Name: 从快速荧光成像在分子扩散法对活细胞的膜在商业显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 10 s
Description: 学习使用全内反射荧光显微镜测量活细胞膜中脂质和蛋白质的扩散定律。该方法通过时空图像涨落分析，利用标准显微镜设备即可实现分子动力学的高精度定量研究。

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本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）P41-RRO3155 和 NIH P50-GM076516（资助对象：EG）以及锡耶纳山城基金会（Fondazione Monte dei Paschi di Siena）（资助对象：FB）提供资助。

1. 系统校准
<ol>
	<li>点扩散函数（PSF）校准
	<ol>
		<li>将10 µl的30 nm荧光微球溶液（约5 μM）用90 µl蒸馏水稀释，随后对溶液超声处理20分钟。剪取一块1 cm × 1 cm的3%琼脂糖凝胶，将10 µl上述溶液滴加在凝胶表面。将凝胶翻转，置于2 cm培养皿的底面玻璃上，轻轻挤压液滴使其铺展。</li>
		<li>打开采集设置，将样品放入样品 holder 中，设置相机曝光时间和 EM 增益（100 毫秒和 1,000 是合适的参数，但需根据系统情况进行优化），并等待相机冷却。</li>
		<li>将相机曝光时间设为100毫秒，相机EM增益设为1,000，采集模式设为帧转移，重复100次，并启用自动保存设置。</li>
		<li>使用目镜和透射光聚焦于凝胶边缘，然后将物镜移至凝胶中心，调节焦距并开始激光对准程序（在LAS AF中选择“TIRF setup”并按照自动对准程序操作）。</li>
		<li>寻找一个视野，其中包含分离的单个斑点，以较亮的斑点（通常代表微球聚集体）作为参考，精确对焦，采集100帧图像，并重复该步骤5至6次，以获取多个单个斑点。</li>
		<li>将采集的序列导入数据处理程序，并对时间序列进行平均（图1A）并选择一个孤立的微珠。注意选择最小的微珠，以避免颗粒聚集体。</li>
		<li>拟合选定的强度分布（单个微珠轮廓示例如下所示） 图1B) 使用“gaussfit”命令（位于Matlab材料中的ICS-Matlab工具）对高斯函数进行拟合。通过检查所得残差来验证拟合的优度（文中展示了拟合高斯曲线及其对应残差的一个示例） 图1B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>相机校准
	<ol>
		<li>打开相机并等待相机冷却。设置相机采集参数，即，对于所用相机，将曝光时间设为0.5毫秒，相机EM增益设为1,000，采集模式设为裁剪模式，ROI尺寸设为32 × 128，重复次数为10,000次），开始采集相机的背景信号。</li>
		<li>将获取的帧序列导入数据处理程序。计算并检查每个像素的平均强度，以确认所选芯片区域内的相机背景大致平坦。在裁剪模式下，针对每一帧去除最前面和最后面的若干行水平线（具体行数为3到10行，取决于感兴趣区域的大小），因为相机背景在边缘行通常存在偏差。</li>
		<li>创建所获取图像堆栈中数值（也称为数字灰度级，DL）的直方图（使用 Matlab 中的 'hist' 命令），并绘制结果频率的对数图（使用 Matlab 中的 semilogy 命令）。相机背景的 DL 分布示例如下所示： 图2. 
		注意：如果相机工作正常，图像将显示一个近似高斯峰形（在对数尺度下呈抛物线轮廓），代表与零光子对应的值的分布，随后是指数衰减（在对数尺度下为负斜率直线），代表与单光子对应的值的分布图2）。其中，高斯函数的中心和方差分别表示相机的偏移量和误差，而指数部分的衰减常数则表示相机为每个单光子所分配的检测极限（DL）的估计值。在Matlab中，请使用支持材料中脚本的“CalibrateCamera”部分。</li>
		<li>对所有选定的相机EM增益和增益重复该操作。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 标记细胞的制备
<ol>
	<li>为制备用于脂质掺入的脂质体36，分别将1 mg DOPE（1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺）、1 mg DOTAP（1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷）和1 mg PPE-ATTO488溶于1 ml氯仿中。取0.5 ml DOPE溶液、0.5 ml DOTAP溶液和25 µl PPE-ATTO488溶液混合，于真空条件下干燥24小时。加入0.5 ml 20 mM HEPES缓冲液，涡旋振荡15分钟，并在40 °C下超声处理15分钟。</li>
	<li>为准备细胞，用PBS清洗一片汇合的CHO-K1（中国仓鼠卵巢细胞）p100培养皿3次，加入1 ml胰蛋白酶，于培养箱中孵育5分钟。加入9 ml含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬脱落的细胞，并将150 µl细胞悬液接种至含有800 µl相同培养基的培养皿中。</li>
	<li>于37 °C、5% CO2条件下在培养箱中孵育24小时。进行脂质掺入时，将细胞培养基更换为500 µl无血清培养基；30分钟后加入2 µl脂质体溶液；15分钟后用PSB洗涤，并加入新的DMEM/F12培养基用于成像。</li>
	<li>进行转染时，按照Lipofectamine试剂说明书（生产商说明）使用TfR-GFP质粒对细胞进行转染，并在成像前于培养箱中孵育24小时。</li>
</ol>
3. 数据采集
<ol>
	<li>实验准备
	<ol>
		<li>为了使显微镜达到恒温状态，实验前24小时打开培养箱。</li>
		<li>为了实现最短的可达到的采集时间，请在裁剪传感器模式下工作（见引言），并使用第一台相机进行成像（相机1），第二台相机用于细胞选择（相机2）。装置配置示意图见补充材料 图 S1然后，打开显微镜以校准两台相机，并等待相机冷却。</li>
		<li>在两台相机上设置透射光成像的参数（即，曝光时间为20毫秒，EM增益为1）并将显微镜置于明场模式。</li>
		<li>将样品放入样品 holder 中，使用目镜进行聚焦，将光线导入相机 1，并轻轻推动狭缝，使光线仅照射到用于细胞成像的 ROI 区域（此处为 32 × 32 像素的 ROI）。</li>
		<li>移动选定区域中的一个细胞，并将光信号发送至相机2，然后在控制相机2的软件中绘制一个感兴趣区域（ROI）作为参考。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成像（图3A)
	<ol>
		<li>首先，根据您实验装置的流程调整TIRF激光。在我们的装置中，选择“TIRF设置”并启动自动对准程序。激光对准后，设置70 nm的穿透深度（约70°）。</li>
		<li>将相机1和相机2的曝光时间设置为70毫秒，EM增益设置为100；然后使用相机1选择一个细胞，将光线切换至相机2，并精确对焦细胞膜。将相机2的曝光时间设为最小值，EM增益设为1,000，启用裁剪传感器模式，105 重复并设置自动保存为 FITS 文件（Flexible Image Transport System，一种易于管理的格式）。</li>
		<li>开始采集以记录图像序列。释放增益（Gain）和裁剪模式（cropped Mode），以便在采集下一个细胞前进行温度稳定，然后重复最后两个步骤，共采集8-10个细胞。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 基于成像的均方位移计算（iMSD）
注意：以下方案可直接应用于原始数据。同时，整个方案也适用于在 Matlab 和 SimFCS 中模拟的数据采集。相应教程的链接可在“材料”部分找到。
<ol>
	<li>使用 Matlab 进行计算
	<ol>
		<li>使用 ImportImageSeries 脚本将获取的图像序列导入 Matlab。利用 mean 命令对前两个维度取平均，计算每幅图像在时间上的平均强度，并使用 plot 命令绘制所得向量。</li>
		<li>如果光漂白超过 10%，则舍弃该序列，或去除其前段部分；若低于 10%，可尝试通过从每幅图像中减去其平均强度来校正相关函数中的光漂白效应，方法如前所述37。</li>
		<li>在第三个维度上使用 mean 计算每个像素的平均强度，并查看所得图像。 
		注意：必须特别注意以避免产生伪相关。事实上，如先前对类似技术所示38，细胞边界以及离焦的囊泡可能引入强相关性。若平均图像显示存在细胞边界或离焦囊泡，应尝试排除相关区域，否则舍弃该次采集数据。为校正这些静止结构的影响，需从每个像素中减去其时间平均强度39。</li>
		<li>使用函数 CalculateSTICScorrfunc 计算时空相关函数（G(ξ,χ,τ)）。去除 G(ξ,χ,0)，因为在低光条件下，散粒噪声导致的相关性主导了 G(0,0,0)；探测器噪声主导了 G(±1,0,0)；而在 τ=0 时，曝光期间的粒子运动可能通过增大测量腰宽使 G(ξ,χ,τ) 发生形变（该效应在 τ>0 时消失）34。</li>
		<li>使用支持材料中的“LogBinStack”函数对 G(ξ,χ,τ>0) 进行对数时间 bin 平均，以降低噪声，然后使用材料中提供的 ICS-Matlab 工具中的“gaussfit”函数拟合所得的 G(ξ,χ,τ)，从而恢复 iMSD（结果数组的第二列）。</li>
		<li>将获得的腰宽 σ(τ)2（iMSD）随时间作图。若数据噪声过大，可尝试增加采集帧数、提高激光功率，或对更多 G(ξ,χ,τ) 进行平均。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 SimFCS 进行计算
	<ol>
		<li>使用 ImageJ 的 BioFormat 导入插件打开采集文件，并将采集序列保存为 Tiff 序列。</li>
		<li>打开 SimFCS，选择 RICS 工具，然后选择 文件&#62;导入多个图像（补充 图 S2）。</li>
		<li>选择 拟合，输入正确的采集参数，然后关闭拟合窗口（补充 图 S3）。</li>
		<li>选择 显示&#62;平均强度&#62;CH1，并检查是否存在光漂白现象（补充 图 S4）。</li>
		<li>若光漂白超过 10%，则舍弃该序列；若可能，可重新加载图像序列，但去除序列的前段部分。</li>
		<li>若漂白程度低于 10%，选择 工具&#62;iMSD&#62;设置参数，勾选“使用移动平均”，在左侧的 ROI 面板中设置用于移动平均的帧数，注意对应的时间应大于特征扩散时间（对于扩散速率为 1 µm2sec-1 的粒子，10 秒是一个合适的移动平均时间）。</li>
		<li>选择 工具&#62;iMSD&#62;计算 iMSD（补充 图 S5），然后从记事本中拟合并导出 iMSD（补充 图 S6）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 从扩散定律的计算 iMSD
<ol>
	<li>拟合前几个数据点以外推截距（σ02）（通常5个点已足够，但如果更多点呈现线性行为，也可纳入拟合），并将该值与先前测得的PSF2进行比较。若两者相近，则表明正在追踪孤立荧光分子的动力学行为；相反，如果σ02 >> PSF2，则应尝试提高采集速度，以确保没有隐藏的动力学过程存在34。</li>
	<li>利用公式3和公式4（见引言部分）计算表观扩散系数（Dapp）和平均位移（R）。</li>
	<li>绘制Dapp随R变化的关系图，以获得可与基于光斑变化的FCS测量结果相比较的扩散规律12（图3D）。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

单粒子追踪（SPT）是研究分子动力学最常用的方法之一，其显著优势在于能够测量单个粒子的运动轨迹。这使得研究人员能够在复杂系统中探测少数标记粒子的行为。然而，要实现这一优势，SPT通常需要探针密度较低且标记信号非常明亮。特别是，为了获得高时间分辨率（&#956;sec 范围）通常需要无机探针（例如， 量子点或金属纳米颗粒）：在这种情况下，需要进行复杂的制备、标记和系统导入步骤。与单粒子追踪（SPT）相比，本方法具有一些关键优势。首先，该方法可与荧光蛋白联用。因此，相较于SPT，由于所需光子数量更少，可在相同标记物上实现更高的时间分辨率。34更详细地说，这一特性使得时间分辨率能够被提升至10以下−3 即使在使用可编码荧光蛋白时，该时间尺度也能特异性地揭示膜组分的纳米级动态行为。最后值得注意的是，通过分析完整的时空关联函数即可描述分子扩散规律，而无需对每个分子进行单独追踪。
与基于STED的FCS进行比较也具有重要意义。在STED-FCS测量中，通过荧光信号的时间相关性来测量分子在不断减小的观测体积中的平...

自辛格（Singer）和尼科尔森（Nicolson）提出的原始“流动镶嵌”模型以来，过去几十年中，为了纳入细胞骨架和脂质区域日益凸显的作用，人们对细胞质膜的认识不断得到更新1,2。
最初通过光漂白后荧光恢复（FRAP）技术获得的观察结果显示，相当一部分膜蛋白是不可移动的3-5。尽管这些开创性研究提供了重要信息，但受限于FRAP装置在空间（微米级）和时间（秒级）分辨率上的相对不足。此外，由于FRAP是一种基于群体平均的测量方法，因此无法提供关于单个分子行为的信息。
在此背景下，使用极亮的标记物对单个分子进行特异性标记（从而能够逐个分子地研究扩散过程）的方法已取得显著成功。特别是，通过将单粒子追踪（SPT）技术的时间分辨率推进至微秒量级，Kusumi, et al. 揭示了脂质和蛋白质动力学中此前未知的特征，极大地推动了人们对肌动蛋白骨架在细胞膜生理中作用的认识6,7。这些发现催生了所谓的“栅栏与桩”模型，该模型认为脂质和蛋白质的扩散受到肌动蛋白骨架的调控。然而，为了充分获取SPT所提供的大量信息，必须解决诸多实验难题。特别是，标记过程通常包含多个步骤，如标记物的制备、纯化以及将其引入系统等。此外，为达到亚毫秒时间尺度，往往需要使用较大的标记物，如量子点或金属纳米颗粒，而在许多情况下，标记物导致靶分子交联的问题难以避免。最后，为满足统计学要求，需要记录大量轨迹，同时又必须保持标记物的低密度，以便实现单个粒子的追踪。
与单粒子追踪（SPT）相比，荧光相关光谱技术（FCS）克服了上述诸多局限，成为研究分子动力学的一种极具前景的方法。事实上，FCS即使在荧光信号较弱且标记密度较高的情况下也能有效工作，因而可用于研究瞬时转染细胞中荧光蛋白标记分子的动力学行为。此外，FCS可在较短时间内获得高统计量的数据。最后，尽管标记密度较高，FCS仍能提供单分子水平的信息。得益于这些优势，FCS是一种极为直接有效的方法，已被广泛应用于研究模型膜和活细胞中脂质与蛋白质的动力学8-10。为提升FCS揭示分子扩散细节的能力，研究人员已提出多种不同策略。例如，通过在不同大小的观测区域上进行FCS测量，可构建“FCS扩散定律”，从而揭示分子运动中隐藏的特征11,12。除了改变焦斑区域的尺寸外，还可将焦斑区域复制成多个13、在空间中沿直线移动14-20，或与高速相机联用21,22。利用这些“时空”关联分析方法，研究人员已在模型膜和真实生物膜上对多种膜组分的关键生物学参数进行了定量描述，从而加深了对膜结构空间组织特征的理解。
然而，在迄今为止描述的所有FRAP和FCS应用中，焦点区域的尺寸构成了空间分辨率的极限，无法克服。近年来已开发出多种超分辨率成像方法以突破这一限制。其中一些方法基于定位精度，例如随机光学重建显微镜（stochastic optical reconstruction microscopy, STORM）23,24、光激活定位显微镜（photoactivation localization microscopy, PALM）25、荧光PALM（fluorescence PALM, FPALM）26以及单粒子追踪PALM（single-particle tracking PALM, sptPALM）27。然而，这些方法每次成像都需要采集大量光子，因而将时间分辨率限制在至少数毫秒，从而限制了其在活体（in vivo）中的应用。
相比之下，通过受激发射损耗方法（STED）或可逆饱和光学荧光跃迁（RESOLFT）对荧光发射进行空间调制，为超分辨率成像提供了有前景的替代方案28,29。这些方法将观测体积的调控精度显著突破衍射极限，并可结合快速扫描显微镜与检测系统。结合荧光涨落分析，STED显微技术已实现对活细胞膜中脂质与蛋白质纳米尺度时空动态的直接探测30,31。
基于STED的显微镜可获得的相同物理量可通过改进的时空图像相关光谱法（STICS）得到32,33）方法，适用于利用商用显微镜研究活细胞中荧光标记的膜蛋白和/或脂质的动力学。本文所展示的实验方案包含若干步骤。第一步需对膜上目标区域进行快速成像。随后，利用所得的图像序列计算平均时空相关函数。通过对系列相关函数进行拟合，可直接从成像数据中获得分子的“扩散规律”，表现为表观扩散系数（D应用程序)-与- 平均位移曲线图。该图谱高度依赖于分子所处的环境，可直接用于识别目标脂质/蛋白质的实际扩散模式。
更详细地说，如先前研究所示34，所采集图像序列的时空自相关函数在很大程度上取决于图像序列中运动分子的动力学行为（请注意，同样的原理也可应用于线扫描采集，此时仅考虑空间的一个维度）。具体而言，我们将相关函数定义为：
<img fo:content-width="2.3in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq1.jpg" width="230" alt="时空相关函数方程，统计分析方法，强度相关。" data-altupdatedat="1787630408000">(1)
其中 <img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/xyt.jpg" width="50" alt="Intensity function I(x,y,t) formula, spatial temporal analysis, diagram, scientific research." data-altupdatedat="1787630408000"> 表示在位置 x、y 及时间 t 测得的荧光强度， <img fo:content-width=".08in" src="/files/ftp_upload/51994/e.jpg" width="8" alt="Static equilibrium diagram, ΣFx=0, ΣFy=0; vector force balance illustration, educational content." data-altupdatedat="1787630408000"> 和 <img fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/51994/x.jpg" width="10" alt="Chromatography diagram; DNA separation process; involves chromatography system for analysis." data-altupdatedat="1787630408000"> 表示距离 x 和 y 方向分别如下，<img fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/51994/t.jpg" width="10" alt="Tau symbol, used in equations and formulas, relevant to physics and engineering studies." data-altupdatedat="1787630408000"> 表示时间滞后，以及 <img fo:content-width=".2in" src="/files/ftp_upload/51994/brackets.jpg" width="20" alt="Bra-ket notation symbol; quantum mechanics calculation; static equilibrium concept." data-altupdatedat="1787630408000"> 表示平均值。该函数可表示为：
<img fo:content-width="2.3in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq2.jpg" width="230" alt="数学公式 G(ξ,χ,τ) 卷积过程方程，符号表示。" data-altupdatedat="1787630408000">(2)
其中“N”表示观测区域内的平均分子数，<img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/circlex.jpg" width="10" alt="静态平衡方程 ΣFx=0 示意图；物理学研究；平衡分析；教育概念" data-altupdatedat="1787630408000"> 表示空间中的卷积运算，<img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/ex.jpg" width="50" alt="数学函数方程 W(ξ,χ)，用于统计分析或数学建模" data-altupdatedat="1787630408000"> 表示仪器束腰的自相关。后者可被理解为由于光学/记录装置的限制，单个发射源的光子在空间中扩散程度的度量（即所谓的点扩散函数，PSF，通常可用高斯函数很好地近似）。最后，<img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/ext.jpg" width="50" alt="概率分布方程 p(ξ, χ, τ)，用于统计分析，公式表示" data-altupdatedat="1787630408000"> 表示在时间延迟 <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/t.jpg" width="10" alt="Tau 符号，用于方程和公式中，与物理和工程学研究相关" data-altupdatedat="1787630408000"> 后，在距离 <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/e.jpg" width="10" alt="静态平衡示意图，ΣFx=0，ΣFy=0；矢量力平衡图解，教育内容" data-altupdatedat="1787630408000"> 和 <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/x.jpg" width="10" alt="色谱图；DNA 分离过程；涉及用于分析的色谱系统" data-altupdatedat="1787630408000"> 处发现粒子的概率。若考虑一种扩散动力学过程，即粒子在各个方向上随机运动且无净通量存在，则该函数也可用高斯函数良好近似，其方差可被识别为运动粒子的均方位移（MSD）。因此，相关函数的束腰宽度（也称为 <img fo:content-width=".3in" src="/files/ftp_upload/51994/2t.jpg" width="30" alt="方差符号 \( \sigma^2(\tau) \) 方程；统计分析方法；简洁关键词替代文本" data-altupdatedat="1787630408000">）可定义为粒子 MSD 与仪器束腰的总和，并可通过针对每个时间延迟对相关函数进行高斯拟合来测量。测得的 iMSD 可用于计算运动分子的表观扩散系数 <img fo:content-width=".4in" src="/files/ftp_upload/51994/dappt.jpg" width="40" alt="扩散系数公式 \((D_{app}(\tau))\)；分析化学研究示意图" data-altupdatedat="1787630408000"> 以及平均位移 <img fo:content-width=".4in" src="/files/ftp_upload/51994/rt.jpg" width="40" alt="数学公式 R(τ)，表示时间依赖的响应函数" data-altupdatedat="1787630408000">，其表达式如下：
<img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq3.jpg" width="170" alt="扩散系数方程，D_app(τ) 公式，符号，科学分析，教学用途。" data-altupdatedat="1787630408000">(3)
<img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq4.jpg" width="170" alt="基于方差的测量方法公式，R(τ)=√[σ²(τ)-σ²(0)]；统计分析。" data-altupdatedat="1787630408000">(4)
以下部分将基于所用实验装置的一些关键考虑因素进行阐述。为了选择性地激发活细胞基底膜上的荧光团，我们将采用全内反射（TIR）照明方式，并使用商用的全内反射荧光（TIRF）显微镜（具体细节见材料部分）。此外，为了收集荧光信号，我们将使用高倍物镜（100倍，数值孔径NA为1.47，TIRF照明要求高数值孔径）和EMCCD相机（芯片上像素的物理尺寸为16 μm）。为了实现100 nm的像素尺寸，我们额外应用一个1.6倍的放大镜。如下文所述，要准确描述小于100 nm的快速膜脂动力学，需要达到低于1毫秒的时间分辨率。为了实现这一时间分辨率，我们需要选择一个比整个相机芯片（512 × 512）更小的感兴趣区域（ROI）。这样，相机读取的行数减少，从而提高时间分辨率。然而，在这种读出模式下，帧时间受限于电荷从曝光区转移到读出芯片所需的时间，对于512 × 512像素的EMCCD相机，通常在毫秒量级。为了突破这一限制，一种新兴技术允许仅转移ROI区域的行，而非整帧转移，从而实际有效地减小了曝光芯片的尺寸（在我们的EMCCD中称为裁剪传感器模式）。为了使该配置有效，必须在光路中安装一对狭缝，以遮挡ROI以外的芯片区域。得益于这一装置，时间分辨率可达到10-4秒。但请注意，如“讨论”部分所述，该方法可与多种不同的实验装置结合使用。
将在活细胞中通过使用ATTO488标记的1-棕榈酰-2-羟基-演示该方法sn甘油-3-磷脂酰乙醇胺（ATTO488-PPE）和一种GFP标记的转铁蛋白受体变体（GFP-TfR）。对于ATTO488-PPE，该方法能够成功回收出几乎恒定的D应用程序 作为平均位移的函数，表明主要为自由扩散，如先前报道所示30,35相比之下，TfR-GFP 显示出逐渐降低的 D应用程序 作为平均位移的函数，表明存在部分受限扩散6此外，在后一种情况下，可以在膜平面的多个微米范围内量化局部扩散系数和平均限制区域。

<table><tbody><tr><td>iXon Ultra 897</td><td>Andor</td><td>DU-897U-CS0</td><td></td></tr><tr><td>Solis</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHO-K1</td><td>ATCC</td><td>CCL-61</td><td></td></tr><tr><td>ATTO 488 标记的 PPE</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 488-151</td><td></td></tr><tr><td>DOPE</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850725</td><td></td></tr><tr><td>DOTAP</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>890890</td><td></td></tr><tr><td>100 倍青霉素-链霉素-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>21331</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-106&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>SimFCS 3.0</td><td>Globals Software</td><td></td><td>该软件可在此处下载：http://www.lfd.uci.edu/globals/</td></tr><tr><td>配备 TIRF 模块的 DMI6000</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LAS AF</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Lipofectamine</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWork</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>C 末端 GFP 标签转铁蛋白受体</td><td>OriGene</td><td>RG200980</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5306</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma Aldrich</td><td>528730</td><td></td></tr><tr><td>荧光黄绿色乳胶微球，30 nm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5155</td><td></td></tr><tr><td>SONICA 超声波清洗器</td><td>SOLTEC</td><td>ETH S3</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Willco</td><td>GWSt-3522</td><td></td></tr><tr><td>Matlab 的 Bio-Format 导入工具</td><td></td><td></td><td>http://www.openmicroscopy.org/site/support/bio-formats5/users/matlab/</td></tr><tr><td>ICS-MatLab 工具</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;https://www.cellmigration.org/resource/imaging/software/ICSMATLAB_28-02-06.zip">https://www.cellmigration.org/resource/imaging/software/ICSMATLAB_28-02-06.zip&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Matlab 仿真教程</td><td></td><td></td><td>https://www.cellmigration.org/resource/imaging/icsmatlab/ICSTutorial.html</td></tr><tr><td>SimFCS 仿真教程</td><td></td><td></td><td>https://www.cellmigration.org/resource/imaging/ppt-pdf/RICS%20Simulations.ppt</td></tr></tbody></table>

从快速荧光成像到商用显微镜下活细胞膜上的分子扩散规律研究

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

越来越多的研究表明，膜组分（如脂质和蛋白质）的空间分布及其运动在调控多种细胞功能中起着关键作用。然而，由于这些组分具有快速的动力学特性和微小的结构特征，要捕捉分子的真实行为需要极高的时空分辨率。本文介绍了在活细胞中以高时空分辨率研究荧光标记的质膜蛋白和脂质动态的实验方案。值得注意的是，该方法无需对单个分子进行追踪，而是通过计算膜特定区域内所有分子的群体行为来实现分析。该方法的起点是对膜上某一特定区域进行快速成像。随后，通过在逐渐增加的时间延迟下（例如每2、3、n次重复）对所获取的图像进行关联，计算出完整的时空自相关函数。可以证明，由于粒子的扩散运动，空间自相关函数峰值的宽度随时间延迟的增加而增大。因此，通过对一系列自相关函数进行拟合，可以从成像数据中提取蛋白质的均方位移（iMSD），本文以表观扩散系数与平均位移的关系形式呈现。该方法可实现对单个分子平均动力学行为的定量分析，空间精度达纳米级。通过使用GFP标记的转铁蛋白受体（TfR）突变体以及ATTO488标记的1-棕榈酰-2-羟基-sn甘油-3-磷酸乙醇胺（PPE），可观察蛋白质与脂质扩散的时空调控 &#181;微秒至毫秒时间范围内的膜区域测量

为了校准仪器束腰，可按照方案步骤1.1所述，测量单个荧光纳米微球的图像。这些微球的典型荧光图像如图1所示。通过二维高斯函数对强度分布进行拟合，可获得良好的残差，并测得仪器束腰为270 nm。该值与通过瑞利方程估算的理论衍射极限相符良好。此校准对于粒子动力学测量并非必需，但测量表观粒子尺寸时必须进行。
典型的相机背景频率分布如图2所示。在约180 DL处的峰对应于相机对无光子信号的响应，代表模数（AD）转换器的贡献。该贡献可近似为高斯分布，用于估计信号记录过程中引入的偏移量和方差。在200 DL以上，数字灰度级分布呈指数形式（在对数尺度下为线性），代表相机对单个光子的平均响应。通过指数分布拟合该区域，可测量分配给每个单光子的平均DL值。每个光子对应的平均DL值与AD转换器误差之间的比值越高，计算所得相关函数中的噪声就越低。此外，单光子平均响应还可用于估算相机的动态范围。
完整实验流程示意图总结如下 图3 Atto488-PPE ...

质膜蛋白和脂质的空间分布与时间动态是生物学中的热点问题。本文通过时空图像涨落分析来探讨这一问题，该方法在概念上可提供与单粒子追踪相同的物理量，但使用小分子标记物和常规显微镜装置即可实现。

膜组分（如脂质和蛋白质）的空间分布及其运动在……中起着关键作用，这一点已变得越来越明确。

本实验的总体目标是测量脂质和蛋白质在活细胞膜中的扩散规律。为实现这一目标，首先通过成像纳米级荧光微珠来校准显微镜的点扩散函数。随后，制备包含荧光标记目标分子的基于脂质体的载体，并通过转染或直接整合的方式将其引入活细胞中。通过全内反射荧光显微镜对活细胞质膜进行快速成像。最后，计算相关函数，并通过高斯拟合提取分子扩散规律。所得数据。确定所研究的脂质或蛋白质的运动模式。与传统的光漂白后荧光恢复方法或经典的单点荧光相关光谱法相比，该技术的主要优势在于能够测量分子扩散规律。我们对系统具有先验知识。此外，与传统的单粒子示踪方法不同，此处无需提取粒子轨迹即可测量分子位移。因此，该方法可轻松结合相对较大且密集的分子使用，例如基因编码的荧光蛋白。总体而言，该方法有助于回答细胞与分子生物学领域的关键问题，例如蛋白质或脂质的运动如何调控质膜的结构及其功能组织。对这些问题及相关问题的解答将向所有人开放，并且仅需使用一台商用显微镜即可实现。整个实验流程将由本实验室的博士研究生 Zo 进行演示。开始本实验方案前，首先校准成像系统的点扩散函数。取一个 500 微升离心管，预先加入 90 微升蒸馏水，再将 10 微升荧光微珠溶液加入其中并混匀。将溶液置于水浴超声仪中进行超声处理20分钟。使用手术刀切下一平方厘米大小的3%AGA玫瑰凝胶，并将其放入培养皿中。取10微升稀释后的荧光微球溶液，滴加到凝胶表面。然后使用镊子将凝胶块翻转，置于直径为2厘米的玻璃培养皿中。再次使用镊子，将凝胶片压下以分散液滴。接下来启动采集装置，该装置由一台商用全内反射荧光显微镜组成。配备一个培养箱，以及一台连接到计算机的高速E-M-C-C-D相机，该计算机运行着li a应用套件、先进的荧光软件和/或Solis图像采集软件。使用I型部件和透射光将样品放置在显微镜载物台的样品 holder 上。聚焦于凝胶的边缘。然后将凝胶置于物镜正下方，调节焦距以在 Leica 应用套件的高级荧光软件中启动激光校准程序，选择自动校准并按照自动校准流程操作。在激光完成校准后，于 and 或 Solis 采集软件中点击设置按钮，此时将打开一个窗口。将相机曝光时间设置为 100 毫秒，EM 增益设为 1000，重复次数设为 100，并勾选帧转移复选框。然后点击自动保存窗口，输入实验名称。寻找一个具有孤立单个斑点的视野。聚焦于一个明亮的点，该点通常代表一个微珠聚集体。然后采集100帧图像。重复此步骤五到六次，以获取多个单个点的图像。将采集到的序列导入 MATLAB 等数据处理程序中，并对图像序列进行时间上的平均。然后显示测得的平均强度图像。放大一个明亮且较小的荧光点，大致将最亮的像素确定为该点的中心。最后，选择您希望在颗粒周围绘制的兴趣区域大小，通常为一微米，以便用高斯函数拟合选定的强度分布。选择“gause fit”命令，并检查获得的残差以验证拟合的优度。最后，按照随附文档中所述方法校准相机。系统校准完成后，即可开始标记细胞以进行图像采集。首先准备脂质掺入所需的脂质体：分别将一毫克DOPE、一毫克D-O-T-A-P和一毫克PPE ADO 4 88各自溶于含有1毫升氯仿的微量离心管中。接下来，将0.5毫升的DOPE溶液和0.5毫升的D-O-T-A-P溶液与25微升的PPE ATO 488溶液混合。将试管放入离心蒸发仪中，在280 ×g条件下开始旋转。启动真空泵，持续旋转24小时。第二天，向离心管中加入 0.5 毫升 20 毫摩尔的 heis 缓冲液，涡旋振荡 15 分钟。然后将离心管放入超声水浴仪中，在 40 摄氏度下超声处理 15 分钟。为制备细胞，用 10 毫升 PBS 将一皿 P 100 大小的汇合状中国仓鼠卵巢细胞（CHO-K1 细胞）洗涤三次。然后加入1毫升胰蛋白酶，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育5分钟。孵育结束后，加入9毫升添加了10%胎牛血清的D-M-E-M-F 12培养基以重悬细胞，取150微升含细胞的溶液，接种于含有800微升相同培养基的22毫米玻璃底培养皿中。将细胞在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育24小时。进行脂质掺入时，将细胞培养基更换为500微升无血清培养基，并孵育30分钟。孵育结束后，加入2微升脂质体溶液，再继续孵育15分钟。然后用 PBS 清洗细胞，并加入新的 DMEM/F12 培养基。在实验前至少 12 小时进行成像前，打开显微镜的培养箱，使显微镜载物台和光学部件达到实验所需温度。该实验过程中最困难的步骤是图像采集。为了确保实验成功，务必针对所用系统优化每一个采集参数。在实验当天，打开显微镜，并等待相机达到工作温度。为了进行实验，我们将使用两台相机。相机一用于成像，相机二用于选择细胞。这种配置可在软件中实现最快的数据采集速度。设置透射光成像的参数。将曝光时间设为 20 毫秒，两台相机的 EM 增益均设为 1。然后在软件中打开对比度模式窗口并点击左侧。单击 BF 以选择明场模式。通过目镜观察样本时，将样本放入 holder 中。调节至样本清晰对焦。然后手动将光线导向相机一，并轻轻推动狭缝，使仅需成像的感兴趣区域（ROI）被照亮。接着，将一个细胞移入选定区域，并通过软件将光线导向相机二。随后在软件中绘制一个感兴趣区域（ROI）以生成参考图像。首先，通过软件选择“自动对准”以校准激光。然后，选择“启用准直器”以启动自动对准程序。接着打开顶部的培养箱，并对激光束进行准直。当激光在软件窗口左侧的左下角对齐后，单击 70 按钮，将穿透深度设置为 70 纳米。在 Leica 应用套件中，这对应于激光在底部玻璃上的入射角约为 70 度。高级荧光软件曝光时间文本框。在EM增益文本框中输入70毫秒。在相机二上输入1000以执行相同操作。打开设置窗口，并在相应的文本框中输入相同的数值。接下来点击“实时”按钮。荧光信号将被传送至相机一，样品的图像将显示在屏幕上。移动样品，直至一个荧光细胞进入参考兴趣区域。然后按下显微镜主体前方的按钮，将光线导入相机二，并精确调节Z轴位置旋钮，在and或sole软件中对准细胞膜。打开设置窗口，将最小曝光时间设为在1000倍EM增益、裁剪传感器模式下的可实现值，重复次数设为10的5次方，并设置自动保存选项以开始采集图像序列。点击软件中的相机图标，等待采集完成。然后打开设置窗口，关闭EM增益，并取消勾选裁剪模式选项。在采集过程中，相机温度通常会上升约两到三度。因此，在对新细胞进行成像之前，需等待相机达到最佳工作温度。同样，一旦成像完成，需按照随附文档中的说明，从成像数据计算均方位移，以获得目标分子的荧光标记变体。CHO-K1细胞要么用ADO 488 PPE进行标记，要么转染转铁蛋白受体（TfR）或TfR-GFP，并按本视频所述方法通过全内反射荧光显微镜（TIRF）进行成像。如图所示，ADO 488 PPE测得的扩散规律呈平坦状，表明其主要为自由扩散，这与先前采用受激辐射耗尽荧光相关光谱（STED-FCS）或稳态FCS在转染TfR-GFP后所观察到的结果一致。转染TfR-GFP后，测得的TfR-GFP扩散规律初始阶段呈平坦状，在平均分子位移低于100纳米范围内，其表观扩散系数平均约为0.7 µm²/s。随后，表观扩散系数迅速下降至每秒0.2平方微米，该数值通常由衍射受限的荧光相关光谱（FCS）测得。值得注意的是，如最后一个示例所示，即使使用GFP等相对较暗且密集的标记物，本方法仍可轻松测量分子平均位移，其分辨率可达几十纳米。 此外，表观扩散系数开始下降的空间尺度反映了膜骨架对蛋白质的局部限制特征尺寸，约为120纳米，与先前的估计结果一致。一旦掌握了数据分析方法，数据采集可在数分钟内完成。我们相信，该技术将为细胞与分子生物学领域的研究人员提供一条便捷且定量研究活体样品中蛋白质和脂质扩散时空调控的新途径。

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