HIV-1的三聚体包膜糖蛋白的构象评估使用基于细胞的ELISA检测

以下实验的总体目标是用单克隆抗体询问 RIC HIV 单包膜糖蛋白或 ENV 确认。这是通过首先横切贴壁细胞在细胞表面表达嵌合 HIV one E NV 蛋白来实现的。作为第二步，将细胞与抗 ENV 单克隆抗体一起孵育，该抗体将根据表位暴露结合 ENV。

接下来，加入 HRP 偶联的二抗，以便通过化学发光测定来定量抗体相互作用。获得的结果表明，根据为每种抗体获取的相对光单位，显示 VNV 结合抗体的相对水平。嗯，与现有方法（例如基于事实的捆绑）相比，该技术的主要优点是该技术可以用少量抗体完成，并且在高通量下，实验室中的博士后将执行该技术。

在本实验中，在转染板前一天使用人骨肉瘤细胞，每孔 2 倍 10 至 4 个细胞。在适合发光读数的不透明 96 孔细胞培养板中。使用补充有胎牛血清和青霉素链霉素的 delcos 改良 eagle 培养基，第二天在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育细胞过夜。

制备转染混合物。首先，布置两个管子，两个 B 对 2 个工位。加入 5 微升补充有 25 毫摩尔嬉皮士的 DMEM，然后加入 10 ng tat 和涂层质粒，以及 150 ng 嵌合 HIV 包膜糖蛋白编码质粒。

请注意，仅当使用 TAT 依赖性 HIV 时，才需要 TAT 编码质粒，在 5 μL DMM 和 450 ng聚乙啉或 PEI 中将编码质粒的 1 包膜糖蛋白编码质粒对 2 B。应根据要转染相同 HIV 单包膜糖蛋白的孔数调整试剂和 DNA 的量。接下来，将两个 B 的内容物加入两个样品槽中，涡旋 10 秒钟，充分混合。

在室温下将转染混合物孵育 10 分钟。10 分钟后，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 48 小时的 96 孔板每孔中加入 10 微升转染混合物。Ali SA 研究单克隆抗体对嵌合 HIV 单包膜糖蛋白的识别，在转染人骨肉瘤细胞后两天进行。

为每个使用的板准备 250 毫升洗涤缓冲液。向洗涤缓冲液中加入 1% 脱脂奶粉和 5 毫摩尔 tris pH 8.0，每板制备 125 毫升封闭缓冲液。从 96 孔板中取出细胞培养基和转染混合物。

每孔加入 100 μL 封闭缓冲液，孵育 20 分钟。在室温下，去除上清液，每孔加入 50 μL 抗体，在封闭缓冲液中稀释至适当浓度。在室温下孵育 1 小时。

用 100 微升封闭缓冲液洗涤 3 次，然后重复洗涤过程 3 次。用 100 微升封闭缓冲液洗涤 3 次，然后在最后一次洗涤后用 100 微升洗涤缓冲液洗涤 3 次。取出沙子。

加入 100 μL 封闭缓冲液并孵育 5 分钟。在室温下，去除上清液，加入 50 μL 二抗（稀释 1 至 3000 的封闭缓冲液）。40 分钟后在室温下孵育 40 分钟。

用 100 μL 封闭缓冲液洗涤 3 次，然后用 100 μL 洗涤缓冲液洗涤 3 次。为了制备用于数据采集的样品，请从 96 孔板中取出上清液，并在每孔中加入 30 微升 1 x 增强型化学发光底物。在合适的读板机上每孔采集 1 秒的化学发光信号。

根据制造商的说明，可溶性 CD 4 或 S CD 4 对包膜糖蛋白或 ENV 上 CD 4 I 表位暴露的影响是 CD 4 与 ENV 的测定相互作用诱导 ENV 确认变化，暴露与共受体结合位点重叠的 17 B 和 48 D 表位，但不影响识别抗体 2 G 12 的外结构域。为了评估点突变对 NV 确认的影响，使用了两个 ENV 突变体 H 66 A，其自发采样 CD 4 结合确认的倾向降低，S3 75 W 使 NV 易患 CD 4 结合状态。根据表达水平对原始数据进行归一化，显示 H 66 A 减弱 CD 4 I 17 B 识别，而 S3 75 W 增强 17 B 信号，足以恢复 H 66 的表型。

增加量的 CD 4 表达子转染的突变体检测细胞 cot。与 NV 蓝色条一起显示 CD 四种 I 单克隆抗体 A 3、2 和 C 11 的信号增加，这些抗体识别 ENV 糖蛋白内部结构域中的不连续表位。GP one 20 ENV 对 2 G 12 抗体的识别不受影响。

最后，将原始数据归一化为两个 G 12，当 ENV 用 CD 4 突变体转染时不存在 32 和 C 11 调制，与 ENV 相互作用的能力降低，表明增加的信号取决于 E NV CD four 相互作用一旦掌握，该技术可以在四个小时内完成。