利用改良的齐格蒙德小室法分析躯干神经嵴细胞迁移

本实验的总体目标是评估某种分子诱导离体躯干神经嵴细胞产生趋化性及其他迁移反应的能力。首先，分离长度约为8至15个体节的躯干水平神经管，并将每段神经管接种于经纤连蛋白包被的盖玻片上，单独培养过夜，以促进神经嵴细胞的迁移。随后，选择一个理想的神经嵴细胞培养样本。

将神经管从培养物中取出，将含有培养物的盖玻片安装到改良的Zigmund小室中，使培养物最平直的边缘与即将施加于培养物上的分子梯度方向平行。第三步是建立跨越培养物的分子梯度，然后对沿预先选定的培养物平直边缘迁移的外周神经嵴细胞进行摄像。最后一步是利用Image J软件追踪并分析位于培养物选定边缘处的外周神经嵴细胞的迁移行为。

最终，通过分析所获得的细胞轨迹数据，可以确定所选分子是否能够改变细胞的运动方向性或其他迁移特性（例如迁移速度）。与现有的Boyden小室实验等技术相比，该技术的主要优势在于成本极低。该方法可用于通过延时成像分析原代外植体培养物边缘已极化细胞的迁移行为。

将鸡胚蛋在 38 摄氏度下孵育 56 小时后，从孵育箱中取出鸡蛋，用 70% 乙醇轻微喷洒，然后在鸡蛋干燥的过程中让其自然晾干。取一个无菌塑料培养皿，加入鸡林格溶液，并对玻璃托盘进行紫外线灭菌。取一个 5 厘米的玻璃培养皿，加入显示用溶液。

现在将鸡蛋打开，放入经紫外灭菌的玻璃托盘中。用弯头剪刀在胚胎的血岛周围剪开，分离每个胚胎与其卵黄。然后用钝头镊子夹住胚胎的胚外膜，将胚胎转移至含有林格氏液的已备好培养皿中。

接下来，挑选约九个处于汉堡期至哈密尔顿期（15至17期）的胚胎，用钨针切除体节10之前的所有胚胎组织，并从大约第五个最新形成的体节开始，去除所有脊索胚层组织。然后将胚外膜修剪至距胚胎约两毫米处。

将分离的胚胎躯干置于培养皿中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1小时15分钟。在胚胎躯干孵育的同时，准备六片盖玻片用于培养。首先用70%乙醇冲洗盖玻片，然后使其自然干燥。

然后使用实验室记号笔，在每张盖玻片中央画一个直径约一厘米的圆圈，用于后续识别每张盖玻片同一面上的纤维蛋白连接层。在所画圆圈外侧写上一个不对称的单词或符号，以方便区分盖玻片的上下表面。现在将每张盖玻片分别放入一个 40 × 10 毫米的无菌培养皿中，使标记面朝下，并将培养皿在杀菌紫外灯下敞开放置 10 分钟。

然后将60微升纤连蛋白加入盖玻片无标记面的1厘米圆形区域内，确保整个圆形区域均被覆盖。将培养皿置于37°C培养箱中孵育30分钟。孵育结束后，小心吸去每张盖玻片上的纤连蛋白。

接下来，向 FI nin 包被区域加入 250 µL 培养基。盖上盖玻片，然后再次孵育盖玻片，直至神经管被分离。在盖玻片孵育期间，用 L-15 培养基填充一个 5 cm 的玻璃培养皿。

现在将所有孵育后的胚胎躯干转移至准备好的培养皿中。使用精细镊子和锋利的刀片及针头，用针沿神经管与体节的边界小心切开，以分离出神经管。从培养箱中取出盖玻片。

选取六根最长且最直的神经管，然后使用预先加入培养基的微量移液器吸头，将一根神经管转移至六张盖玻片中的每一张上。确保每根神经管均位于其对应盖玻片的纤连蛋白包被区域内，使用微量移液器调整位置，并在37°C和5%二氧化碳条件下过夜培养。接下来，将至少2毫升无血清培养基加入一支无菌的15毫升离心管中。

在37摄氏度、5%二氧化碳条件下过夜培养试管时，保持管盖略微松开，以允许培养基的pH值进行调整。过夜培养后，从三个培养物中选择三个状态最佳的神经嵴细胞培养物，且每个至少具有一侧长而直的边缘。选取其中一个用于加载第一个腔室，其余放回培养箱中以备后续使用。

然后使用棉签，在一个经改造的西格蒙德小室的储液槽周围区域及桥接部位均匀涂抹一层薄薄的凡士林。接着用钨针轻轻将神经管从含有选定神经嵴细胞培养物的盖玻片上移除，使周围的神经嵴细胞仍附着在纤维连接蛋白涂层上。用实验室标记笔在培养皿上做标记，以记录神经嵴细胞培养物最平直边缘的朝向。

接下来，将几滴预孵育的培养基滴加到改良Zigmund小室的桥部。然后用精细镊子夹起盖玻片，用Kimwipe纸轻轻蘸去盖玻片边缘的大部分旧培养基，立即将其放置在改良Zigmund小室上，使待拍摄的直线神经嵴细胞边缘位于桥的中央，并大致与桥的储液槽边缘垂直。

使用倒置显微镜，将神经嵴细胞的直线边界移至最靠近储液池的桥的一侧。这将使疑似趋化因子包含在内，并更精确地使神经嵴细胞的直线边界与桥和储液池边界相互垂直。现在小心而稳固地按压盖玻片，将其插入齐格蒙德小室的石蜡油中，确保其完全密封在小室上。

然后在盖玻片边缘涂抹额外的凡士林，以进一步确保其密封良好。再次调整神经嵴细胞边界的倾斜角度，以校正封片过程中可能发生的任何位移。接下来，将约 300 微升预温育的培养基吸入一支 1 毫升注射器中。

使用25号、1.5英寸长的针头。将培养基注入不含有任何趋化因子的储液槽中，直至注满，注意避免在储液槽中产生气泡。

然后在装载下一个储液槽之前，用足量的凡士林将两侧的储液槽密封。现在用一支新的注射器吸取300 µL含有目标趋化因子的预孵育培养基，以相同方式将培养基注入对侧的储液槽中。

再次用凡士林仔细密封储液槽。将加样后的Sigmund小室在37摄氏度下孵育1小时，然后再开始成像。随后，在约37摄氏度的条件下孵育，以每92秒为间隔，对神经嵴细胞培养物中最平直的边缘进行为期3小时的成像观察；作为对照，加载另外两个最佳神经嵴细胞培养物的Zigmund小室，操作方式如前所示。

使用适当的对照处理来填充储液池并预处理微流控桥。使用 ImageJ 手动追踪插件沿培养区域的直线边界追踪外周神经嵴细胞的迁移。使用趋化性与细胞迁移分析插件分析所获得的迁移轨迹的各种参数。

通过将神经管过夜培养并获得具有至少一条长而直边界的神经嵴细胞培养物，从而制备细长的躯干神经嵴细胞培养样本，并从中挑选适合实验的培养物。选取其中一个培养物的最长直边界，将其垂直于桥接储液池的边界放置，从而使其与后续施加梯度的方向平行。首先加载不含疑似化学趋化因子的储液池（此处用减号表示），并进行密封。

然后将另一储液池加入用加号表示的疑似趋化吸引剂，并对沿先前选定边界分布的周围神经嵴细胞进行封固，随后使用 ImageJ 的手动追踪插件对这些细胞进行成像和追踪。根据所获得的追踪数据，可评估细胞在施加浓度梯度下的多种迁移特征，如本图所示。例如，可通过将细胞在 x 轴方向上的位移除以其迁移的总距离，来计算趋化性指数。此处所示的细胞轨迹图展示了所有被追踪细胞的趋化吸引反应。

每条红色轨迹代表一个向含有疑似趋化因子的储液池迁移的细胞的运动路径。在本图中，红色轨迹的数量明显多于黑色轨迹。在另一次实验中，验证了经过改造的西格蒙德小室维持分子浓度梯度的能力。

将 Alexa Fluor 488 IGM 偶联物加入左侧储液池，并在不同时间点测量桥接区域的荧光强度。该浓度梯度至少维持了 26 小时。观看视频后，您应能够充分理解如何利用改良的 Zigmond 小室实验，分析某种分子在离体躯干神经嵴细胞培养物中诱导趋化性及其他迁移行为的能力。