可视化单个分子复合物 在体 内 使用先进的荧光显微镜技术

本文演示了在活体细菌细胞上进行单分子荧光显微镜观察的实验方案，以实现对功能性分子复合物的检测、追踪和定量。该方案首先培养表达带有荧光染料标记蛋白的细菌。经过四到六小时培养后，从培养物中取出少量细胞，并通过剪切处理截短其鞭毛丝。

在流动池内的玻璃盖玻片经过表面修饰，以允许细胞附着于其表面。将细胞注入流动池，并通过菌毛短柄进行固定，在激光激发荧光显微镜下观察。随后，高量子效率相机记录标记分子复合物的明场及荧光图像。

大家好，我是伊恩·多伊（Ian Doy），我在牛津大学生物化学系与马克·李（Mark Lee）合作。我是亚历克斯·罗伯逊（Alex Robertson），在物理系与马克·李（Mark Lee）共事。我是尼克·德（Nick De），来自物理系的 Leak 实验室。

今天我们将向您展示如何利用先进的荧光显微镜技术，在活体细菌中对单个分子复合物进行可视化观察。我们采用该方法研究这些分子复合物在功能状态下的行为，同时也用于探究天然生物分子机器在纳米尺度下的实时动态过程。

那么我们开始吧。首先，将50微升冻存的大肠杆菌菌体解冻。这些菌体经过了基因改造。

为了用荧光染料分子标记蛋白质，接种5 mL LB培养基，并在37°C下振荡培养过夜。次日早晨，取50 µL饱和培养物，转接到M63葡萄糖最低培养基中，在30°C下培养4至6小时。此处使用两种不同的细胞株。

一种表达与GFP融合的电子传递细胞色素，另一种表达参与细菌鞭毛电机的蛋白质。若需观察固定样品，可直接从生长中的亚培养物中收集与GFP融合的细胞；若在拴系条件下观察，则可对细胞进行剪切处理以截短细菌鞭毛。

为了剪切细菌，用无菌移液管将一至五毫升的菌液转至由两个无菌注射器组成的装置中。交替推动两个注射器活塞，使菌液在狭窄的管路中往复通过约50至100次，具体次数取决于所需的剪切程度。随后离心菌液以收集细胞沉淀，并将细胞重悬于最低限度培养基中，以去除鞭毛碎片。待细胞准备好后，将洁净的BK7玻璃盖玻片浸入饱和的氢氧化钾乙醇溶液中20分钟，进行清洗处理。

用去离子水和乙醇彻底冲洗，并静置风干至少一小时。接下来，构建一个简单的流动池，用于在显微镜下容纳细胞。具体操作为：在BK7玻璃载玻片上绘制石蜡油线条，然后将一块已清洗的盖玻片置于其上，形成一个隧道状三明治结构。

用一对镊子轻轻按压。这将使流动池的体积达到 5 到 10 µL。为观察固定的细胞，通过注入 0.1% 的聚-L-赖氨酸溶液充满流动游戏副本，并在室温下孵育至少一分钟。

接下来，从流动池的一端注入100微升的最低培养基，同时从另一端用纸巾吸滤，以冲洗流动池。随后，在最低培养基中加入20微升1:500稀释的直径为200纳米的乳胶微球，用于标记盖玻片表面。将流动池置于一个简单的保湿室中，在室温下孵育5分钟。将流动池倒置，使盖玻片朝下。

然后用滤纸通过毛细作用吸去100微升的最低培养基，以洗去未结合的珠子。为了观察固定的细胞，应跳过聚-L-赖氨酸孵育步骤，直接向流动池中加入每毫升5微克的Flag标签化甘露聚糖抗体溶液，随后将流动池置于湿润箱中孵育10分钟。孵育结束后，用滤纸通过毛细作用冲洗流动池。

接下来，用滤纸通过毛细作用从流动池中吸去20微升细胞培养液，可选用剪切后的样品观察附着的细胞，或选用未剪切的样品观察固定化的细胞。将流动池倒置并放入湿化室中孵育20分钟。然后通过毛细作用用100微升基础培养基洗去未结合的细胞。在盖玻片顶面中央滴加一滴浸油。

将流动池轻轻放置在自行搭建的荧光显微镜的样品支架上，使其与高数值孔径物镜形成光学接触。接着，打开显微镜的电子倍增相机，并将相机冷却至负70摄氏度。

软件设置为以每秒25帧的典型帧率采集图像。在帧转移模式下，打开明场照明并将图像调至清晰对焦。

根据细胞长轴与盖玻片表面平行且贴附良好的标准，选择适合成像的单个细胞或细胞群，调节焦距，使附着在盖玻片表面的200纳米乳胶微球恰好处于焦点位置。在明场下采集图像序列，以记录细胞体的轮廓。

然后关闭明场照明，并将相机增益调至最大，以进行全内反射荧光成像，也称为TIRF。启动相机采集，并打开激光快门，以激发细菌内的荧光蛋白。激光强度和采集速度的参数需根据特定的生物系统进行优化。

待研究的样品被持续照射直至发生光漂白，该过程通常需要约10秒。数据采集完成后，图像被输入至一个自行编写的分析程序，该程序可自动检测细胞中荧光点的位置，定位精度达数纳米，并提取其大小和亮度信息。随后，根据光漂白轨迹的亮度随时间的变化，用于估算分子复合物的化学计量比。

采用此方法时，明场下观察到的细胞图像非常清晰，细胞体边缘在白色或灰色的细胞体背景下呈现为深色，而固定细胞的荧光成像则与此形成对比。此处以伪彩显示，可见典型宽度为250至300纳米的明显强度亮点。在荧光激发下的明场图像中，可观察到健康的锚定细胞围绕锚定点旋转。

在附着点处可能还会观察到一些分子复合物，表明储存的蛋白质定位于Geller马达。这些斑点是单个的分子复合物。所观察到的复合物数量将取决于所使用的照明模式以及在任一时刻细胞内实际存在的复合物数量。

如果初始斑点密度非常高（如此处使用的标记细胞色素所示），则执行初始 FRAP 漂白可提高成像对比度。斑点的移动性取决于特定的生物系统。在本研究中，我们已向您展示了如何利用先进的荧光显微镜观察单个分子复合物。

进行此操作时，重要的是避免剪切细胞，因为这可能会损害鞭毛马达的功能。同样重要的是，不要将细胞在显微镜载玻片上放置超过一小时，否则细胞可能因缺氧而受到影响。需要通过自动化手段来确定最佳成像条件。

可以单独使用纯化的GFP来确定您特定显微镜系统的合适激光功率。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。