从快速荧光成像到商用显微镜下活细胞膜上的分子扩散规律研究

本实验的总体目标是测量脂质和蛋白质在活细胞膜中的扩散规律。为实现这一目标，首先通过成像纳米级荧光微珠来校准显微镜的点扩散函数。随后，制备包含荧光标记目标分子的基于脂质体的载体，并通过转染或直接整合的方式将其引入活细胞中。

通过全内反射荧光显微镜对活细胞质膜进行快速成像。最后，计算相关函数，并通过高斯拟合提取分子扩散规律。所得数据。

确定所研究的脂质或蛋白质的运动模式。与传统的光漂白后荧光恢复方法或经典的单点荧光相关光谱法相比，该技术的主要优势在于能够测量分子扩散规律。我们对系统具有先验知识。

此外，与传统的单粒子示踪方法不同，此处无需提取粒子轨迹即可测量分子位移。因此，该方法可轻松结合相对较大且密集的分子使用，例如基因编码的荧光蛋白。

总体而言，该方法有助于回答细胞与分子生物学领域的关键问题，例如蛋白质或脂质的运动如何调控质膜的结构及其功能组织。对这些问题及相关问题的解答将向所有人开放，并且仅需使用一台商用显微镜即可实现。整个实验流程将由本实验室的博士研究生 Zo 进行演示。开始本实验方案前，首先校准成像系统的点扩散函数。取一个 500 微升离心管，预先加入 90 微升蒸馏水，再将 10 微升荧光微珠溶液加入其中并混匀。

将溶液置于水浴超声仪中进行超声处理20分钟。使用手术刀切下一平方厘米大小的3%AGA玫瑰凝胶，并将其放入培养皿中。取10微升稀释后的荧光微球溶液，滴加到凝胶表面。然后使用镊子将凝胶块翻转，置于直径为2厘米的玻璃培养皿中。

再次使用镊子，将凝胶片压下以分散液滴。接下来启动采集装置，该装置由一台商用全内反射荧光显微镜组成。

配备一个培养箱，以及一台连接到计算机的高速E-M-C-C-D相机，该计算机运行着li a应用套件、先进的荧光软件和/或Solis图像采集软件。使用I型部件和透射光将样品放置在显微镜载物台的样品 holder 上。聚焦于凝胶的边缘。

然后将凝胶置于物镜正下方，调节焦距以在 Leica 应用套件的高级荧光软件中启动激光校准程序，选择自动校准并按照自动校准流程操作。在激光完成校准后，于 and 或 Solis 采集软件中点击设置按钮，此时将打开一个窗口。

将相机曝光时间设置为 100 毫秒，EM 增益设为 1000，重复次数设为 100，并勾选帧转移复选框。然后点击自动保存窗口，输入实验名称。寻找一个具有孤立单个斑点的视野。

聚焦于一个明亮的点，该点通常代表一个微珠聚集体。然后采集100帧图像。重复此步骤五到六次，以获取多个单个点的图像。

将采集到的序列导入 MATLAB 等数据处理程序中，并对图像序列进行时间上的平均。然后显示测得的平均强度图像。放大一个明亮且较小的荧光点，大致将最亮的像素确定为该点的中心。

最后，选择您希望在颗粒周围绘制的兴趣区域大小，通常为一微米，以便用高斯函数拟合选定的强度分布。选择“gause fit”命令，并检查获得的残差以验证拟合的优度。

最后，按照随附文档中所述方法校准相机。系统校准完成后，即可开始标记细胞以进行图像采集。首先准备脂质掺入所需的脂质体：分别将一毫克DOPE、一毫克D-O-T-A-P和一毫克PPE ADO 4 88各自溶于含有1毫升氯仿的微量离心管中。

接下来，将0.5毫升的DOPE溶液和0.5毫升的D-O-T-A-P溶液与25微升的PPE ATO 488溶液混合。将试管放入离心蒸发仪中，在280 ×g条件下开始旋转。启动真空泵，持续旋转24小时。

第二天，向离心管中加入 0.5 毫升 20 毫摩尔的 heis 缓冲液，涡旋振荡 15 分钟。然后将离心管放入超声水浴仪中，在 40 摄氏度下超声处理 15 分钟。为制备细胞，用 10 毫升 PBS 将一皿 P 100 大小的汇合状中国仓鼠卵巢细胞（CHO-K1 细胞）洗涤三次。

然后加入1毫升胰蛋白酶，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育5分钟。孵育结束后，加入9毫升添加了10%胎牛血清的D-M-E-M-F 12培养基以重悬细胞，取150微升含细胞的溶液，接种于含有800微升相同培养基的22毫米玻璃底培养皿中。

将细胞在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育24小时。进行脂质掺入时，将细胞培养基更换为500微升无血清培养基，并孵育30分钟。孵育结束后，加入2微升脂质体溶液，再继续孵育15分钟。

然后用 PBS 清洗细胞，并加入新的 DMEM/F12 培养基。在实验前至少 12 小时进行成像前，打开显微镜的培养箱，使显微镜载物台和光学部件达到实验所需温度。该实验过程中最困难的步骤是图像采集。

为了确保实验成功，务必针对所用系统优化每一个采集参数。在实验当天，打开显微镜，并等待相机达到工作温度。

为了进行实验，我们将使用两台相机。相机一用于成像，相机二用于选择细胞。这种配置可在软件中实现最快的数据采集速度。

设置透射光成像的参数。将曝光时间设为 20 毫秒，两台相机的 EM 增益均设为 1。然后在软件中打开对比度模式窗口并点击左侧。

单击 BF 以选择明场模式。通过目镜观察样本时，将样本放入 holder 中。调节至样本清晰对焦。

然后手动将光线导向相机一，并轻轻推动狭缝，使仅需成像的感兴趣区域（ROI）被照亮。接着，将一个细胞移入选定区域，并通过软件将光线导向相机二。随后在软件中绘制一个感兴趣区域（ROI）以生成参考图像。

首先，通过软件选择“自动对准”以校准激光。然后，选择“启用准直器”以启动自动对准程序。接着打开顶部的培养箱，并对激光束进行准直。

当激光在软件窗口左侧的左下角对齐后，单击 70 按钮，将穿透深度设置为 70 纳米。在 Leica 应用套件中，这对应于激光在底部玻璃上的入射角约为 70 度。高级荧光软件曝光时间文本框。

在EM增益文本框中输入70毫秒。在相机二上输入1000以执行相同操作。打开设置窗口，并在相应的文本框中输入相同的数值。

接下来点击“实时”按钮。荧光信号将被传送至相机一，样品的图像将显示在屏幕上。移动样品，直至一个荧光细胞进入参考兴趣区域。

然后按下显微镜主体前方的按钮，将光线导入相机二，并精确调节Z轴位置旋钮，在and或sole软件中对准细胞膜。打开设置窗口，将最小曝光时间设为在1000倍EM增益、裁剪传感器模式下的可实现值，重复次数设为10的5次方，并设置自动保存选项以开始采集图像序列。点击软件中的相机图标，等待采集完成。

然后打开设置窗口，关闭EM增益，并取消勾选裁剪模式选项。在采集过程中，相机温度通常会上升约两到三度。因此，在对新细胞进行成像之前，需等待相机达到最佳工作温度。

同样，一旦成像完成，需按照随附文档中的说明，从成像数据计算均方位移，以获得目标分子的荧光标记变体。CHO-K1细胞要么用ADO 488 PPE进行标记，要么转染转铁蛋白受体（TfR）或TfR-GFP，并按本视频所述方法通过全内反射荧光显微镜（TIRF）进行成像。如图所示，ADO 488 PPE测得的扩散规律呈平坦状，表明其主要为自由扩散，这与先前采用受激辐射耗尽荧光相关光谱（STED-FCS）或稳态FCS在转染TfR-GFP后所观察到的结果一致。转染TfR-GFP后，测得的TfR-GFP扩散规律初始阶段呈平坦状，在平均分子位移低于100纳米范围内，其表观扩散系数平均约为0.7 µm²/s。

随后，表观扩散系数迅速下降至每秒0.2平方微米，该数值通常由衍射受限的荧光相关光谱（FCS）测得。值得注意的是，如最后一个示例所示，即使使用GFP等相对较暗且密集的标记物，本方法仍可轻松测量分子平均位移，其分辨率可达几十纳米。

此外，表观扩散系数开始下降的空间尺度反映了膜骨架对蛋白质的局部限制特征尺寸，约为120纳米，与先前的估计结果一致。一旦掌握了数据分析方法，数据采集可在数分钟内完成。我们相信，该技术将为细胞与分子生物学领域的研究人员提供一条便捷且定量研究活体样品中蛋白质和脂质扩散时空调控的新途径。