躯干神经嵴细胞迁移使用一个修改过的Zigmond室法分析

该程序的总体目标是评估分子在外植的树干神经嵴细胞中引发趋化性和其他迁移反应的能力。这是通过首先分离大约 8 到 15 个体节长度之间的躯干水平神经管，然后将每个神经管在单独的纤连蛋白涂层盖玻片上培养过夜以允许神经嵴迁移来实现的。接下来，选择最佳的神经嵴培养物。

从培养物中取出神经管，并将包含培养物的盖玻片安装在改良的 zigmund 室上，使培养物的最直边界平行于要应用于整个培养物的分子梯度向量。第三步是在整个培养物中产生分子梯度，然后拍摄外周神经嵴细胞沿先前选择的培养物直线边界的迁移。最后一步是使用 Image J 软件跟踪和分析沿培养物选定边界定位的外周神经嵴细胞的迁移。

最终，通过分析获得的细胞轨迹数据，可以确定所选分子是否可以改变细胞方向性或其他迁移特性，例如速度。与 Boyden 室测定等现有技术相比，该技术的主要优点是成本非常低。该方法可用于使用延时成像分析原代表面培养物外围已经极化细胞的迁移。

56 摄氏度下将雏鸡蛋孵化 38 小时后，将鸡蛋从孵化器中取出，用 70% 乙醇轻轻喷洒，然后在鸡蛋干燥时让鸡蛋干燥。用 Chick ringer 溶液填充一个无菌塑料培养皿，并对玻璃托盘进行紫外线消毒。用 dis displays 填充一个 5 厘米的玻璃培养皿。

现在将鸡蛋打开放入紫外线消毒的玻璃托盘中。首先用弯曲的剪刀剪开胚胎的血岛，从蛋黄中提取每个胚胎。然后用钝钳，通过胚胎的额外胚膜夹起胚胎，并将胚胎放入准备好的含有振铃器的培养皿中。

接下来，选择介于 hamburger 和 Hamilton 之间的大约 9 个胚胎。第 15 至 17 阶段用钨针切断 10 螨之前的任何胚胎组织，并从第五个新形成的螨开始去除所有绳状胚胎组织。然后将多余的胚胎膜修剪到距离胚胎约 2 毫米的位置。

将分离的胚胎躯干放在 dis bays 中，并在胚胎躯干孵化时在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 1 小时 15 分钟。准备六张盖玻片进行培养。首先用 70% 乙醇冲洗并晾干。

然后使用实验室记号笔，在每个盖玻片的中心画一个直径约为 1 厘米的圆圈，以便以后识别每个盖玻片同一面上的纤维蛋白连接涂层。在画的圆圈外写一个不对称的单词或符号，以便于识别盖玻片的顶部和底部。现在将每个盖玻片放入单独的 40 x 10 毫米无菌培养皿中，标记面朝下，让培养皿在杀菌紫外线灯下打开放置 10 分钟。

然后将 60 微升纤连蛋白涂抹到盖玻片的无标记表面，在 1 厘米圆圈内，确保圆圈的整个区域都被涂覆。将培养皿放入 37 摄氏度的培养箱中 30 分钟。孵育期后，小心地从每个盖玻片中吸出细小的 fin。

接下来，向 FI nin 包被区域添加 250 微升培养基。盖玻片，然后再次孵育盖玻片，直到分离出神经管。在孵育盖玻片时，用 L 15 培养基填充 5 厘米的玻璃培养皿。

现在将所有孵育的胚胎树干转移到准备好的培养皿中。用细镊子和锋利的舌头和针头沿着神经管的边界小心地切开神经管和体节，解剖出神经管。从培养箱中取出盖玻片。

选择六个最长和最直的神经管，然后使用装有培养基的微量移液器吸头，将一个神经管转移到六个盖玻片中的每一个上。使用微量移液器确保每个神经管位于其各自盖玻片的纤连蛋白涂层区域内，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育过夜。接下来，将至少 2 mL 不含血清的培养基放入无菌 15 mL 离心管中。

试管在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育过夜，以调整培养基的 pH 值，同时稍微拧开犊牛。过夜培养后，选择三种最佳神经嵴细胞培养物，这些细胞培养物在三种培养物中至少具有一个长直边。选择一个用于加载第一个腔室，然后将其他放回培养箱以备后用。

然后使用我们的棉签，在一个改良的 sigmund 室的储液罐和桥梁周围区域涂抹一层薄薄的均匀凡士林。接下来用钨针，从含有所选神经嵴细胞培养物的盖玻片上轻轻地取出神经管，留下周围的神经嵴细胞附着在纤连蛋白外壳上。用实验室记号笔标记培养皿，以记住神经嵴细胞培养物最直边界的方向。

接下来，将几滴预孵育的培养基滴到改良的 Zigmund 腔室的桥上。然后用细镊子拿起盖玻片。用 Kim 抹布轻拍盖玻片的边缘以去除大部分旧培养基，并立即将盖玻片放在改良的 Zigmund 室上，以便要拍摄的笔直神经嵴细胞边界以桥的长度为中心，并大致垂直于桥储液器边界。

使用倒置显微镜，将笔直的神经嵴细胞边界移动到最靠近储液器的桥一侧。这将包含可疑的化疗机智，并更精细地对齐垂直于桥储液库边界的笔直神经嵴细胞边界。现在小心但牢固地按下盖子，滑入 Zigmund 腔室上的凡士林中，确保它完全密封在腔室上。

然后沿着盖玻片的边缘放置额外的凡士林，以进一步确保其气密性。再次调整神经嵴单元边界的角度，以校正天花板过程中的任何移动。接下来，将大约 300 μL 的预孵育培养基装入 1 mL 注射器中。

带有 25 号 x 1.5 英寸的针头。将培养基注入储液槽中，在满之前不会包含任何化疗节拍。小心不要在储液罐中产生任何气泡。

然后在加载下一个储液器之前，用足量的凡士林塞住储液罐的两侧。现在在第二个注射器中加入 300 微升预孵育培养基，其中包含所需的化疗节拍。然后以相同的方式将培养基注入对面的储液槽中。

再次，小心地用凡士林密封储液罐。在拍摄前将加载的 Sigmund 室在 37 摄氏度下孵育一小时后。然后，在大约 37 摄氏度图像下孵育时，神经嵴细胞培养物的最直边界以第 92 次间隔孵育 3 小时，用于对照，加载包含其他两个最佳神经嵴细胞培养物的 zigmund 室，如刚才所示。

使用适当的控制处理来填充储液罐并灌注桥梁。使用 image J 手动 trackin 插件跟踪外周神经嵴细胞沿培养物直线边界的迁移。使用趋化性和迁移工具插件分析获得的迁移轨迹的各种参数。

通过神经管过夜培养制备细长的躯干神经嵴细胞培养物，并选择具有至少一个长直边界的所得神经嵴细胞培养物进行实验。然后将一种选定培养物的最长直线边界垂直于桥式储层边界，因此平行于未来应用梯度的向量。首先加载并密封不包含此处以减号表示的疑似化疗引诱剂的储液器。

然后，在另一个储液器中加载用加号表示的可疑化疗引诱剂，然后沿先前选择的边界密封的外周神经嵴细胞成像，并使用图像 J 的手动跟踪插件进行跟踪。例如，可以通过将沿 x 轴的细胞位移除以它迁移的总距离来得出趋化性指数。此处显示的细胞轨迹图证明了所有跟踪细胞的有吸引力的响应。

每个红色轨迹都是细胞向载有可疑化疗引诱剂的储液库迁移的轨迹。在此图中，与黑色相比，红色轨道的数量要多得多。在另一项测试中，验证了改进的 sigmund 室维持分子梯度的能力。

将 Alexa Fluor 4 88 IGM 偶联物添加到左侧储液槽中，并在不同时间测量桥上的荧光强度。梯度保持至少 26 小时观看视频后，您应该很好地了解如何使用改良的 Zigmund 室测定法分析分子在外植的躯干神经嵴细胞培养物中引发趋化性和其他迁移行为的能力。