可视化单分子络合物在体内使用高级荧光显微
September 8th, 2009
在这里，我们展示了单分子荧光显微镜，对生活的细菌细胞，使功能分子复合物进行检测，跟踪和量化的执行协议。
在这里，我们演示了对活细菌细胞进行单分子荧光显微镜检查的方案，以便能够检测、跟踪和量化功能性分子复合物。该方案从生长细菌开始，细菌使蛋白质标记到荧光染料分子上。4 到 6 小时后，从培养物中提取少量细胞，其鞭毛丝通过剪切截断。
流通池内的玻璃盖玻片经过涂层处理，使流通池能够粘附在表面。将细胞注射到流通池中并通过胶凝短管拴系，使用激光激发显微镜在荧光中观察。然后，高量子效率相机记录标记分子复合物的明亮明场和荧光图像。
大家好，我是 Ian Doy，我正在牛津大学生物化学系与 Mark Lee 合作。我是 Alex Robertson，与 Mark Lee 一起在物理系工作。我是来自泄漏实验室的 Nick De，也是物理系的同事。
今天，我们将向您展示使用先进的荧光显微镜观察活细菌中单分子复合物的程序。我们使用这个程序来研究功能状态下的 this。我们还用于研究自然生物机器和纳米透镜尺度的实时动力学。
那么让我们开始吧。首先解冻 50 微升冷冻的大肠杆菌茎。这些已经经过基因改造。
要用荧光染料分子标记蛋白质，请接种 5 毫升 LB 生长培养基，并在 37 摄氏度下有氧振荡过夜培养细菌。第二天早上，取 50 微升饱和培养物，将其传代培养到最低的 M 63 葡萄糖培养基中，在 30 摄氏度下孵育 4 到 6 小时。这里使用了两种不同的细胞菌株。
一种表达与 GFP 融合的电子传输细胞色素。另一个表达一种参与细菌鞭毛马达的蛋白质。如果要将 GFP 细胞视为固定化样品，则可以直接从生长的传代培养物中收获与 GFP 融合的细胞，或者如果在栓系条件下观察，则可以剪切它们以截断细菌鞭毛。
要剪切细菌，通过无菌管道将 1 到 5 毫升的传代培养物放入由两个无菌注射器组成的装置中。交替推入每个注射泵，迫使培养物通过狭窄的管道约 50 至 100 次，具体取决于获得的剪切程度，接下来，离心培养物以沉淀细胞，然后将细胞重悬于最低培养基中以去除鞭毛片段。细胞准备好后，将干净的 BK 7 玻璃盖玻片浸入氢氧化钾和乙醇的饱和溶液中 20 分钟，以制备它们。
用去离子水和乙醇彻底冲洗，然后风干至少 1 小时。接下来，构建一个简单的流通池以将细胞容纳在显微镜中。为此，在 BK 7 玻璃显微镜载玻片上画石蜡脂线，然后通过将其中一个清洁的盖玻片放在顶部来创建一个隧道夹层。
用一对镊子轻轻向下按压。这应得到 5 至 10 μL 的流通池体积。为了观察固定的细胞，通过注射 0.1% 的聚 L 赖氨酸溶液填充流通池，并使其在室温下孵育至少 1 分钟。
接下来，通过从流通池的一端注入 100 微升最小培养基来冲洗流通池，同时用另一端的薄纸将培养基吸出流通池，然后，WIC 将 20 微升 200 纳米直径的乳胶微球的 500 分之一稀释液投入最小培养基中，以标记盖玻片表面。将流通池置于简单的湿度箱中，在室温下孵育 5 分钟。流通池倒置，使盖玻片朝下。
然后用薄纸吸湿 100 μL 最小培养基，洗去未结合的微珠。要观察栓系细胞，请跳过多聚 L 赖氨酸孵育步骤，用每毫升 5 μg 的 Anti-Flag 结冷抗体溶液填充流通池，然后将其置于湿度室中 10 分钟。孵育后，用薄纸芯吸冲洗流通池。
接下来，用薄纸将 20 微升细胞培养物通过流动池，使用剪切样品观察栓系细胞或使用未共享样品观察固定化细胞，将流通池倒置并置于湿度室中 20 分钟。然后通过吸出 100 μL 最小培养基来洗出未结合的细胞。在盖玻片顶面中央滴一滴浸油。
将流通池轻轻放在定制荧光显微镜的样品架上。这应该与高数值孔径物镜进行光学接触。接下来，打开显微镜的电子倍增相机，并将相机设置为冷却至零下 70 摄氏度。
该软件设置为以 25 赫兹的典型帧速率采集图像。在帧传输模式下。打开明场照明并使图像聚焦。
根据它们被长轴卡住的情况，选择合适的单元格或一组单元格进行成像。平行于盖玻片表面，调整焦距以确保粘附在盖玻片表面的 200 纳米乳胶珠刚好聚焦。在明场中获取图像序列以记录细胞体的轮廓。
然后关闭明场照明，并将相机增益启用到最大，以便使用全内反射荧光（也称为草皮）进行成像。开始相机采集并打开激光快门以激发细菌内的荧光蛋白。激光强度和采集速度的参数需要针对特定的生物系统进行优化。
对研究中的样品进行照明，直到光漂白，这通常需要大约 10 秒。收集数据后，图像被输入到定制的书面分析程序中，该程序会自动检测细胞中荧光点的位置，精度达到几纳米，并提取其大小和亮度。然后使用光漂白痕迹的亮度相对于吸引分子复合物的时间来估计化学计量的使用。
使用这种方法，在明场中观察的细胞图像非常清晰，因此使用固定化细胞的荧光，细胞体的周边与白色灰色细胞体相比是深色的。在这里可以看到通常为 250 到 300 纳米宽的不同强度点以伪彩色显示。在荧光激发下，在明场图像中可以看到健康的栓系细胞围绕栓系附着点旋转。
在附着点也可能看到一些分子复合物，表明 tank ed 蛋白质与 Geller 马达一起定位。这些斑点是单独的分子复合物。看到的这些数量将取决于所使用的照明模式以及在任何时间细胞中实际存在的复合物数量。
如果斑点的密度最初非常高，就像这里使用的标记细胞色素一样，那么进行初始 frap 漂白可以提高成像对比度。斑点的移动性取决于特定的生物系统。在研究中，我们刚刚向您展示了如何使用先进的荧光显微镜观察单个分子复合物。
执行此程序时，重要的是不要使用剪切单元，因为这可能会损害旗形电机的功能。同样重要的是，不要将细胞留在显微镜载玻片上超过一个小时，否则它们可能会耗尽氧气。需要自动化来找到最佳成像条件。
它可以帮助单独使用纯化的 GFP 来确定适合您特定显微镜系统的正确激光功率。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。
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概述
本文演示了活体细菌细胞上的单分子荧光显微镜检测协议。该方法可以实现功能性分子复合物的检测、跟踪和定量。
关键研究组成部分
科学领域
- 荧光显微镜
- 细胞生物学
- 分子成像
背景
- 单分子荧光显微镜允许在活细胞中观察单个分子。
- 这种技术对于研究细胞环境中的动态过程至关重要。
- 了解分子复合物对于洞察细胞功能至关重要。
- 活体细菌细胞作为这些研究的模型系统。
研究目的
- 提供执行单分子荧光显微镜的详细协议。
- 使研究人员能够在活细胞中可视化和定量分子复合物。
- 增强对细菌细胞中分子相互作用的理解。
使用的方法
- 培养表达带荧光染料标记的蛋白质的细菌。
- 通过剪切提取细胞并截断鞭毛丝。
- 在流动池中涂覆玻璃盖以促进细胞黏附。
- 将细胞注入流动池中，并使用激光激发显微镜进行成像。
主要结果
- 成功可视化活体细菌细胞中标记的分子复合物。
- 通过荧光成像定量分子相互作用。
- 在活细胞环境中展示协议的有效性。
- 为该领域的研究人员提供了一种可重复的方法。
结论
- 该协议使得对活细胞中分子复合物的详细研究成为可能。
- 单分子荧光显微镜是细胞生物学的强大工具。
- 这种方法可以适用于分子成像的各种应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Visualizing single molecular complexes in living bacterial cells enables mechanistic de-risking of target validation by revealing stochastic and heterogeneous dynamics masked in ensemble measurements. This approach supports predictive confidence in early discovery by providing physiologically relevant, minimally perturbative observations of functional biological machines at near-native expression levels. The method enhances translational continuity from discovery through preclinical stages by delivering quantitative, reproducible data on molecular interactions in functional contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct observation of single-molecule stoichiometry and dynamics in functional complexes.
- Operational Value: Provides quantitative readouts of molecular interactions under near-native conditions, reducing reliance on overexpression artifacts.
- Strategic Value: Supports target confidence assessment by revealing heterogeneity and functional states invisible to bulk assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates high-precision spatial and temporal data on molecular complexes for assay benchmarking and validation.
- Operational Value: Delivers reproducible fluorescence-based outputs detectable via standard microscopy platforms.
- Strategic Value: Facilitates assay standardization through quantifiable single-molecule brightness and bleaching kinetics.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges discovery and preclinical validation by maintaining physiological relevance through genomic encoding of fluorescent tags.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of complex dynamics in live cells to inform mechanism-of-action studies.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by correlating molecular complex behavior with phenotypic outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing single-molecule resolution of target engagement and complex assembly, informing lead identification through mechanistic insights.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via direct visualization of molecular complex formation and disassembly in live cells.
- Screening: Enables assay readiness through standardized preparation of tethered or immobilized cells with quantifiable fluorescent spot detection.
- Analytics: Delivers nanometer-scale positional data and brightness trajectories for stoichiometry estimation and complex size quantification.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by preserving native expression levels and minimizing cellular perturbation during imaging.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging capability for multiple targets through adaptable fluorescent tagging and flow cell preparation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through direct observation of stochastic molecular behavior in functional contexts.
- Operational Value: Standardization via reproducible cell preparation, flow cell assembly, and image acquisition parameters.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in target validation.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on quantitative single-molecule dynamics data.
Implementation Considerations
- Expertise in fluorescence microscopy, bacterial culture, and protein tagging.
- Instrumentation including high numerical aperture objectives, laser excitation, and cooled EMCCD cameras.
- Cross-team standardization of shearing protocols, flow cell preparation, and image analysis pipelines.
- Adaptation considerations for different bacterial strains, fluorescent tags, and target complexes.
- Practical limitations include photobleaching constraints and shear sensitivity of flagellar function.
