jpg" width="350" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
	图 3：在电趋化室中拍摄细胞。 展示电趋化室最终组装结构的示意图。电趋化室使用高真空油脂完全密封。向储液槽中加入培养基，并将两个琼脂桥插入电趋化室内。随后将电趋化室转移至显微镜载物台上，并连接电极以施加电场。图中展示了组装后电趋化室的侧视图，以说明电流通过琼脂桥及盖玻片之间的空间流经细胞。 
3. 时间序列成像
<ol>
	<li>在成像前2小时，将环境培养箱开启并调节至37 °C，循环空气中含5% CO2。</li>
	<li>开启显微镜并启动图像采集软件。校准显微镜载物台，并选择10倍物镜。</li>
	<li>将电趋性实验腔室转移至显微镜载物台上，用胶带固定腔室，并对细胞进行聚焦。将电趋性电极插入外侧储液槽，阴极置于右侧。用胶带固定导线和电极。</li>
	<li>打开电源盒，向腔室施加电场。使用电压表测量腔室两端的输出电压，使25 mm长的腔室达到2.5伏（100 mV/mm）。通过调节输出电流，在实验过程中维持恒定的电场强度。</li>
	<li>在软件中选择跨越腔室的10个点位进行拍摄，生成10段延时录像。设置采集条件为每10分钟一次，持续2小时。</li>
	<li>开始录像，并根据需要调节输出电流。</li>
	<li>实验结束后，从载物台上取下腔室，用95%乙醇固定细胞。用刀片切开腔室以便清洗并重复使用。</li>
</ol>
4. 电趋性定量分析
<ol>
	<li>旋转延时录像，并将阴极重新调整至图像顶部。将录像导出至细胞追踪软件。</li>
	<li>在每段录像中，于每个时间点手动追踪 10–20 个细胞的 (x, y) 位置（图 4 A, B）。细胞追踪软件将计算迁移距离以及相对于南北方向（即电场的相同取向）的迁移角度（图 4C）。 
	注意：平均迁移速度由总迁移距离与总拍摄时间换算得出。方向性由角度转换为余弦值。若细胞迁移方向随机，净余弦值的平均值将接近于零。若细胞直接朝向阴极迁移，余弦值为 +1。若细胞直接朝向阳极迁移，余弦值为 -1。</li>
</ol>
<img alt="显示细胞迁移方向性的电趋性示意图；平均余弦值，θ=a/b，电场。" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig4highres.jpg" width="400" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图4：通过细胞追踪测量迁移方向性。 A) 细胞图像与追踪轨迹线的叠加图。细胞的 (x, y) 位置通过延时录像手动追踪获得。若细胞随机迁移，平均余弦值接近零。B) 然而，若细胞向阴极或阳极定向迁移，则平均余弦值接近 +1.0（阴极）或 -1.0（阳极）。C) 方向性以余弦值表示，该值由迁移角度（θ）转换而来。余弦（θ）等于距离 a（迁移距离）与距离 b（在电场方向上的投影距离）的比值。
<ol start="3">
	<li>保存测量结果。将数据导入数据库应用程序以计算综合结果。</li>
	<li>将平均迁移速度和平均余弦值的综合数据导出至电子表格，用于绘制柱状图（图5）。</li>
</ol>

<ol><li>Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+measurement+of+bioelectric+currents+with+a+vibrating+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe.</a> Nat Protoc. 2 (3), 661-669 (2007).</li>
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<li>Nuccitelli, R., Nuccitelli, P., Li, C., Narsing, S., Pariser, D. M., Lui, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electric+field+near+human+skin+wounds+declines+with+age+and+provides+a+noninvasive+indicator+of+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Rep.+and+Reg%22%5BJournal%5D)">The electric field near human skin wounds declines with age and provides a noninvasive indicator of wound healing.</a> Wound Rep. and Reg. 19, 645-655 (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

细胞的电趋性反应分析一直是许多细胞迁移或生长过程的重要功能指标27, 28。本文中，我们使用一种带有玻璃表面的定制腔室来拍摄两种前列腺细胞系。这些细胞系表现出不同程度的电趋性，我们推测，在建立永生化细胞系的过程中，介导电趋性的蛋白质的细胞内定位或激活可能受到干扰，从而导致电趋性反应的差异。
与在培养皿中制作的其他电趋化室设计相比27, 28，当前设计具有多项优势。首先，玻璃表面适用于成像，且在电趋化实验结束后可取出带有细胞的盖玻片进行免疫染色。本研究中我们使用了10X物镜的低倍放大来监测一群细胞。然而，得益于改进的玻璃光学性能，也可使用60X油镜在更高放大倍数下拍摄单个细胞，以追踪细胞前缘伪足的快速伸展与回缩过程17，或追踪表达荧光蛋白的细胞。其次，玻璃表面可进行基质蛋白包被10, 12，或制备成带微通道的图案化结构。此外，也可在拍摄前对细胞进行化学处理29。本研究所用的前列腺癌细胞系无需基质包被，而基质包被的需求具有细胞类型依赖性。例如，人角质形成细胞的电趋化需要I型胶原...

在多种组织中均检测到内源性电场，例如皮肤1, 32, 33和脑组织2。生理电场具有特定的生物学功能，包括指导胚胎发育3, 4、引导神经元突起的生长5, 6，以及促进上皮和角膜伤口的闭合1, 7。体外实验中，对培养细胞施加直流电场可模拟生理电场，并诱导细胞发生定向迁移，即电趋化作用（galvanotaxis）。电趋化现象已在成纤维细胞8、鱼类角质形成细胞9、人源上皮和角膜角质形成细胞10-12、淋巴细胞13、成神经细胞2以及神经前体细胞14中得到研究。当暴露于外加电场时，大多数被研究的细胞会定向迁移至阴极（-）端。然而，一些癌细胞，包括高转移性人乳腺癌细胞和人前列腺癌细胞系PC-3M，则会向阳极（+）端移动15, 16。目前已有若干机制被提出以解释电趋化作用或细胞感知电场的能力，包括表皮生长因子（EGF）受体的激活12、上皮钠通道的作用17、PI3K与PTEN的参与18，以及钙离子的释放15, 19。然而该机制尚未完全阐明，可能存在多种信号通路共同参与电趋化过程。
本文所展示的二维电趋性方法可用于表征贴壁且具有运动能力的细胞的定向迁移行为，既可用于监测单个细胞的迁移10, 12, 17，也可用于研究融合细胞层的整体迁移18, 20。该技术改进自Peng和Jaffe21以及Nishimura et al.10的方法，采用定制的透明PVC腔室，配有可拆卸的盖玻片，便于在电趋性实验后轻松回收细胞，用于免疫荧光成像等后续分析。电趋性腔室的玻璃表面具有光学兼容性，支持高倍率成像以及荧光标记细胞的实时观察。此外，该设计允许对玻璃表面进行改造，例如更换表面包被材料或调控表面电荷。腔室内使用1号盖玻片制成的间隔片，以最大限度减少流经细胞的电流，从而降低焦耳热效应（其产热量与电流平方成正比），避免实验过程中细胞过热。连接用的琼脂盐桥可防止电极与细胞直接接触，同时避免电趋性过程中培养基pH值或离子浓度发生变化。
本研究检测了两种非致瘤性人前列腺细胞系的电趋化性反应。pRNS-1-122和PNT223均为SV40永生化、生长因子依赖性细胞系，表达上皮标志物细胞角蛋白5、8、18和19，但前列腺特异性抗原（PSA）表达水平较低或无表达。两种细胞系均保持正常上皮细胞的多边形形态，但在核型分析中观察到染色体异常22,24。尽管pRNS-1-1和PNT2在大多数实验中表现出相似的行为，它们在腺泡结构形成和电趋化性方面仍存在差异。在三维基质Matrigel上，pRNS-1-1细胞可形成具有腔隙、类似正常前列腺腺体组织的中空腺泡结构25；而PNT2细胞则形成无腔隙或极性上皮的实心球状结构26。在本研究中，pRNS-1-1细胞的电趋化反应也强于PNT2细胞。pRNS-1-1细胞中腺泡结构形成与电趋化性之间的关联提示，电趋化信号可能在响应内源性电场的过程中参与调控前列腺腺体组织的运动组织过程，并为区分这两种细胞系提供了进一步的特征依据。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;细胞&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>pRNS-1-1 前列腺细胞</td><td></td><td></td><td>Lee, &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; (1994)</td></tr><tr><td>PNT2 前列腺细胞</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95012613-1VL</td><td>Berthon, &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; (1995)</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;培养基与溶液&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td>使用前预热至 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>优质胎牛血清</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>以 PBS 配制成 10% 溶液，使用前预热至 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌素（100 倍浓缩液）</td><td>Life Technologies</td><td>15240</td><td>每 500 ml 培养基中加入 5 ml</td></tr><tr><td>2-丙醇</td><td>VWR</td><td>BDH1133-5GL</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>-</td><td>-</td><td>137 mM NaCl、2.7 mM KCl、4.3 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 和 1.5 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 溶于 1,000 ml H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，调 pH 至 7.4，高压灭菌，使用前预热至 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td>使用前预热至 37 &amp;deg;C，在 37 &amp;deg;C 条件下处理细胞 3–5 分钟</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;电趋性装置&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>电趋性培养室</td><td>Precision Plastics Inc, CA</td><td></td><td>定制设计（1/4&quot; × 2&quot; × 3.5&quot;），无毒透明聚氯乙烯（PVC）材质。设计参数请与作者联系。</td></tr><tr><td>电趋性电极</td><td>UCD 电工车间</td><td></td><td>带柔性导线的铂丝线圈电极</td></tr><tr><td>电趋性电源箱</td><td>Substrate Engineering, CA</td><td></td><td>定制设计的直流电源输出装置，配备电压表</td></tr><tr><td>显微镜盖玻片，大号，45 × 50 mm，1.5 号</td><td>Fisher</td><td>12-544-F</td><td></td></tr><tr><td>显微镜盖玻片，小号，25 × 25 mm，1 号</td><td>ThermoScientific</td><td>3307</td><td></td></tr><tr><td>金刚石划线笔</td><td>ThermoScientific</td><td>750</td><td></td></tr><tr><td>船用级透明硅胶密封剂</td><td>3M</td><td>051135-08019</td><td></td></tr><tr><td>高真空润滑脂</td><td>Dow Corning</td><td>2021846-0807</td><td></td></tr><tr><td>6 ml 注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-561-64</td><td></td></tr><tr><td>Nichiryo 注射器，1.5 ml</td><td>Nichiryo</td><td>SG-M</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>Purtian Medical Products</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>棉签（Qtips）</td><td>Johnson &amp;amp; Johnson</td><td>729389</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 180 PVC 软管&amp;nbsp;</td><td>Nalgene</td><td>8000-9030</td><td>内径 5/16，外径 5/16，壁厚 1/16</td></tr><tr><td>细菌琼脂（Bacto-Agar）</td><td>Difco</td><td>0140-01</td><td>配制 2% 琼脂溶液</td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>Personna</td><td>74-0001</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;仪器与软件&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>配备 A-4-62 转子运行</td></tr><tr><td>Cellometer Auto T4</td><td>Nexcelom</td><td>Auto T4</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer 计数板</td><td>Nexcelom</td><td>CHT4-SD100-002</td><td>加入 20 &amp;#956;l 细胞悬液进行计数</td></tr><tr><td>培养温度加热板</td><td>Bel-Art Scienceware</td><td>370150000</td><td>用于维持电趋性培养室温度在 37 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>配备电动载物台和环境控制室的 Eclipse TE-2000 显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan Fluor 10X/0.30 物镜</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Retiga EX CCD 相机&amp;nbsp;</td><td>Qimaging</td><td></td><td>制冷型 CCD 相机，单色，12 位</td></tr><tr><td>含 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 的压缩空气</td><td>Airgas</td><td></td><td>特殊订购</td></tr><tr><td>Volocity 6.3</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>图像采集软件</td></tr><tr><td>Improvision OpenLab 5.5.2</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>细胞追踪软件，可自定义用于测量迁移角度</td></tr><tr><td>FileMaker Pro Advanced, 8.0</td><td>FileMaker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel 2008 for Mac</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用定制设计的电趋化室研究前列腺细胞的定向迁移

Utilizing Custom-designed Galvanotaxis Chambers to Study Directional Migration of Prostate Cells

生理电场具有特定的生物学功能，例如在胚胎发育、神经元轴突生长及上皮伤口愈合过程中引导细胞迁移。对培养细胞施加直流电场 体外 诱导细胞定向迁移，即电趋性。本文展示的二维电趋性实验方法经过改良，采用了定制的聚氯乙烯（PVC）腔室、玻璃表面、铂电极，并结合使用配备电动载物台的显微成像系统对细胞进行实时观察。PVC腔室和铂电极具有较低的细胞毒性，且成本低廉、可重复使用。玻璃表面与电动显微镜载物台提高了成像质量，并允许对玻璃表面进行可能的修饰以及对细胞实施相应处理。我们记录了两种非致瘤性、SV40永生化的前列腺细胞系pRNS-1-1和PNT2的电趋性行为。这两种细胞系表现出相似的迁移速度，均向阴极迁移，但在电趋性中的方向性程度存在差异。本实验方案所得结果提示，pRNS-1-1与PNT2细胞系可能具有不同的内在特性，从而调控其定向迁移反应。

采用该方法研究了两株前列腺细胞（pRNS-1-1 和 PNT2）。在2小时的过程中，这两株细胞的迁移速度相似，均为 1.0 +/- 0.3 微米/分钟（图 5A）。然而，pRNS-1-1 株对电场的方向性为 0.7 +/- 0.3，而 PNT2 株的方向性为 0.2 +/- 0.8（图 5B）。结果表明，这两株细胞在电趋化性方面存在显著差异（p&lt;0.01，共追踪了100个细胞），提示它们具有不同的细胞信号转导机制，从而导致对位置信号产生不同的定向反应。
<img alt="电趋性速度和方向性图表；pRNS-1-1 与 PNT2；柱状图分析。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig5highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
...

我们介绍一种在定制的电趋性室中对迁移中的永生化前列腺细胞施加生理电场的方法。利用该方法，我们证明了两株非致瘤性前列腺细胞在电场中表现出不同程度的迁移方向性。

生理电场具有特定的生物学功能，例如在胚胎发育、神经元轴突生长及细胞迁移方向调控中发挥作用。

本实验的总体目标是进行Galvan Axxis检测，以评估细胞在施加电场中的定向迁移能力。首先组装Galvan Axxis小室，并将目标细胞接种其中；第二步，密封小室并施加电场，进行延时成像。在最后一步中，追踪单个细胞的迁移速度及其相对于电场的方向角度。最终通过余弦值来表示。该方法可用于展示细胞对电场的响应情况，以及它们是否朝向阴极进行定向迁移。该技术的主要优势在于，经过给定的德克萨斯处理后，细胞易于回收，可用于二次分析；同时，迁移过程可在高倍镜下轻松拍摄，尤其是使用荧光标记细胞时。该方法的可视化至关重要，因为若无演示，很难掌握小室组装的步骤。组装底部小室时，首先用两份异丙醇擦拭塑料盖玻片腔室。然后使用注射器在腔室底面的圆形开口周围涂抹船用级硅胶密封剂。将一块大盖玻片覆盖在密封剂上，并用棉签的一端将其压紧，同时用棉签擦去多余的胶水。接着使用金刚石笔在小盖玻片上标记，切割出六段每段25毫米的空隙，然后将腔室翻转过来。接下来，使用注射器涂抹两条硅胶，于底部玻璃的两个圆形开口之间形成一个10乘以25毫米的通道表面，用于细胞贴附。然后在两个圆形开口之间粘合两片玻璃间隔片，用新的棉签向下压紧间隔片，并如刚才所示擦去多余的胶水。将培养腔室静置24小时，直至硅胶完全固化。第二天，将腔室浸泡在蒸馏水中过夜，以去除胶水中的乙酸残留物，然后再向腔室内接种细胞。用异丙醇按前述方法将腔室擦干并擦拭两次。用无菌 PBS 洗涤三次，然后检查腔室两个圆形开口之间的液体流动情况。确认小室处于良好工作状态后，将其放入无菌培养皿中，并于37摄氏度放置15分钟。在小室平衡期间，用5毫升胰蛋白酶EDTA在37摄氏度下将前列腺细胞从培养皿中消化下来。5分钟后，加入5毫升10%FBS中和反应。在PBS中，将脱离的细胞转移至15毫升离心管中，然后离心5分钟。在200 × g条件下，吸除上清液，再用1毫升培养基重悬细胞沉淀。细胞计数后，用培养基将细胞浓度调整至每毫升8 × 10⁴个细胞，并进行接种。将350微升细胞悬液加入每个腔室中。将细胞置于培养皿中，于37摄氏度、5%二氧化碳条件下，在腔室内过夜培养，培养皿内放置湿润的Kim擦拭纸。次日，开始组装上层腔室，首先将每孔Galvan AXS腔室所需的10毫升培养基预热至37摄氏度。当培养基预热时，将一个Galvan axxis培养室从培养箱中取出，置于37摄氏度的加热板上，并用培养基冲洗培养室。为去除未贴壁的细胞，在培养室内保留400微升培养基，然后使用注射器在两个玻璃间隙上方涂抹高真空润滑脂。用盖玻片和棉签密封培养室，随后干燥玻璃表面。接下来，使用注射器将高真空润滑脂涂抹于盖玻片与腔室之间的缝隙以进行密封。然后向内侧储液池中加入培养基。去除气泡，并检查储液池之间的液体流动情况。制备琼脂桥时，先截取一段两英寸长的PVC管，将其翻转后放入100毫升烧杯中。接

utilizing-custom-designed-galvanotaxis-chambers-to-study-directional

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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