从快速荧光成像在分子扩散法对活细胞的膜在商业显微镜
2014年10月9日
质膜蛋白和脂质的空间分布和时间动力学是生物学中的一个热门话题。在这里，这个问题通过时空图像波动分析来解决，该分析在概念上提供了相同的单粒子跟踪物理量，但它使用小分子标记和标准显微镜设置。
该程序的总体目标是测量脂质和蛋白质在活细胞膜中的扩散规律以做到这一点。首先，通过对纳米荧光珠进行成像来校准显微镜的点扩散函数。接下来，制备基于脂质体的载体，包括荧光标记的目标分子，并通过转染或直接掺入引入活细胞。
通过全内反射荧光显微镜对活细胞质膜进行快速成像。最后，计算相关函数，并通过高斯拟合提取分子扩散律。生成的数据。
确定所研究的脂质或蛋白质的运动模式。与光漂白方法或经典单点荧光相关光谱法相比，该技术的主要优点是它允许测量分子扩散定律。我们了解该系统的优先知识。
也与传统的单粒子跟踪方法相反。在这里，测量多位移，无需提取粒子轨迹。因此，这种金属可以很容易地与相对可信和致密的分子结合使用，例如，基因编码的荧光蛋白。
总的来说，这种方法可以帮助回答细胞分子生物学领域的关键问题，例如蛋白质或脂质运动如何调节质膜结构和功能组织，这些和相关问题的答案将提供给所有人，并且仅使用商用显微镜，zo 将演示整个过程， 实验室的一名博士生。通过校准成像系统的点扩散函数来开始此协议。首先，将 10 μL 荧光珠溶液稀释在 90 μL 蒸馏水中，之前添加到 500 μL 离心管中。
使用手术刀在桑拿浴中对溶液超声处理 20 分钟，切下一块 1 厘米见方的 3%AGA 玫瑰凝胶，然后将其放入培养皿中。将 10 μL 稀释的荧光珠溶液沉积在凝胶顶部。然后用镊子将凝胶片倒置在 2 厘米的玻璃培养皿中。
同样，使用镊子。向下推凝胶以分散液滴。接下来打开采集设置，它由一台商用全内反射荧光显微镜组成。
配备培养箱和快速 E-M-C-C-D 相机，连接到运行 li a 应用程序套件的计算机、高级荧光软件和/或 Solis 图像采集软件。使用 I 件和透射光将样品放在显微镜载物台上的支架中。专注于凝胶的边界。
然后将凝胶置于物镜的中心并调整焦距以开始激光对准程序，在 Leica 应用程序套件中，高级荧光软件选择自动对准并遵循自动对准程序。在 AND / 或 Solis 采集软件中对准激光器后，单击设置按钮。将打开一个窗口。
将摄像机曝光设置为 100 毫秒，EM 增益为 1000，重复为 100，然后选中帧传输复选框。然后单击 auto save 窗口并插入实验的名称。查找具有孤立单个点的视野。
专注于亮点，这通常代表珠子聚集体。然后获取 100 帧。重复此步骤 5 到 6 次，以获取多个单个点的图像。
将采集的序列导入数据处理程序，例如 MATLAB，并对堆栈进行时间平均。然后显示测得的平均强度图像。放大一个明亮的小荧光点，并粗略地将中心识别为该点最亮的像素。
最后，选择要在粒子周围绘制的感兴趣区域的大小，通常为一微米，以使用高斯函数拟合选定的强度分布。选择命令 gause fit。检查获得的残差以验证拟合的优度。
最后，按照随附文档中的说明校准相机。校准系统后，就该标记细胞以进行图像采集了。通过将 1 毫克 DOPE、1 毫克 D-O-T-A-P 和 1 毫克 PPE ADO 4 88 溶解在含有 1 毫升氯仿的单独微量离心管中，开始制备脂质掺入所需的脂质体。
接下来，将 0.5 毫升 DOPE 和 D-O-T-A-P 溶液与 25 微升 PPE ATO 4 88 溶液混合。将试管放入离心蒸发器中，并以 280 gs 开始离心。启动真空泵并让其旋转 24 小时。
第二天，向试管中加入 0.5 mL 20 mL的 heis 缓冲液，涡旋 15 分钟。然后将试管放入声波槽中，在 40 摄氏度下超声处理 15 分钟。为了制备细胞，用 10 毫升 PBS 洗涤 P 100 培养皿的融合中国仓鼠卵巢或 CHOK one 细胞 3 次。
然后加入 1 毫升胰蛋白酶，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 5 分钟。孵育后，加入 9 毫升补充有 10% FBS 的 D-M-E-M-F 12，以悬浮细胞接种 150 微升含有该细胞的溶液。在含有 800 微升相同培养基的 22 毫米玻璃底培养皿中。
将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 24 小时。对于脂质掺入，用 500 μL 无血清培养基替换细胞培养基，并孵育 30 分钟。孵育后，加入 2 微升脂质体溶液，再孵育 15 分钟。
然后用 PBS 洗涤细胞并添加新的 DM EMF 12。在成像前，至少在实验前 12 小时，打开显微镜培养箱，使显微镜载物台和光学组件达到实验温度。这个过程最困难的步骤是收购。
为了确保成功，请务必优化系统的每个采集参数。正在研究中。实验当天，打开显微镜，等待相机达到工作温度。
为了进行实验，我们将使用两台相机。相机 1 将用于成像，相机 2 将用于选择像元。此配置将允许在软件中实现最快的采集时间。
设置透射光成像的参数。输入 20 毫秒 对于曝光时间，请输入 1 作为两台相机的 EM 增益。然后在软件中打开对比模式窗口并向左。
单击 BF 以选择明场选项。将样品放入支架中，同时通过目镜观察样品。聚焦样品。
然后手动将光线发送到相机 1 并轻轻推动狭缝，以便仅照亮要成像的 ROI。接下来，将一个单元格移动到所选区域，并使用软件将光线发送到相机 2。然后在软件中，绘制 ROI 以生成参考。
首先，要通过软件对准激光器，请选择 auto align。然后，要开始自动对齐程序，请选择 enable collimator（启用准直器）。然后打开顶部的培养箱并准直激光束。
当激光器在软件窗口左下角对齐时，单击 70 按钮将穿透深度设置为 70 纳米。这将对应于 Leica 应用程序套件中激光在底部玻璃上的入射角约为 70 度。高级荧光软件曝光时间文本框。
在 EM 增益文本框中输入 70 毫秒。输入 1000 可在摄像机 2 上执行相同的作。打开设置窗口并在相应的文本框中输入相同的数字。
接下来单击实时按钮。荧光将被发送到相机 1，样品的图像将出现在屏幕上。移动样品，直到荧光细胞到达感兴趣的参考区域。
然后按下显微镜机身前部的按钮，将光线发送到相机 2，并准确移动 Z 位置轮以聚焦在 and or 唯一软件中的细胞膜上。打开设置窗口，将可实现的最小曝光时间 1000 EM 增益裁剪传感器模式 10 设置为第五次重复，并设置自动保存选项以开始采集图像系列。单击软件的相机图标并等待采集完成。
然后打开设置窗口，禁用 EM 增益并从裁剪模式选项中删除复选框。在采集过程中，相机的温度通常会升高约 2 到 3 度。因此，在从新电池中采集图像之前，请等待达到最佳工作温度。
同样，成像完成后，请按照随附文档中的说明计算成像的均方位移，以获得目标分子的荧光标记变体。CHOK one 细胞用 ADO 4 88 PPE 标记或转染转入受体或 T-F-R-G-F-P，并通过 TIRF 成像，如本视频所述。从这里可以看出，ADO 4 88 PPE 的测量扩散定律是平坦的，表明在用 T-F-R-G-F-P 转染后，受激发射耗竭荧光、相关光谱或稳态 FCS 测量显示的大部分自由扩散，测得的 T-F-R-G-F-P 扩散定律最初是平坦的，保持在 100 纳米的平均分子位移以下，平均表观扩散系数约为每秒 0.7 平方微米。
随后，表观扩散率迅速降低至每秒 0.2 平方微米。该值通常由衍射极限 FCS 测量。有趣的是，如最后一个例子所示，即使使用相对暗淡和密集的标记（如 GFP），该方法也可以以几十纳米的分辨率轻松测量平均分子位移。
此外，表观扩散系数开始降低的空间尺度将膜骨架部分限制的蛋白质特征大小设定在 120 纳米左右，与之前的估计一致。一旦掌握了数据分析的过程，就可以在几分钟内完成采集。我们相信这项技术将为细胞和分子生物学领域的研究人员铺平道路，以轻松、定量地探索生命样本中蛋白质和脂质扩散的时空调控。
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概述
本研究聚焦于使用时空图像波动分析法对活细胞膜中脂质和蛋白质的扩散进行研究。该方法允许使用标准显微镜设置来测量分子动力学。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 生物物理学
- 显微技术
背景
- 理解膜蛋白和脂质的动力学对于细胞生物学至关重要。
- 扩散定律为细胞过程提供了洞察。
- 标准显微镜设置可用于高级分析。
- 时空图像波动分析是该领域的一种新方法。
研究目的
- 测量活细胞膜中脂质和蛋白质的扩散定律。
- 利用小分子标记进行追踪。
- 增进对膜动力学的理解。
使用的方法
- 使用荧光珠校准点扩散函数。
- 准备带有荧光标记分子的脂质体载体。
- 通过转染或直接掺入将载体引入活细胞。
- 使用全内反射荧光显微镜对质膜进行快速成像。
主要结果
- 成功测量分子扩散定律。
- 计算相关函数以分析扩散。
- 使用高斯拟合提取扩散数据。
- 对膜蛋白和脂质行为的洞察。
结论
- 该研究提供了一种可靠的分析膜动力学的方法。
- 研究结果有助于理解细胞过程。
- 未来的应用可能会增强细胞生物学研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative mapping of protein and lipid diffusion on live cell membranes is critical for de-risking early target validation and understanding membrane-associated mechanisms in drug discovery. This high-resolution imaging workflow enables predictive confidence in molecular mobility assessments, supporting mechanistic triage and portfolio prioritization. The approach leverages standard commercial microscopy, facilitating broad adoption across discovery teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of membrane protein and lipid mobility relevant to target function.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing free versus confined diffusion modes.
- Provides nanometer-scale quantitative data for functional target validation.
- Facilitates rapid hypothesis testing on membrane organization and dynamics.
Screening & Assay Development
- Prepares validated live-cell systems for downstream screening of modulators affecting membrane dynamics.
- Delivers reproducible, quantitative diffusion metrics for assay standardization.
- Enables high-content imaging readouts suitable for scalable compound evaluation.
- Supports platform reuse with genetically encoded or chemical fluorescent labels.
Translational & Preclinical Research
- Aligns membrane diffusion measurements with disease-relevant cellular models.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of membrane-targeted interventions.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative mobility thresholds.
- Offers predictive de-risking for membrane-associated drug targets.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging-based diffusion analysis fits at the interface of early discovery and lead identification, bridging mechanistic target validation with assay development and translational research.
- Discovery Biology: Quantifies molecular mobility to clarify pathway involvement and biological de-risking.
- Screening: Provides standardized, reproducible diffusion metrics for compound screening readiness.
- Analytics: Outputs mean square displacement and apparent diffusivity for robust condition comparison.
- Translational Research: Connects membrane dynamics to disease-relevant phenotypes when supported by model selection.
- Enterprise Reuse: Employs commercial microscopy and flexible labeling for broad R&D applicability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes high-resolution diffusion measurements for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of membrane-associated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in advanced fluorescence microscopy and quantitative image analysis.
- Needs access to commercial TIRF microscopes and compatible analytical software.
- Demands cross-team standardization of imaging parameters and data processing workflows.
- Adaptable to various cell types and labeling strategies with appropriate optimization.
- Dependent on careful calibration and acquisition parameter optimization for reliable outputs.
