Name: 躯干神经嵴细胞迁移使用一个修改过的Zigmond室法分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: 学习使用改良Zigmond室法分析躯干神经嵴细胞迁移，通过建立分子梯度区分趋化作用与其他迁移反应。该方法成本低廉，适用于发育生物学研究。

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在本方法的开发过程中，我们特别感谢Lino Kim、Steve Guzman和Ujit Satyarthi提供的技术协助。Myron Hawthorne、Richard Spengel和Roberto Rojas负责加工了本研究中使用的腔室，并提供了至关重要的技术支持。特别值得一提的是，Roberto Rojas制作了图4。我们还感谢Scott Fraser在上述趋化性实验开发之前提供的宝贵建议。本工作部分得到了NIH-MBRS SCORE-5S06GM048680-13（资助给MEdB）以及加州州立大学北岭分校研究生论文支持计划（CSU, Northridge Graduate Thesis Support Program）奖项（资助给CW）的资助。

1. 第1天：分离躯干神经管并接种于盖玻片上进行过夜培养
<ol>
	<li>将鸡胚蛋在56小时条件下孵育 38° C将鸡蛋从孵育环境中取出，用70%乙醇轻微喷洒，然后使其干燥。将鸡蛋打开，放入经紫外灭菌的玻璃托盘中。</li>
	<li>用弯头剪刀在血岛周围剪开，然后用钝头镊子夹住胚外膜将每个胚胎从卵黄中取出，放入盛有鸡林格氏液的无菌塑料培养皿中。</li>
	<li>使用钨针切除各胚胎多余的胚外膜以及头、迷走和骶部轴向区域，分离出胚胎的躯干部分（图1）。首先，选取约9个处于HH15-17期之间的胚胎 11对于HH15及以上的发育阶段，前脑与后脑的轴线形成一个锐角，因此头部呈现向尾侧倾斜的外观。在HH17阶段，尾芽已出现并朝腹侧倾斜，但尚未形成体节。使用钨针将胚外膜修剪至距胚胎约2 mm处，并切除体节10前方的所有胚胎组织。同时，从最新形成的第五个体节左右位置开始，移除所有尾侧的胚胎组织。</li>
	<li>将分离的胚胎躯干置于 Dispase（0.24 U/ml DMEM）中，于 37 °C 孵育 1 小时 15 分钟 37° C 和 5% CO2当主干开始孵育后，开始准备6个盖玻片（CS），用于培养NT外植体（步骤1.5–1.8）。</li>
	<li>用70%乙醇（用无菌超纯水稀释）冲洗6个CS，然后使其自然干燥。使用实验室标记笔在每个CS的中心画一个直径约1 cm的圆圈（该圆圈将用于后续识别纤维连接蛋白涂层的位置）。在每个CS的同一面上，在所画圆圈外侧标记单词“be”（或其他不对称的单词或形状），以帮助判断CS标记面朝上或朝下。</li>
	<li>将每张CS分别放入一个40 x 10 mm的无菌培养皿中，标记面朝下，将培养皿敞开放置在杀菌紫外灯下照射10分钟。</li>
	<li>应用 60 μl 纤连蛋白（FN； 10 μg/ml DMEM）加入CS的无标记表面，确保1 cm圆圈内的整个区域均被覆盖。将培养皿放入孵箱中孵育 37° C 孵育30分钟，然后小心吸除每个CS中的纤连蛋白。</li>
	<li>添加 250 μl “培养”培养基 [含L-谷氨酰胺（2 mM）、青霉素（100 U/mL）、链霉素（100 mcg/mL）和8%胎牛血清（FBS）的DMEM] 加入CS的FN包被区域。将含有每片CS的培养皿置于 37° C 和5% CO2 再次重复，直至分离出NTs。</li>
	<li>将所有孵育后的胚胎躯干转移至一个含有L15培养基的5 cm玻璃培养皿中，使用精细镊子和钨针开始分离每个神经管（NT）（图1）。用锋利的钨针沿神经管与体节的边界小心切开，注意避免损伤神经管。通常从躯干最尾端开始分离神经管更为容易。</li>
	<li>选择6条最直且最长的神经管（NTs），用于过夜培养（建议选择大约8到15个体节长度的NTs）。使用经预润的微量移液器吸头 培养 培养基中，将6个NT分别转移至各自预先准备好的CS中（步骤1.5至1.8）。确保NT不漂浮于液面。若NT漂浮，用移液枪滴加培养基直至其沉下。</li>
	<li>将每个培养皿放置于 37° C 和5% CO2 过夜。在将培养皿放入培养箱之前，务必确保每个NT位于其对应CS的FN包被区域内（以步骤1.5中绘制的圆圈作为参考）。如有需要，可使用微量移液器进一步调整每个NT的位置。</li>
	<li>至少加入 2 ml 的 培养 无血清培养基转移至无菌15 ml离心管中，于37°C过夜培养 37° C 和5% CO2将瓶盖略微松开，使培养基的 pH 值过夜调整。预先孵育培养基有助于防止在培养腔内产生气泡，从而避免干扰分子梯度的形成。后续所有步骤均应使用这种“预孵育”培养基。当不使用时，该培养基应置于孵育环境中 37° C.</li>
</ol>
2. 第2天：加载改良型Zigmond小室并进行细胞迁移的延时分析
<ol>
	<li>从培养的6个神经嵴（NT）中，选择最适合分析的3个培养物。通常应选择至少具有一条长而直边缘的神经嵴细胞（NCC）培养物（图2A）。当天将使用这3个最佳培养物分别装载并拍摄3个改良的齐格蒙德（Zigmond）小室，每种处理条件不同。从这3个培养物中选出一个用于装载第一个小室，其余两个放回培养箱中备用。</li>
	<li>使用棉签，在一个改良的齐格蒙德小室的储液槽周围及桥接区域均匀涂抹一层薄薄的凡士林。</li>
	<li>用钨针轻轻将神经嵴（NT）从载片（CS）上分离，同时使周围的神经嵴细胞（NCCs）仍附着在载片表面。用记号笔在培养皿上标记，以记录NCC培养物最直边缘的方向。</li>
	<li>在桥接区域滴加数滴预温育的培养基。用精细镊子夹起载片（CS），将其边缘在Kimwipe纸上轻蘸，去除大部分旧的培养液，然后立即放置在改良的齐格蒙德小室上，使待拍摄的培养物直边居中对准桥接区域的长度方向，并大致垂直于桥-储液槽边界（图2A,B）。</li>
	<li>使用倒置显微镜，将NCC的直边调整至靠近将要加入疑似趋化因子的储液槽一侧的桥接区域（图2B；对照组中，对应于第二个加样储液槽）。同时，进一步微调培养物直边，使其精确垂直于桥-储液槽边界。</li>
	<li>小心但牢固地将载片（CS）压入齐格蒙德小室上的凡士林中，确保其完全密封，然后在载片边缘再涂抹额外的凡士林，以进一步保证气密性。再次微调NCC边缘的角度，以校正密封过程中可能发生的位移。</li>
	<li>首先加载不含疑似趋化因子的储液槽（图2B）。使用1 ml注射器（配有25 G × 1.5 in.针头）吸取约300 μl 预温育培养基，将培养基注入储液槽直至充满（注意避免产生气泡）。在加载下一个储液槽前，先用足量凡士林将该储液槽两侧封口。</li>
	<li>重复步骤2.7，但此次使用含有候选趋化因子的预温育培养基。在培养物上建立分子浓度梯度时，关键是要始终先加载不含待测分子的储液槽，再加载含有待测分子的储液槽。</li>
	<li>将装载完成的齐格蒙德小室置于37°C环境中孵育1小时后再开始拍摄。在约37°C条件下，以90秒为间隔，对NCC培养物最直的边缘进行连续3小时的成像（图2A,B）。在生成任何视频前，务必调整相机位置，使成像区域的边缘与最后加样储液槽相邻的桥接边界对齐并接触（图2B，上图；虚线框表示理想的成像位置）。这将有助于后续软件分析，标准化施加的分子梯度方向以及每个视频中拍摄区域与储液槽的距离。</li>
	<li>对于对照组，重复步骤2.2–2.9，分别处理在步骤2.1中选出的另外两个NCC培养物，但每个储液槽均加入适当的培养基。一种对照组中，两个储液槽均加入不含待测分子的预温育培养基；另一种对照处理中，在放置载片前，先在桥接区域加入数滴含有疑似趋化因子的预温育培养基进行预处理，然后两个储液槽均加入含该趋化因子的相同培养基。</li>
	<li>使用ImageJ（NIH）的Manual Tracking插件<a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html">(rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html)</a>和Chemotaxis and Migration Tool v1.01插件<a href="http://www.ibidi.de/applications/ap_chemo.html">(www.ibidi.de/applications/ap_chemo.html)</a>，追踪刚成像的培养物直边周围外周NCC的迁移行为，并分析所得迁移轨迹的多个参数（图2B-C）。</li>
</ol>
3. 典型结果：
图 2D 展示了使用上述技术处理后，大量躯干神经嵴细胞对候选趋化因子产生响应的细胞轨迹示例。在此阳性响应示例中，大多数细胞表现出沿趋化因子梯度方向的净迁移运动（如红色所示）。此外，轨迹数据还可用于分析细胞迁移的其他特性。
为了直观评估改良型Zigmond小室中形成的浓度梯度，将Alexa Fluor 488标记的IgM偶联物（分子量约900 kDa）加入改良型Zigmond小室的第二个储液槽中（浓度约为40 μg/ml H2O）。1小时后形成梯度，26小时后仍有一定残留，但在50小时时显著减弱（图3）。如果待测分子较小，则所施加的梯度降解速度将快于本实验所示结果。
<img alt="用于干细胞收集和显微镜载玻片制备的胚胎躯干解剖示意图" src="/files/ftp_upload/3330/3330fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 在纤连蛋白包被的盖玻片上过夜培养躯干水平神经管组织块。由于躯干神经嵴细胞（NCCs）从与第8–28体节相邻的背侧神经管脱离，因此通过显微解剖分离该段神经管，并在纤连蛋白包被的盖玻片（CS）上过夜培养，以促进NCCs从神经管组织块中迁移出来。长度介于8–15个体节之间且相对平直的分离神经管最适合过夜培养，因其通常可获得具有较长平直边界的NCC培养物。其他轴向水平神经嵴来源的神经管区域以较小字体标示。s，体节。
<img alt="神经嵴细胞迁移实验装置示意图，含梯度矢量；显示位移图。" src="/files/ftp_upload/3330/3330fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 利用改良Zigmond小室评估移植的躯干神经嵴细胞迁移的方法。(A) 通过将神经嵴细胞（NCC）培养物中的神经管（NT）培养过夜，制备具有伸长躯干样结构的NCC培养物，并选取至少具有一条长而直边界的NCC培养物用于实验。将所选培养物中最长的直边界调整至与桥-储液槽边界垂直，从而使其与后续施加的梯度方向平行。 （B） 在精细调整NCC培养物在Zigmond小室中的位置并将盖玻片密封至小室后，即可装载小室。进行趋化性检测时，将用于盛放 不 先加入含有疑似趋化因子（-）的溶液并密封，然后向另一储液池中加入含有疑似趋化因子（+）的溶液并密封。随后，可对先前选定边界处的外周神经嵴细胞（NCCs）进行成像和追踪 手动追踪 ImageJ 的插件（底部面板）。 (C) 根据追踪数据，可评估细胞在施加梯度下的多种迁移特征。例如，可通过将细胞在x轴方向上的位移除以其迁移的总距离，来计算趋化性指数。 (D) 细胞轨迹图最初生成的一个具有吸引力的响应示例如下所示 趋化性与迁移分析工具 ImageJ 插件。每条轨迹的起始点均设为原点（0,0）。注意向趋化因子源迁移的细胞数量明显更多。所有细胞在最终位置的质心（蓝色十字；所有细胞等权重）也更接近趋化因子源。NCCs，神经嵴细胞；红色轨迹，向疑似趋化因子储液池迁移的细胞；黑色轨迹，远离迁移的细胞；（+），趋化因子浓度较高；（-），趋化因子浓度较低。
<img alt="Alexa 488 IgM 强度图、电泳结果、蛋白质纯化" src="/files/ftp_upload/3330/3330fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 在加入 Alexa Fluor 488 IgM 偶联物后不同时间点，沿改良 Zigmond 小室桥接区域的强度分布曲线。 小室的加载方式与方案中所述相似，主要区别在于使用预孵育的水（而非 预孵育 培养基用于稀释抗体至 40 μg/ml桥的末端（远离获取上述强度分布图的切片位置）存在微小气泡。最初，桥的大部分区域未见梯度形成；1小时后梯度开始建立，并持续至26小时；到50小时时，桥的不同区域梯度的存在变得不一致，且当梯度存在时，其陡峭程度也显著降低。所有分布图均使用AxioVision 4.6软件，从桥的同一横截面（从一个桥-储液池边界到另一个）生成。需注意，即使存在气泡，梯度仍保持完整，未受干扰。高，高强度；低，低强度；x轴，桥全宽方向的距离（2 mm）；（+），装载Alexa Fluor 488 IgM偶联物的储液池；（-），储液池 不 负载偶联物。
<img alt="技术图纸、机械工程、尺寸示意图、俯视图、侧视图、端面图、毫米刻度。" src="/files/ftp_upload/3330/3330fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4. 改良型Zigmond小室规格示意图。 图示为本研究所采用的改良型Zigmond小室及其尺寸规格（±0.2 mm）。可根据个人偏好对尺寸进行适度调整。
补充方案：改良型齐格蒙德小室的制备
请参考图4以了解以下实验方案：
<ol>
	<li>购买一块厚度为 3/16″ 的抛光丙烯酸板（实际厚度为 4.45 mm）。</li>
	<li>使用台式锯将板材切割成粗略尺寸为 33.25 mm × 64.57 mm 的腔室毛坯，预留 3.175 mm 的额外加工余量。</li>
	<li>将腔室毛坯固定在台钳上，使用铣床和直径为 6.35 mm（1/4″）的端铣刀，将腔室侧面精加工至精确尺寸：30.07 mm × 61.39 mm。</li>
	<li>将腔室毛坯放置在铣床上，使用寻边器确定毛坯在 x 轴和 y 轴方向的中心位置，并将该中心位置设为零点。</li>
	<li>将端铣刀轻触毛坯上表面，确定腔室高度（z 轴方向）并设为零点。</li>
	<li>使用直径为 3.91 mm（0.154″）的端铣刀，在 x 轴正方向偏移 3.03 mm 处开始加工第一个储液槽。沿 y 轴正方向切入腔室至深度 2.84 mm，移动 7.62 mm（0.300″），再反向（负方向）移动 7.62 mm（0.300″），形成总长度为 15.24 mm（0.600″）的完整储液槽。随后在 x 轴负方向偏移 3.03 mm（0.119″），重复相同步骤加工第二个储液槽。</li>
	<li>将腔室侧立，使用直径为 1.09 mm（0.043 in.）的钻头在每个储液槽末端（共 4 个）钻孔，使储液槽末端与腔室侧面连通，以便实验过程中加注培养基。</li>
	<li>将腔室在温热的肥皂水中充分浸泡，以去除可能存在的化学污染物。</li>
	<li>用去离子水充分浸泡并冲洗腔室，以去除残留的肥皂。至此，腔室已准备就绪，可按上述方法使用。</li>
</ol>

<ol><li>Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+avian+embryo+as+a+model+to+study+the+development+of+the+neural+crest%3A+a+long+and+still+ongoing+story%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story.</a> Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).</li>
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</ol>

未声明利益冲突。

进行躯干神经嵴细胞（trunk NCCs）的趋化性研究已证明存在一系列挑战。躯干NCCs属于异质性干细胞群体，若进行长期培养将发生分化；因此，躯干NCCs必须通过躯干部位神经管（NT）的原代外植方法获取。传统研究均一分布细胞群体趋化反应的方法 体外 由于首先需要将细胞从躯干神经嵴细胞（trunk NCCs）中分离并均匀地重铺于趋化迁移小室（例如 Boyden 小室）中，因此难以对其进行测试。 12）。分离足够数量的NCCs可能十分繁琐，因为可能需要解剖数十个神经管（NTs）才能获得足够用于一次实验的、分布均一的躯干NCCs。此外，在自然生理环境中，NCCs并不会被剥离、混合并重新均匀分布。因此，为了进行某些传统趋化性实验而重新接种的NCCs，其行为可能与 体内 关于迁徙行为的条件。
本文中，我们描述了一种改进的技术，用于在更接近自然的环境中评估躯干神经嵴细胞（NCC）的趋化性。在评估分布不均的躯干NCC趋化反应时，一个主要挑战是原始外植体培养物中NCC本身具有强烈的固有极性，以及其内在的异质性身份。例如，当在培养条件下，躯干...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Omega Scientific</td><td>DM-22</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>Omega Scientific</td><td>PS-20</td><td>100倍储存浓度</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Omega Scientific</td><td>GS-60</td><td>100倍储存浓度</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-11</td><td>批号# 105247（或性能相当的其他批次）</td></tr><tr><td>改良Zigmond小室</td><td>自制</td><td>N/A</td><td>储液槽体积：约 160 &amp;mu;l 每个；其他规格详见图4及补充制备方案</td></tr><tr><td>细胞培养皿</td><td>Denville</td><td>T6040</td><td>40 x 10 mm</td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>BD</td><td>354008</td><td>10倍储存液配制方法：将1 mg FN溶于1 ml H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 和9 ml DMEM中</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Fisher</td><td>12-548-B</td><td>预清洁；22 x 22 mm</td></tr><tr><td>L15培养基</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30525.02</td><td></td></tr><tr><td>凡士林</td><td>Comforts</td><td>011110794642</td><td>100%</td></tr><tr><td>离心管</td><td>Biologix</td><td>10-9152</td><td>15 ml</td></tr><tr><td>中性蛋白酶</td><td>Cell Systems</td><td>4Z0-850</td><td>10倍储存浓度</td></tr><tr><td>注射器</td><td>BD</td><td>309602</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>针头</td><td>BD</td><td>305127</td><td>25 G x 1.5 英寸</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488标记的IgM</td><td>Invitrogen</td><td>A21042</td><td>储存液浓度为2 mg/ml；每摩尔IgM结合7摩尔染料</td></tr><tr><td>解剖镊</td><td>FST</td><td>Misc.</td><td>Dumont #5 或 55；直头；不锈钢或钛材质</td></tr><tr><td>钨针</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>自制；安装于针 holder 中</td></tr><tr><td>钝头镊</td><td>Tiemann</td><td>160-18</td><td>用于将胚胎从蛋黄转移至林格氏液中</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">补充方案：改良Zigmond小室的制备&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content">请参考图4以配合以下方案操作：&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ol&gt; &lt;li&gt;购买一张厚度为3/16&quot;的抛光丙烯酸板（实际厚度为4.45 mm）。&lt;/li&gt; &lt;li&gt;使用台式锯将板材切割成略大于最终尺寸的毛坯（粗略尺寸为33.25 mm x 64.57 mm），预留3.175 mm的额外材料用于后续机加工。&lt;/li&gt; &lt;li&gt;将毛坯固定在台钳上，使用铣床和直径为6.35 mm（1/4&quot;）的端铣刀，将小室侧面精确加工至最终尺寸：30.07 mm x 61.39 mm。&lt;/li&gt; &lt;li&gt;将毛坯放置在铣床上，使用寻边器确定毛坯在x轴和y轴方向的中心位置，并将该中心设为零点。&lt;/li&gt; &lt;li&gt;将端铣刀轻触毛坯顶面以确定小室高度（z轴方向），并将该位置设为高度零点。&lt;/li&gt; &lt;li&gt;使用直径为3.91 mm（0.154&quot;）的端铣刀，在x轴正方向偏移3.03 mm处开始加工第一个储液槽。沿y轴正方向切入深度2.84 mm，移动7.62 mm（0.300&quot;），然后反向（负方向）移动7.62 mm（0.300&quot;），形成总长度为15.24 mm（0.600&quot;）的完整储液槽。再将刀具在x轴负方向偏移3.03 mm（0.119&quot;），重复相同过程加工第二个储液槽。&lt;/li&gt; &lt;li&gt;将小室侧立，使用直径为1.09 mm（0.043 英寸）的钻头在每个储液槽末端（共4个）钻孔，使孔道连接储液槽末端与小室侧面，以便实验时加入培养基。&lt;/li&gt; &lt;li&gt;将小室充分浸泡在温热的肥皂水中，以去除可能存在的化学污染物。&lt;/li&gt; &lt;li&gt;用双蒸水充分浸泡并冲洗小室，以去除残留肥皂。至此，小室已按上述方法准备就绪，可投入使用。&lt;/li&gt; &lt;/ol&gt;</td></tr></tbody></table>

利用改良的齐格蒙德小室法分析躯干神经嵴细胞迁移

Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay

神经嵴细胞（NCCs）是脊椎动物发育过程中存在的一群短暂细胞，它们在经历上皮-间质转化后从背侧神经管（NT）迁移而出1,2。经历EMT后，NCCs沿特定路径长距离迁移，直至到达靶位点。NCCs可分化为多种细胞类型，包括神经元、胶质细胞、黑色素细胞和嗜铬细胞1-3。NCCs能够抵达并识别其正确靶位点的能力，是所有含有躯干NCC来源组分结构正常形成的基石3。因此，阐明躯干NCC迁移的导向机制具有重要意义。已有大量分子被证实可引导NCC迁移4。例如，已知躯干NCC会被Semaphorin、Ephrin和Slit配体等负性导向信号排斥5-8。然而，直到最近才鉴定出任何躯干NCC的化学趋化吸引因子9。
常规的 体外 研究贴壁细胞趋化行为的方法在处理永生化且分布均匀的细胞时效果最佳，但应用于某些初始分布不均且快速分化的原代干细胞培养物（如神经嵴细胞，NCCs）时则更具挑战性。一种实现躯干NCCs分布均一化以用于趋化研究的方法是：从原代神经管（NT）外植体培养物中分离躯干NCCs，随后消化并重新接种，使其达到近100%汇合。然而，这种接种方法需要耗费大量时间和精力以获取足够的外植体细胞，操作过程较为剧烈，且导致躯干NCCs的分布方式与体内自然分布状态存在差异。 体内 条件。 
本文报道了一种体外方法，能够在无需均一细胞分布的情况下评估躯干神经嵴细胞（trunk NCCs）的趋化性及其他迁移反应。该技术利用改良的Zigmond小室对原代、未受干扰的躯干NCCs进行延时成像（标准Zigmond小室的描述见其他文献10）。通过在培养物边缘的躯干NCCs暴露于与其预测自然迁移方向垂直的趋化因子梯度，可检测施加的趋化因子梯度所诱导的迁移极性改变。该方法成本低廉，每次重复处理仅需培养两个神经管（NT）外植体，避免了剧烈的细胞解离操作（如胰酶消化），使躯干NCCs保持更接近体内状态的分布，缩短了外植与实验之间的时间间隔（可能降低分化风险），并允许对多种迁移特征进行延时评估。

本文介绍了一种分析移植细胞（躯干神经嵴细胞）迁移的方法。该方法成本低廉、操作温和，能够区分趋化性与化学趋向性，以及源自原代躯干神经嵴细胞培养中细胞间相互作用等其他因素对迁移极性的影响。

神经嵴细胞（NCCs）是一类存在于脊椎动物发育过程中的 transient 细胞群体，在背侧神经管（NT）形成后从其中迁移而出……

本实验的总体目标是评估某种分子诱导离体躯干神经嵴细胞产生趋化性及其他迁移反应的能力。首先，分离长度约为8至15个体节的躯干水平神经管，并将每段神经管接种于经纤连蛋白包被的盖玻片上，单独培养过夜，以促进神经嵴细胞的迁移。随后，选择一个理想的神经嵴细胞培养样本。将神经管从培养物中取出，将含有培养物的盖玻片安装到改良的Zigmund小室中，使培养物最平直的边缘与即将施加于培养物上的分子梯度方向平行。第三步是建立跨越培养物的分子梯度，然后对沿预先选定的培养物平直边缘迁移的外周神经嵴细胞进行摄像。最后一步是利用Image J软件追踪并分析位于培养物选定边缘处的外周神经嵴细胞的迁移行为。最终，通过分析所获得的细胞轨迹数据，可以确定所选分子是否能够改变细胞的运动方向性或其他迁移特性（例如迁移速度）。与现有的Boyden小室实验等技术相比，该技术的主要优势在于成本极低。该方法可用于通过延时成像分析原代外植体培养物边缘已极化细胞的迁移行为。将鸡胚蛋在 38 摄氏度下孵育 56 小时后，从孵育箱中取出鸡蛋，用 70% 乙醇轻微喷洒，然后在鸡蛋干燥的过程中让其自然晾干。取一个无菌塑料培养皿，加入鸡林格溶液，并对玻璃托盘进行紫外线灭菌。取一个 5 厘米的玻璃培养皿，加入显示用溶液。现在将鸡蛋打开，放入经紫外灭菌的玻璃托盘中。用弯头剪刀在胚胎的血岛周围剪开，分离每个胚胎与其卵黄。然后用钝头镊子夹住胚胎的胚外膜，将胚胎转移至含有林格氏液的已备好培养皿中。接下来，挑选约九个处于汉堡期至哈密尔顿期（15至17期）的胚胎，用钨针切除体节10之前的所有胚胎组织，并从大约第五个最新形成的体节开始，去除所有脊索胚层组织。然后将胚外膜修剪至距胚胎约两毫米处。将分离的胚胎躯干置于培养皿中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1小时15分钟。在胚胎躯干孵育的同时，准备六片盖玻片用于培养。首先用70%乙醇冲洗盖玻片，然后使其自然干燥。然后使用实验室记号笔，在每张盖玻片中央画一个直径约一厘米的圆圈，用于后续识别每张盖玻片同一面上的纤维蛋白连接层。在所画圆圈外侧写上一个不对称的单词或符号，以方便区分盖玻片的上下表面。现在将每张盖玻片分别放入一个 40 × 10 毫米的无菌培养皿中，使标记面朝下，并将培养皿在杀菌紫外灯下敞开放置 10 分钟。然后将60微升纤连蛋白加入盖玻片无标记面的1厘米圆形区域内，确保整个圆形区域均被覆盖。将培养皿置于37°C培养箱中孵育30分钟。孵育结束后，小心吸去每张盖玻片上的纤连蛋白。接下来，向 FI nin 包被区域加入 250 µL 培养基。盖上盖玻片，然后再次孵育盖玻片，直至神经管被分离。在盖玻片孵育期间，用 L-15 培养基填充一个 5 cm 的玻璃培养皿。现在将所有孵育后的胚胎躯干转移至准备好的培养皿中。使用精细镊子和锋利的刀片及针头，用针沿神经管与体节的边界小心切开，以分离出神经管。从培养箱中取出盖玻片。选取六根最长且最直的神经管，然后使用预先加入培养基的微量移液器吸头，将一根神经管转移至六张盖玻片中的每一张上。确保每根神经管均位于其对应盖玻片的纤连蛋白包被区域内，使用微量移液器调整位置，并在37°C和5%二氧化碳条件下过夜培养。接下来，将至少2毫升无血清培养基加入一支无菌的15毫升离心管中。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下过夜培养试管时，保持管盖略微松开，以允许培养基的pH值进行调整。过夜培养后，从三个培养物中选择三个状态最佳的神经嵴细胞培养物，且每个至少具有一侧长而直的边缘。选取其中一个用于加载第一个腔室，其余放回培养箱中以备后续使用。然后使用棉签，在一个经改造的西格蒙德小室的储液槽周围区域及桥接部位均匀涂抹一层薄薄的凡士林。接着用钨针轻轻将神经管从含有选定神经嵴细胞培养物的盖玻片上移除，使周围的神经嵴细胞仍附着在纤维连接蛋白涂层上。用实验室标记笔在培养皿上做标记，以记录神经嵴细胞培养物最平直边缘的朝向。接下来，将几滴预孵育的培养基滴加到改良Zigmund小室的桥部。然后用精细镊子夹起盖玻片，用Kimwipe纸轻轻蘸去盖玻片边缘的大部分旧培养基，立即将其放置在改良Zigmund小室上，使待拍摄的直线神经嵴细胞边缘位于桥的中央，并大致与桥的储液槽边缘垂直。使用倒置显微镜，将神经嵴细胞的直线边界移至最靠近储液池的桥的一侧。这将使疑似趋化因子包含在内，并更精确地使神经嵴细胞的直线边界与桥和储液池边界相互垂直。现在小心而稳固地按压盖玻片，将其插入齐格蒙德小室的石蜡油中，确保其完全密封在小室上。然后在盖玻片边缘涂抹额外的凡士林，以进一步确保其密封良好。再次调整神经嵴细胞边界的倾斜角度，以校正封片过程中可能发生的任何位移。接下来，将约 300 微升预温育的培养基吸入一支 1 毫升注射器中。使用25号、1.5英寸长的针头。将培养基注入不含有任何趋化因子的储液槽中，直至注满，注意避免在储液槽中产生气泡。然后在装载下一个储液槽之前，用足量的凡士林将两侧的储液槽密封。现在用一支新的注射器吸取300 µL含有目标趋化因子的预孵育培养基，以相同方式将培养基注入对侧的储液槽中。再次用凡士林仔细密封储液槽。将加样后的Sigmund小室在37摄氏度下孵育1小时，然后再开始成像。随后，在约37摄氏度的条件下孵育，以每92秒为间隔，对神经嵴细胞培养物中最平直的边缘进行为期3小时的成像观察；作为对照，加载另外两个最佳神经嵴细胞培养物的Zigmund小室，操作方式如前所示。使用适当的对照处理来填充储液池并预处理微流控桥。使用 ImageJ 手动追踪插件沿培养区域的直线边界追踪外周神经嵴细胞的迁移。使用趋化性与细胞迁移分析插件分析所获得的迁移轨迹的各种参数。通过将神经管过夜培养并获得具有至少一条长而直边界的神经嵴细胞培养物，从而制备细长的躯干神经嵴细胞培养样本，并从中挑选适合实验的培养物。选取其中一个培养物的最长直边界，将其垂直于桥接储液池的边界放置，从而使其与后续施加梯度的方向平行。首先加载不含疑似化学趋化因子的储液池（此处用减号表示），并进行密封。然后将另一储液池加入用加号表示的疑似趋化吸引剂，并对沿先前选定边界分布的周围神经嵴细胞进行封固，随后使用 ImageJ 的手动追踪插件对这些细胞进行成像和追踪。根据所获得的追踪数据，可评估细胞在施加浓度梯度下的多种迁移特征，如本图所示。例如，可通过将细胞在 x 轴方向上的位移除以其迁移的总距离，来计算趋化性指数。此处所示的细胞轨迹图展示了所有被追踪细胞的趋化吸引反应。每条红色轨迹代表一个向含有疑似趋化因子的储液池迁移的细胞的运动路径。在本图中，红色轨迹的数量明显多于黑色轨迹。在另一次实验中，验证了经过改造的西格蒙德小室维持分子浓度梯度的能力。将 Alexa Fluor 488 IGM 偶联物加入左侧储液池，并在不同时间点测量桥接区域的荧光强度。该浓度梯度至少维持了 26 小时。观看视频后，您应能够充分理解如何利用改良的 Zigmond 小室实验，分析某种分子在离体躯干神经嵴细胞培养物中诱导趋化性及其他迁移行为的能力。

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科研

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Neuroscience

神经科学

躯干神经嵴细胞迁移使用一个修改过的Zigmond室法分析

延时成像技术用于三维组织培养，可研究源自神经节隆起的单个细胞对大脑皮层分级蛋白提取物的迁移行为反应。...

神经节隆起培养物中生成细胞的迁移行为

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通过跨物种移植分析神经嵴细胞的迁移与分化

在本实验方案中，我们演示了如何构建定制腔室，以施加直流电场，从而实现对成年脑源性神经前体细胞在电趋化过程中细胞体迁移的延时成像观察。...

一种用于分析神经前体细胞在体外施加直流电场中迁移动力学的电趋性实验方法

颅部间充质经历显著的形态发生运动，这可能为神经褶的抬升提供驱动力1,2。在此，我们描述一种简单的ex...

一种用于评估颅部间充质细胞行为的组织块培养实验方法

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通过Zebrafish克隆细胞分析可视化胚胎下颌软骨细胞的嵌合与定向增殖

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分析 体内 利用细胞移植和延时成像技术研究斑马鱼胚胎中的细胞迁移

本方案详细介绍了一种可定制的方法，用于测量细胞在趋化因子作用下的迁移行为，该方法也可用于测定药物从聚合物基质中扩散的速率。...

一种可定制的细胞迁移测量装置

结合激光扫描显微镜的先进光学技术与长波长多光子荧光激发，对 Tg(sox10:EGFP) 和 Tg(foxd3:GFP)...

多光子延时成像实时可视化发育过程：斑马鱼胚胎中迁移性神经嵴细胞的可视化

本方案描述了从小鼠模型中分离和培养颅神经嵴细胞的方法，主要用于细胞迁移研究。我们介绍了所使用的活体成像技术，以及对细胞运动速度和形态变化的分析方法。...

小鼠颅神经嵴细胞的分离、培养及分析：用于研究神经嵴细胞脱离与迁移

该多功能实验方案描述了通过切除鸡胚头部神经褶来分离迁移前神经嵴细胞（NCCs）的方法。将神经褶外植体接种并培养后，迁移期的神经嵴细胞会从中迁移而出，从而可在简化的二维环境中对细胞形态和迁移行为进行评估。...

鸡颅神经嵴细胞培养物的制备与形态学分析

本方案概述了一种 体外 适用于参与迁移实验的分子功能分析 体内...

体外 透明质酸富集的细胞外基质对神经嵴细胞迁移影响的研究

学习使用改良Zigmond室法分析躯干神经嵴细胞迁移，通过建立分子梯度区分趋化作用与其他迁移反应。该方法成本低廉，适用于发育生物学研究。

利用改良的齐格蒙德小室法分析躯干神经嵴细胞迁移

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