Name: HIV-1的三聚体包膜糖蛋白的构象评估使用基于细胞的ELISA检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: 了解基于细胞的ELISA检测技术，用于评估HIV-1三聚体包膜糖蛋白构象与单克隆抗体的相互作用。该方法具有高通量、抗体用量少的优势，可指导疫苗免疫原设计。

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我们感谢 James Robinson 博士慷慨赠送 A32、17b、48d 和 C11 单克隆抗体。PGT121 由美国国立卫生研究院（NIH）艾滋病试剂项目、艾滋病研究部（NIAID，NIH）提供（目录号 #12343）。本研究得到了加拿大创新基金会项目负责人基金（#29866）、加拿大卫生研究院（CIHR）运营基金（#257792）、魁北克健康研究基金会（FRQS）青年科学家启动基金（#24639，授予 AF）、蒙特利尔大学医院研究中心（CRCHUM）连续性基金，以及加拿大卫生研究院催化基金（#126630，授予 AF 和 MR）的支持。AF 获得了魁北克研究基金会（FRSQ）初级研究员奖学金（#24639）。MV 获得了加拿大卫生研究院博士研究奖（#291485）的支持。

1. 第1天——细胞培养
<ol>
	<li>接种 2 x&#160;104 人成骨肉瘤（HOS）细胞，每孔接种于适合发光检测的不透光96孔细胞培养板中。&#160;使用添加了10%胎牛血清（FBS）和100 U/ml青霉素-链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），在37 °C、5% CO₂条件下培养至次日2.</li>
</ol>
2. 第2天——聚乙烯亚胺（PEI）转染
<ol>
	<li>根据后续步骤配制转染混合物。根据需转染相同Env的孔数调整试剂和DNA的用量。</li>
	<li>管A：将10 ng编码Tat的质粒（如pTat-III27）和150 ng编码Env的质粒加入5 µl含25 mM HEPES的DMEM中。</li>
	<li>仅在使用依赖Tat的Env编码质粒（如pSVIII）时才需要添加编码Tat的质粒。</li>
	<li>管B：将450 ng PEI（来自1 µg/µl溶液）加入5 µl DMEM中。</li>
	<li>将管B的内容物加入管A中。涡旋振荡10秒以充分混匀，并在室温（22 °C）下孵育转染混合物10分钟。</li>
	<li>每孔96孔板加入10 µl转染混合物。在37 °C、5% CO2条件下孵育48小时。</li>
</ol>
3. 第4天——ELISA
<ol>
	<li>所有实验均在室温下进行，以尽量减少Env/抗体复合物的内吞作用。</li>
	<li>根据同时使用的培养板数量，每板准备250 ml洗涤缓冲液。洗涤缓冲液为1x Tris缓冲盐水（TBS）&#160;pH 7.5（50 mM Tris-Cl，pH 7.5；150 mM NaCl），并添加1 mM MgCl2和1.8&#160;mM CaCl2。</li>
	<li>通过向洗涤缓冲液中加入1%脱脂奶粉和5 mM Tris（pH 8.0），每板制备125 ml封闭缓冲液。</li>
	<li>从96孔板中移除细胞培养基和转染混合物（上清液）。</li>
	<li>每孔加入100 µl封闭缓冲液，在室温下孵育20分钟。</li>
	<li>移除上清液，每孔加入50 µl抗体（或血清），用封闭缓冲液稀释至适当浓度。通常使用1 µg/ml的浓度。在室温下孵育1小时。</li>
	<li>用100 µl封闭缓冲液洗板3次&#160;，然后用100 µl洗涤缓冲液重复洗涤3次。</li>
	<li>移除上清液，每孔加入100 µl封闭缓冲液，在室温下孵育5分钟。</li>
	<li>移除上清液，每孔加入50 µl二抗，用封闭缓冲液按1/3,000比例稀释。根据不同生产商的差异调整最佳抗体稀释比例。在室温下孵育40分钟。</li>
	<li>用100 µl封闭缓冲液洗板3次，然后用100 µl洗涤缓冲液重复洗涤3次。</li>
</ol>
4. 数据采集
<ol>
	<li>从孔板中移除上清液，每孔加入 30 µl 1x&#160;增强型化学发光（ECL）底物。</li>
	<li>根据制造商说明书，在合适的酶标仪上对每孔进行 1 秒的化学发光信号检测。读取时间可能因硬件差异而有所不同。</li>
</ol>

<ol><li>Bures, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+with+recombinant+canarypox+vectors+expressing+membrane-anchored+glycoprotein+120+followed+by+glycoprotein+160+boosting+fails+to+generate+antibodies+that+neutralize+R5+primary+isolates+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res.+Human+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Immunization with recombinant canarypox vectors expressing membrane-anchored glycoprotein 120 followed by glycoprotein 160 boosting fails to generate antibodies that neutralize R5 primary isolates of human immunodeficiency virus type 1.</a> AIDS Res. Human Retroviruses. 16, 2019-2035 (2000).</li>
<li>Koff, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+vaccine+development%3A+challenges+and+opportunities+towards+solving+the+HIV+vaccine-neutralizing+antibody+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">HIV vaccine development: challenges and opportunities towards solving the HIV vaccine-neutralizing antibody problem.</a> Vaccine. 30, 4310-4315 (2012).</li>
<li>Mascola, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+with+envelope+subunit+vaccine+products+elicits+neutralizing+antibodies+against+laboratory-adapted+but+not+primary+isolates+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22The+National+Institute+of+Allergy+and+Infectious+Diseases+AIDS+Vaccine+Evaluation%22%5BJournal%5D)">Immunization with envelope subunit vaccine products elicits neutralizing antibodies against laboratory-adapted but not primary isolates of human immunodeficiency virus type 1.</a> The National Institute of Allergy and Infectious Diseases AIDS Vaccine Evaluation. 173, 340-348 (1996).</li>
<li>Rerks-Ngarm, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccination+with+ALVAC+and+AIDSVAX+to+prevent+HIV-1+infection+in+Thailand%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand.</a> N. Engl. J. Med. 361, 2209-2220 (2009).</li>
<li>Roederer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+and+virological+mechanisms+of+vaccine-mediated+protection+against+SIV+and+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunological and virological mechanisms of vaccine-mediated protection against SIV and HIV.</a> Nature. 505, 502-508 (2014).</li>
<li>Fennie, C., Lasky, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+for+intracellular+folding+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+gp120%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Model for intracellular folding of the human immunodeficiency virus type 1 gp120.</a> J. Virol. 63, 639-646 (1989).</li>
<li>Willey, R. L., Bonifacino, J. S., Potts, B. J., Martin, M. A., Klausner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+cleavage%2C+and+degradation+of+the+human+immunodeficiency+virus+1+envelope+glycoprotein+gp160%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis cleavage, and degradation of the human immunodeficiency virus 1 envelope glycoprotein gp160.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 9580-9584 (1988).</li>
<li>Bosch, V., Pawlita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+env+gene+product+proteolytic+cleavage+site%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of the human immunodeficiency virus type 1 env gene product proteolytic cleavage site.</a> J. Virol. 64, 2337-2344 (1990).</li>
<li>Hallenberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+furin-mediated+cleavage+activation+of+HIV-1+glycoprotein+gp160%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibition of furin-mediated cleavage activation of HIV-1 glycoprotein gp160.</a> Nature. 360, 358-361 (1038).</li>
<li>Li, Y., Luo, L., Thomas, D. Y., Kang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+Env+protein+signal+sequence+retards+its+cleavage+and+down-regulates+the+glycoprotein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 Env protein signal sequence retards its cleavage and down-regulates the glycoprotein folding.</a> Virology. 272, 417-428 (2000).</li>
<li>Leonard, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assignment+of+intrachain+disulfide+bonds+and+characterization+of+potential+glycosylation+sites+of+the+type+1+recombinant+human+immunodeficiency+virus+envelope+glycoprotein+%28gp120%29+expressed+in+Chinese+hamster+ovary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Assignment of intrachain disulfide bonds and characterization of potential glycosylation sites of the type 1 recombinant human immunodeficiency virus envelope glycoprotein (gp120) expressed in Chinese hamster ovary cells.</a> J. Biol. Chem. 265, 10373-10382 (1990).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+study+of+the+N-glycosylation+sites+of+HIV-1+envelope+protein+on+infectivity+and+antibody-mediated+neutralization%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">A systematic study of the N-glycosylation sites of HIV-1 envelope protein on infectivity and antibody-mediated neutralization.</a> Retrovirology. 10 (14), (2013).</li>
<li>Helseth, E., Olshevsky, U., Furman, C., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+gp120+envelope+glycoprotein+regions+important+for+association+with+the+gp41+transmembrane+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein regions important for association with the gp41 transmembrane glycoprotein.</a> J. Virol. 65, 2119-2123 (1991).</li>
<li>Haim, H., Salas, I., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+processing+of+the+human+immunodeficiency+virus+envelope+glycoprotein+precursor+decreases+conformational+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Proteolytic processing of the human immunodeficiency virus envelope glycoprotein precursor decreases conformational flexibility.</a> J. Virol. 87, 1884-1889 (2013).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+immune+evasion+at+the+site+of+CD4+attachment+on+HIV-1+gp120%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis of immune evasion at the site of CD4 attachment on HIV-1 gp120.</a> Science. 326, 1123-1127 (2009).</li>
<li>Kwong, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+evades+antibody-mediated+neutralization+through+conformational+masking+of+receptor-binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HIV-1 evades antibody-mediated neutralization through conformational masking of receptor-binding sites.</a> Nature. 420, 678-682 (2002).</li>
<li>Sakai, K., Takiguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+an+effective+AIDS+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Toward an effective AIDS vaccine development.</a> Eur. J. Immunol. 43, 3087-3089 (2013).</li>
<li>Veillette, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+Cellular+CD4+Exposes+HIV-1+Envelope+Epitopes+Targeted+by+Antibody-Dependent+Cell-Mediated+Cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Interaction with Cellular CD4 Exposes HIV-1 Envelope Epitopes Targeted by Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity.</a> J. Virol. 88, 2633-2644 (2014).</li>
<li>Wibmer, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+escape+from+HIV-1+neutralizing+antibodies+drives+increased+plasma+neutralization+breadth+through+sequential+recognition+of+multiple+epitopes+and+immunotypes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Viral escape from HIV-1 neutralizing antibodies drives increased plasma neutralization breadth through sequential recognition of multiple epitopes and immunotypes.</a> PLoS Pathogens. 9 (e1003738), (2013).</li>
<li>Kovacs, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+envelope+trimer+elicits+more+potent+neutralizing+antibody+responses+than+monomeric+gp120%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">HIV-1 envelope trimer elicits more potent neutralizing antibody responses than monomeric gp120.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 12111-12116 (2012).</li>
<li>Yuan, W., Bazick, J., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+multiple+conformational+States+of+free+monomeric+and+trimeric+human+immunodeficiency+virus+envelope+glycoproteins+after+fixation+by+cross-linker%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the multiple conformational States of free monomeric and trimeric human immunodeficiency virus envelope glycoproteins after fixation by cross-linker.</a> J. Virol. 80, 6725-6737 (2006).</li>
<li>Guttman, M., Lee, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+interaction+between+gp41+and+gp120+is+observed+for+monomeric+but+not+oligomeric%2C+uncleaved+HIV-1+Env+gp140%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A functional interaction between gp41 and gp120 is observed for monomeric but not oligomeric, uncleaved HIV-1 Env gp140.</a> J. Virol. 87, 11462-11475 (2013).</li>
<li>Ringe, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+strongly+influences+whether+soluble+HIV-1+envelope+glycoprotein+trimers+adopt+a+native-like+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cleavage strongly influences whether soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers adopt a native-like conformation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18256-18261 (2013).</li>
<li>Desormeaux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+highly+conserved+layer-3+component+of+the+HIV-1+gp120+inner+domain+is+critical+for+CD4-required+conformational+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The highly conserved layer-3 component of the HIV-1 gp120 inner domain is critical for CD4-required conformational transitions.</a> J. Virol. 87, 2549-2562 (2013).</li>
<li>Haim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+CD4+and+CD4-mimetic+compounds+inhibit+HIV-1+infection+by+induction+of+a+short-lived+activated+state%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Soluble CD4 and CD4-mimetic compounds inhibit HIV-1 infection by induction of a short-lived activated state.</a> PLoS Pathogens. 5 (e1000360), (2009).</li>
<li>Haim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+intrinsic+reactivity+of+the+HIV-1+envelope+glycoproteins+to+CD4-independent+infection+and+global+inhibitor+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Contribution of intrinsic reactivity of the HIV-1 envelope glycoproteins to CD4-independent infection and global inhibitor sensitivity.</a> PLoS Pathogens. 7 (e1002101), (2011).</li>
<li>Thali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+changes+in+gp120-CD4+binding+affinity+on+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+glycoprotein+function+and+soluble+CD4+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Effects of changes in gp120-CD4 binding affinity on human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein function and soluble CD4 sensitivity.</a> J. Virol. 65, 5007-5012 (1991).</li>
<li>Medjahed, H., Pacheco, B., Desormeaux, A., Sodroski, J., Finzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+gp120+major+variable+regions+modulate+cold+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 gp120 major variable regions modulate cold inactivation.</a> J. Virol. 87, 4103-4111 (2013).</li>
<li>Thali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+conserved+human+immunodeficiency+virus+type+1+gp120+neutralization+epitopes+exposed+upon+gp120-CD4+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of conserved human immunodeficiency virus type 1 gp120 neutralization epitopes exposed upon gp120-CD4 binding.</a> J. Virol. 67, 3978-3988 (1993).</li>
<li>Finzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+layers+in+the+HIV-1+gp120+inner+domain+regulate+gp41+interaction+and+CD4-triggered+conformational+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Topological layers in the HIV-1 gp120 inner domain regulate gp41 interaction and CD4-triggered conformational transitions.</a> Mol. Cell. 37, 656-667 (2010).</li>
<li>Kassa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitions+to+and+from+the+CD4-bound+conformation+are+modulated+by+a+single-residue+change+in+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+gp120+inner+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Transitions to and from the CD4-bound conformation are modulated by a single-residue change in the human immunodeficiency virus type 1 gp120 inner domain.</a> J. Virol. 83, 8364-8378 (2009).</li>
<li>Xiang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenic+stabilization+and%2For+disruption+of+a+CD4-bound+state+reveals+distinct+conformations+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+gp120+envelope+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Mutagenic stabilization and/or disruption of a CD4-bound state reveals distinct conformations of the human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein.</a> J. Virol. 76, 9888-9899 (2002).</li>
<li>Mouquet, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex-type+N-glycan+recognition+by+potent+broadly+neutralizing+HIV+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Complex-type N-glycan recognition by potent broadly neutralizing HIV antibodies.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3268-3277 (2012).</li>
<li>Julien, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly+neutralizing+antibody+PGT121+allosterically+modulates+CD4+binding+via+recognition+of+the+HIV-1+gp120+V3+base+and+multiple+surrounding+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Broadly neutralizing antibody PGT121 allosterically modulates CD4 binding via recognition of the HIV-1 gp120 V3 base and multiple surrounding glycans.</a> PLoS Pathogens. 9 (e1003342), (2013).</li>
<li>Walker, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+neutralization+coverage+of+HIV+by+multiple+highly+potent+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Broad neutralization coverage of HIV by multiple highly potent antibodies.</a> Nature. 477, 466-470 (2011).</li>
<li>Moore, J. P., Willey, R. L., Lewis, G. K., Robinson, J., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+evidence+for+interactions+between+the+first%2C+second%2C+and+fifth+conserved+domains+of+the+gp120+surface+glycoprotein+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Immunological evidence for interactions between the first, second, and fifth conserved domains of the gp120 surface glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1.</a> J. Virol. 68, 6836-6847 (1994).</li>
<li>Robinson, J. E., Yoshiyama, H., Holton, D., Elliott, S., Ho, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+antigenic+sites+on+HIV+gp120+identified+by+a+panel+of+human+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biochem.+Suppl%22%5BJournal%5D)">Distinct antigenic sites on HIV gp120 identified by a panel of human monoclonal antibodies.</a> J. Cell. Biochem. Suppl. 16E (Q449), (1992).</li>
<li>Bonsignori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-Dependent+Cellular+Cytotoxicity-Mediating+Antibodies+from+an+HIV-1+Vaccine+Efficacy+Trial+Target+Multiple+Epitopes+and+Preferentially+Use+the+VH1+Gene+Family%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity-Mediating Antibodies from an HIV-1 Vaccine Efficacy Trial Target Multiple Epitopes and Preferentially Use the VH1 Gene Family.</a> J. Virol. 86, 11521-11532 (2012).</li>
<li>Brand, D., Srinivasan, K., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+entry+in+the+CDR2+loop+of+the+CD4+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Determinants of human immunodeficiency virus type 1 entry in the CDR2 loop of the CD4 glycoprotein.</a> J. Virol. 69, 166-171 (1995).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。&#160;

该检测方法经过优化，可检测特异性单克隆抗体（mAbs）与细胞表面表达的 HIV-1 三聚体 Env 蛋白之间的相互作用。一旦建立实验方案，即可以中高通量进行操作，总体试剂成本低，且所需抗体用量极少。由于该检测基于转染技术，因此可轻松调整用于共表达细胞蛋白（如 CD4），以研究这些蛋白对 Env 构象的影响。
然而，本实验方案的转染基础也意味着这是其最重要的缺陷之一。首先，使用该技术研究的抗原必须已有独立的表达载体。因此，来自不同临床来源的Env基因或前病毒构建体需要亚克隆至哺乳动物表达载体中。尽管全长前病毒构建体也可用于该技术（参见Veillette&#160;et al.18），但这会产生活性病毒颗粒，因而需要在适当的生物安全 containment 设施中操作。
此外，该技术的成功与转染效率密切相关。获得的信号较弱通常是由于转染抗原表达不佳所致。常见的问题来源包括质粒DNA质量、转染试剂以及细胞活力。如有需要，也可通过其他技术（如流式细胞术或蛋白质印迹）对转染条件进行优化。需要注意的...

由三聚体病毒包膜糖蛋白（Env）介导的人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）进入细胞是感染周期的第一步。由于Env三聚体是病毒颗粒表面唯一暴露的病毒抗原，因此可诱导产生中和性与非中和性抗体。正因如此，它成为疫苗免疫原设计的一个重要候选分子。然而，使用可溶性或重组形式Env进行的疫苗试验所诱导的免疫反应，对大多数HIV-1原代分离株仅表现出极低的有效性1-3。尽管如此，RV144疫苗试验中观察到的部分保护效果4，重新激发了人们对HIV-1 Env作为免疫原候选分子的兴趣。这一观点也得到了最近一项研究的支持，该研究指出疫苗诱导的抗Env抗体足以在一定程度上抵御SIV和HIV的攻击5。
Env糖蛋白前体gp160在内质网中合成后，会经历多种翻译后修饰，这些修饰对其驱动病毒融合过程的能力至关重要。Env前体必须正确折叠并形成三聚体，随后被切割为胞外的gp120和跨膜的gp41亚基6-10，其中gp120与gp41之间通过非共价相互作用保持连接。感染细胞的合成机制还会对Env进行高度糖基化修饰，糖链约占其总质量的50%11,12。这种复杂的结构使Env具有构象灵活性13,14，同时具备一种亚稳态特性，被认为可使Env适应环境并隐藏某些原本暴露的高免疫原性表位15-19，凸显了深入理解天然Env三聚体所呈现的各种构象的重要性。
迄今为止，已有多种技术被开发并成功用于研究Env构象变化。然而，这些技术各有局限性，通常仅适用于特定的Env环境。例如，基于构象特异性单克隆抗体（mAbs）的表面等离子共振或免疫沉淀实验，依赖于单体可溶性或经溶解处理的Env分子，而这些分子在免疫原性上已知与其三聚体形式存在差异20,21。最近的研究还表明，切割过程会影响Env的构象，导致主要被非中和抗体识别的表位暴露14,22,23。
本文详细描述了一种可快速、简便地测定细胞表达的Env三聚体构象的方法18,24-26。在将Env瞬时转染至人源贴壁细胞系后，利用简单的化学发光反应检测Env特异性抗体的结合情况。该技术还可用于表征构象依赖性抗体的构象偏好性。因此，该检测方法具有高度的稳健性和灵活性。

<table><tbody><tr><td>HOS 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1543</td><td></td></tr><tr><td>白色不透明组织培养板，96 孔，平底</td><td>BD</td><td>353296</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯亚胺，线性，25,000 MW</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td>配制成 1 mg/ml 溶液</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Invitrogen</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记山羊抗人 IgG</td><td>Pierce</td><td>31413</td><td></td></tr><tr><td>增强型化学发光底物</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL105001EA</td><td></td></tr><tr><td>TriStar LB 941 酶标仪</td><td>Berthold Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用基于细胞的elisa检测法对hiv-1三聚体包膜糖蛋白进行构象评估

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 包膜糖蛋白（Env）介导病毒进入靶细胞，是感染周期中必不可少的成分。深入了解这些糖蛋白如何通过构象变化驱动融合过程，有助于设计出更优、更有效的疫苗免疫原。本文描述了一种基于细胞的 ELISA 检测方法，可用于研究单克隆抗体对三聚体 HIV-1 Env 的识别。首先在转染细胞表面表达 HIV-1 三聚体 Env，随后将针对 Env 的构象特异性抗体与细胞孵育。利用辣根过氧化物酶标记的二抗及简单的化学发光反应，检测结合的抗体。该系统具有高度灵活性，可检测由可溶性 CD4 或细胞蛋白诱导的 Env 构象变化。该方法所需材料极少，且无需高度专业化的设备或技术。因此，该技术适用于抗原和抗体的中高通量筛选，例如新分离的抗体。

根据上述通用实验流程，我们对该方案进行了调整，用于检测可溶性CD4（sCD4）以及共表达的细胞CD4对野生型（wt）或突变型Env上CD4诱导型（CD4i）表位暴露的影响，具体方法如先前所述18,24,25,28。图1示意图展示了该通用实验流程，以及经sCD4处理或细胞CD4共表达后CD4i表位的暴露情况18。在图2中，我们使用sCD4诱导Env构象变化，从而暴露CD4i单克隆抗体17b和48d的表位，这些表位与共受体结合位点重叠24,29；而识别外结构域的单克隆抗体2G12则如预期所示，不受该处理的影响18,24。
点突变对Env构象的影响也可通过本实验进行评估，如图3所示。在此，我们使用了两种Env突变体：一种是第1层Env突变体H66A，已知其自发采样CD4结合构象的能力降低18,24,30,31；另一种是S375W突变体，该突变体使Env更倾向于处于CD4结合状态<...

了解病毒表面抗原的构象对于评估抗体中和作用以及指导有效疫苗免疫原的设计至关重要。本文介绍一种基于细胞的ELISA检测方法，可用于研究特异性抗Env抗体对转染细胞表面表达的三聚体HIV-1 Env的识别情况。

利用基于细胞的ELISA检测法对HIV-1三聚体包膜糖蛋白进行构象评估

HIV-1包膜糖蛋白（Env）介导病毒进入靶细胞，在感染周期中起关键作用。了解这些糖蛋白……

以下实验的总体目标是利用单克隆抗体检测RIC HIV-1包膜糖蛋白（ENV）的构象状态。首先转染贴壁细胞，使其在细胞表面表达嵌合型HIV-1 ENV蛋白；第二步，将细胞与抗ENV单克隆抗体孵育，抗体将根据表位暴露情况与ENV结合。接下来，加入HRP标记的二抗，通过化学发光检测法来定量抗体的结合情况。根据每份样品获得的相对光单位，可得到VNV结合抗体的相对水平。该技术相较于现有方法（如基于流式细胞术的分型）的主要优势在于，仅需少量抗体即可实现高通量操作，本实验将由实验室的一名博士后完成该技术操作。在转染前一天，将人成骨肉瘤细胞以每孔2×10⁴个细胞的密度接种于适合进行发光检测的不透光96孔细胞培养板中。使用添加了胎牛血清和青霉素-链霉素的DMEM培养基，在37°C及5%二氧化碳条件下培养过夜，次日进行后续实验。配制转染混合物。首先，准备两支试管，将两份A液和两份B液分别加入两支试管中。每管加入5微升DMEM培养基（添加25毫摩尔HEPES），随后加入10纳克tat和包膜质粒，以及150纳克编码嵌合型HIV-1包膜糖蛋白的质粒。请注意，只有在使用依赖 TAT 的 HIV-1 包膜糖蛋白编码质粒时，才需要 TAT 编码质粒，将其与 5 微升 DMM 和 450 纳克聚乙烯亚胺（PEI）混合。试剂和 DNA 的用量应根据需转染相同 HIV-1 包膜糖蛋白的孔数进行调整。接下来，将 B 管中的内容物加入到另一个 2 mL 离心管中，并通过涡旋振荡 10 秒充分混匀。将转染混合物在室温下孵育10分钟。10分钟后，向96孔板的每孔中加入10微升转染混合物，在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育48小时。在人骨肉瘤细胞转染后两天进行Ali SA实验，以研究单克隆抗体对嵌合型HIV-1包膜糖蛋白的识别。每块同时使用的培养板准备 250 毫升洗涤缓冲液。通过向洗涤缓冲液中加入 1% 脱脂干牛奶和 5 毫摩尔 Tris（pH 8.0），为每块培养板准备 125 毫升封闭缓冲液。从 96 孔板中移除细胞培养基和转染混合物。每孔加入 100 微升封闭缓冲液，室温孵育 20 分钟。室温下移除上清液，每孔加入 50 微升用封闭缓冲液稀释至适当浓度的抗体，室温孵育 1 小时。用 100 微升封闭缓冲液洗涤三次，然后重复洗涤过程三次。用 100 微升封闭缓冲液洗涤三次，最后一次洗涤后，再用 100 微升洗涤缓冲液洗涤三次。移除样本。加入100 µL封闭缓冲液，室温孵育5分钟。室温下移除上清液，加入50 µL用封闭缓冲液按1:3000比例稀释的二抗。室温孵育40分钟，孵育时间40分钟后结束。用100微升封闭缓冲液洗涤三次，随后用100微升洗涤缓冲液洗涤三次。为准备样品进行数据采集，从96孔板中移除上清液，并向每孔加入30微升一倍浓度的增强型化学发光底物。在合适的酶标仪上，对每孔采集1秒的化学发光信号。根据制造商的说明，可溶性 CD4（sCD4）对包膜糖蛋白（ENV）上 CD4i 表位暴露的影响通过检测 CD4 与 ENV 的相互作用进行评估。CD4 与 ENV 的结合会诱导 ENV 发生构象变化，从而暴露与共受体结合位点重叠的 17B 和 48D 表位，但不影响识别外结构域的抗体 2G12。为了评估 NV 构象中单点突变的影响，使用了两种 ENV 突变体：H66A（其自发采样 CD4 结合构象的倾向降低）和 S375W（其使 NV 更倾向于处于 CD4 结合状态）。将原始数据根据表达水平进行归一化后发现，H66A 会减弱 CD4i 17B 的识别，而 S375W 则增强 17B 信号，并足以恢复 H66A 的表型。通过共转染不同量的CD4表达质粒，对突变体进行细胞检测。NV蓝色柱状图显示，针对CD4的单克隆抗体A32和C11的信号逐渐增强，这两种抗体可识别ENV糖蛋白内结构域中的非连续性表位。而2G12抗体对gp120 ENV的识别未受影响。最后，将原始数据归一化至两个 G12；当 ENV 与一种 CD4 突变体共转染时，32 和 C11 的调制消失，表明信号增强依赖于 ENV 与 CD4 的相互作用。一旦掌握，该技术可在四小时内完成。

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

HIV-1的三聚体包膜糖蛋白的构象评估使用基于细胞的ELISA检测

在许多情况下，可以通过使用先进的从头折叠（ab initio）折叠算法对HIV-1表面包膜糖蛋白（gp120）V3环第10至22位氨基酸进行计算机模拟折叠，从而在结构上表征不同V3环序列的冠状区域。本文中，我们展示了HIV-1...

通过免疫学相关动态三级结构特征评估HIV-1 V3环冠状R2序列 从头算 折叠

我们开发了一种慢病毒载体，该载体除了具有Tat响应性LTR外，还含有Rev响应元件（RRE），能够以HIV-1...

利用表达绿色荧光蛋白的Rev依赖型慢病毒载体特异性标记HIV-1阳性细胞

本方案描述了一种利用冷冻电子断层扫描和三维图像处理技术测定膜蛋白结构的高通量方法。内容涵盖了样品制备、数据采集、数据处理与解析的详细步骤，并以HIV-1包膜糖蛋白作为该方法的代表性研究目标进行示例。这些计算处理流程的设计使得研究人员和学生能够远程开展工作，参与数据处理与结构分析。...

利用冷冻电子断层扫描与自动化子断层平均化技术测定HIV包膜糖蛋白的分子结构

通过RNA文库筛选分离出多个针对HIV-1Ba-L gp120、具有纳摩尔亲和力的2’-氟代RNA适配体 体外 SELEX 流程。一种新型双抑制功能抗 gp120 适配体-siRNA 嵌合体被成功构建，在全身性抗 HIV...

细胞类型特异性抗HIV gp120适配体的开发及其用于siRNA递送

本文介绍了一种利用全内反射荧光（TIRF）显微镜在玻璃支撑的平面双层膜上可视化HIV-1包膜蛋白诱导的病毒学突触形成的方法。该方法还可与免疫荧光染色相结合，用于检测HIV-1包膜蛋白诱导病毒学突触形成过程中信号分子的活化与重新分布。...

在合成脂双层上成像HIV-1包膜诱导的病毒学突触及信号传导

我们在此展示一种 体外 基于小麦胚芽表达系统合成的YFP标记Gag蛋白，通过可视化分析HIV-1 Gag与脂质膜之间的相互作用的膜结合实验 体外 翻译系统和通过电形成技术制备的GUVs。...

HIV-1 Gag 与巨大单层囊泡（GUV）膜结合的可视化观察

本文描述了一种在单细胞水平上对外周血单个细胞（ex vivo）同时定量96个基因和18种表面蛋白表达水平的方法，可用于鉴定病毒感染细胞与未感染细胞之间差异表达的基因和蛋白。我们应用该方法研究从中国台湾恒河猴中分离的SIV感染的CD4+...

从恒河猴中分离的猴免疫缺陷病毒感染的 CD4+ T 细胞中 mRNA 和表面蛋白表达的单细胞定量分析

我们描述了一种基于细胞的检测方法，通过表达绿色荧光蛋白并利用流式细胞术或荧光显微镜进行检测，以报告HIV-1的融合过程。via该方法可用于在无细胞感染系统和细胞间感染系统中测试病毒进入抑制剂（特异性作用于融合步骤）。...

一种高通量Cre-Lox激活的病毒膜融合检测方法用于筛选HIV-1病毒膜融合抑制剂

本文介绍了一种用于检测抗原展示型病毒样颗粒（VLPs）上中和表位的实验方案。利用与蛋白G偶联磁珠结合的包膜糖蛋白特异性单克隆抗体，对来源于人类免疫缺陷病毒（HIV）的VLPs进行免疫沉淀。捕获的VLPs随后通过SDS-PAGE分离，并使用针对病毒核心蛋白Gag的特异性抗体进行Western印迹分析。...

利用捕获法检测基于病毒样颗粒（VLP）疫苗中抗原的中和敏感性表位

本文介绍了一种新开发的多重荧光免疫测定法，该方法利用双报告系统流式细胞术，同时检测完整严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）病毒颗粒上的两个独特刺突蛋白表位，这些病毒颗粒已被血管紧张素转换酶2偶联的磁性微球捕获。...

通过多重双报告基因策略对病毒颗粒表面蛋白表位进行分析

本文介绍了一些用于检测内质网（ER）应激及未折叠蛋白反应（UPR）激活的成熟方法，特别侧重于在HIV-1感染中的应用。此外，本文还描述了一系列用于研究内质网应激/UPR对HIV-1复制及病毒颗粒感染性影响的实验方案。...

测量HIV-1感染T细胞中的内质网应激与未折叠蛋白反应及其在HIV-1复制中的作用分析

了解基于细胞的ELISA检测技术，用于评估HIV-1三聚体包膜糖蛋白构象与单克隆抗体的相互作用。该方法具有高通量、抗体用量少的优势，可指导疫苗免疫原设计。

利用基于细胞的ELISA检测法对HIV-1三聚体包膜糖蛋白进行构象评估

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