Name: 使用低温电子断层扫描和自动子断层扫描平均HIV包膜糖蛋白分子结构的测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: 了解如何使用低温电子断层扫描和自动子断层扫描平均技术测定HIV包膜糖蛋白分子结构。该方法通过冷冻样品制备、数据采集与计算处理，为疫苗设计提供关键的结构生物学信息。

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我们感谢SAIC Frederick公司艾滋病与癌症病毒计划中的生物制品部门提供纯化的经AT-2处理的HIV-1病毒，感谢Steven Fellini及其同事在使用美国国立卫生研究院（NIH）位于马里兰州贝塞斯达的Biowulf Linux高性能计算集群 <a href="http://biowulf.nih.gov">(http://biowulf.nih.gov)</a> 方面提供的协助，感谢FEI公司对电子显微镜技术的支持，以及Ethan Tyler在图表制作方面的专业帮助。本研究工作由位于马里兰州贝塞斯达的美国国家癌症研究所国家癌症研究中心的基金资助。

本文所述方法是使用一套特定的仪器、工具和软件开发的。由于各实验室可能不会采用完全相同的实验装置，因此在可能的情况下尽量对该方法进行了通用化处理，并在无法通用化的情况下提供了替代方案。
1. 准备受玻璃化状态的病毒样品
在下一节中，使用 FEI Vitrobot Mark III（一种用于滤纸吸附和浸入式冷冻的机器人）制备玻璃化冷冻载网。参见 Iancu， 等 有关使用该系统的详细方案 7作为机器人活塞的替代方案，剪刀式或重力活塞完全足够 6.
在第1.2和1.3节中，使用Gatan Solarus 950电晕放电仪对样品载网进行清洁并提高其亲水性，但也可使用任何专为透射电镜载网设计的电晕放电装置替代。
尽管在 blotting 和 plunge freezing 之前加到载网上样品体积应为 2 μL 左右，但样品混合物中病毒和蛋白A胶体金的体积会因来源不同而有所变化。因此，可能需要在显微镜下测试并成像多种病毒与胶体金的稀释度或比例，以通过实验确定最佳混合比例。需要注意的是，在第 3 部分采集图像数据时，应存在 10 至 20 个胶体金标记物，以确保倾转系列图像的正确对齐。
警告：本部分涉及使用易燃的气态乙烷、氢气和氧气。使用这些气体时应采取适当预防措施。此外，处理病毒样本时应遵循生物安全相关建议。最后，处理液氮（N2）和乙烷时，务必佩戴防护眼镜和防护服。
<ol>
<li>开启 FEI Vitrobot Mark III 的 N2 气体供应，安装加湿器滤芯，然后用过滤的去离子水填充滤芯。开启Vitrobot电源，并将其气候室温度设置为 22 °C，目标湿度设为100%， blotting 时间设为6秒，blot偏移设为-2 mm。</li>
<li>打开 Gatan Solarus 950 电晕放电仪电源并开启 H2 和 O2 为设备提供气体的气罐。通过在50瓦功率下进行1分钟辉光放电，预清洁样品室。</li>
<li>将所需数量的有孔碳支持膜载网排列在玻璃盖玻片上，碳膜面朝上，通过顶部装载门放入电晕放电样品室。在25瓦功率下进行6–10秒电晕放电处理以清洁载网。（注意：本实验方案中使用的Quantifoil品牌载网，其碳膜面呈哑光外观。但并非所有商用载网均如此，建议向制造商确认该信息。）</li>
<li>将网格盒放入冷却剂容器碗内，并将导热扩散转轴置于冷却剂碗内的中心杯上。缓慢倒入液氮2 直至剧烈冒泡现象减弱，表明烧杯与液体之间已达到平衡。保持液氮2 在后续操作过程中保持液面高度一致，注意避免液体进入中心杯中。</li>
<li>将塑料软管的一端连接到乙烷气罐，另一端连接到玻璃移液管。将玻璃移液管管尖置于中心杯底部，保持缓慢而稳定的乙烷气流，乙烷将开始冷凝。持续填充至中心杯充满为止。从中心杯中取出转轴。</li>
<li>通过添加制备样品混合物 2 μL 蛋白A-金胶体标记物 10 μL AT-2灭活的HIV-1病毒悬液。轻轻吹打混合液，使定位标记物充分悬浮于溶液中。置于冰上保存。</li>
<li>用专用的Vitrobot镊子夹住载网的外边缘。施加 2 μL 将样品混合物加至载网的碳膜面。立即指示机器人将样品载入加湿的气候室，吸去多余液体后迅速浸入液态乙烷中冷冻。</li>
<li>将玻璃化网格转移至网格盒中。重复步骤1.7以制备所需数量的网格。完成后，拧紧网格盒盖的螺丝，随后迅速将网格盒转移至小型液氮运输杜瓦瓶中。</li>
</ol>
2. 将样品装入透射电子显微镜
在整个部分中，液氮2 加样室中的液位应密切监测，并根据需要及时补充液体，以确保载网盒始终浸没在液体中。在将工具与载网接触之前，应将其浸入液氮中冷却。2 直到与液体达到平衡。每次使用后，应使用热风枪对工具进行解冻。
在本节中，FEI Tecnai G2 Polara 透射电子显微镜（TEM）与 Gatan Cryo Workstation 配合使用。尽管在液氮环境下装载样品的原理2 实验条件适用于所有冷冻电子显微镜工作，但本节中的步骤针对实验所用设备而定。不同设备所采用的步骤将因制造商而异。
警告：在本节所有操作中，处理液氮时务必佩戴护目镜并穿戴防护服2.
<ol>
<li>确保透射电镜样品台（TEM Compustage）中不包含样品盒，且样品选择杆和插入杆温度低于 110 K。</li>
<li>冷却并准备冷冻工作站，用于将载网装入样品储存块中，该储存块为样品选择杆的一部分。</li>
<li>将已冷却（&lt; 110 K）的选择杆从显微镜转移至冷冻工作站。</li>
<li>向前滑动选择杆，将选择块插入冷冻工作站的液氮浴中。使用专用的样品盒夹持镊子从储存块中取出所有样品盒。将载网盒放入装载工作站，并用螺丝刀松开盖子。</li>
<li>使用镊子从载网盒中取出载网并放入样品盒中。使用专用的 C 形夹安装工具将 C 形夹放置在载网上方，以固定载网。</li>
<li>重复步骤 2.5，直至所需数量的载网均装入样品盒中。将样品盒转移至样品选择块中。</li>
<li>准备冷冻工作站，以便取下样品选择杆。向后滑动选择杆，将选择块从液氮浴中取出。将选择杆从冷冻工作站取下并连接至透射电镜（TEM）。</li>
</ol>
3. 获取冷冻电子显微镜数据
在本节中，使用 FEI 批量断层扫描软件界面设置一个批处理文件，用于存储所有感兴趣网格位置的坐标。当用户发出指令后，批量断层扫描软件将重新访问每个位置，并通过 Digital Micrograph 协调倾转系列图像的采集。如果该软件不可用，Leginon 软件包是一个可行的免费开源替代方案13。成像在 200 keV 下进行，使用配备 post-GIF 2K × 2K CCD 相机（Gatan）的 Gatan 成像滤镜（GIF）。
<ol>
<li>调整样品台位置，使电子束穿过真空区域。切换至高倍率（34kX）曝光模式，并执行直接对中。</li>
<li>在能量滤波器上对零损失峰进行对中。（此步骤为能量滤波器提供无能量损失电子的参考基准。）</li>
<li>将样品台移至含有碳膜的载网区域。在低倍率（4.5kX）搜索模式下，使用Wobbler功能将样品台在±15°范围内反复倾斜。同时调节Z轴位置，直至观察到最小的图像漂移。（此操作将样品台大致调整至等心高度。）当无明显图像漂移时，关闭Wobbler功能。</li>
<li>使用自动等心高度功能进一步优化等心高度。（该程序采用互相关算法，获得比步骤3.3更精确的等心高度。）等心高度将被自动保存，供后续批量断层成像软件调用。</li>
<li>寻找一个包含约三至六个病毒颗粒且不少于十个标志金颗粒的感兴趣区域。将该载网位置添加至批量断层成像文件中。</li>
<li>重复步骤3.4和3.5，直至设定所需数量的位置。定义批量参数（±60°倾转范围，倾转步长2°，每倾转图像采集1–2 e-/Å2），然后开始批量采集。</li>
</ol>
4. 重建冷冻电子断层图像
<ol>
<li> 使用 RAPTOR 中的自动标记点对准功能对倾斜系列图像进行对准 1.</li>
<li>使用 IMOD 中的 R 加权反投影重建断层图像 8结果数据体的标准文件格式为MRC文件，其文件扩展名为.mrc。</li>
</ol>
5. 分割病毒粒子亚体积并识别刺突
本节使用 IMOD 的一个自定义扩展程序，允许用户在断层图中指定病毒颗粒的子体积。在第6节中，用户定义的病毒颗粒边界将用作自动选取刺突蛋白的表面。
<ol>
 <li>打开 IMOD 并加载包含病毒颗粒的断层图像。</li>
 <li>沿断层图像的 Z 轴方向浏览，直至找到穿过其中一个病毒颗粒的中心切片。确认病毒颗粒的质心已被识别。完成确认后，放置一个病毒颗粒标记。该标记将在第 6 节的自动病毒颗粒分割工具中使用。</li>
 <li>继续进行质心标注，直到所有病毒颗粒体积均被识别。</li>
 <li>关闭断层图像并保存定义病毒颗粒质心的标记集。对所有断层图像重复此过程，直至完成全部病毒颗粒的标注。</li>
 <li>使用 IMOD 将病毒颗粒子断层图像下采样四倍。</li>
 <li>使用 IMOD 中实现的边缘增强型各向异性扩散方法对病毒颗粒进行去噪处理。</li>
 <li>采用基于能量的三维方法对病毒颗粒进行无监督膜结构分割（详见 Bartesaghi et al. 2005）3。</li>
 <li>通过计算特定位置与合成的对称 spike 样体积之间的互相关，识别分割后病毒颗粒表面局部最大值位置的刺突蛋白。高于设定阈值的位置将被添加至候选刺突子体积的坐标列表中。</li>
</ol>
6. 颗粒的分类与平均化
<ol>
 <li>在步骤 5.8 中确定的每个位置，计算提取断层图像的子体素（100 × 100 × 100 体素）。（此步骤无需去噪或合并像素。）所得的子体素集合包含将在后续步骤中进行分类和平均的刺突蛋白。</li>
 <li>利用每个刺突蛋白位置处自动分割的膜的法向，确定刺突蛋白长轴的方向。该方法为三个欧拉角中的两个提供初始估计值。</li>
 <li>对剩余的原位旋转进行随机化，以防止在后续比对中引入任何可能的偏差。</li>
 <li>将欧拉角应用于子体素，然后通过平移比对将子体素与其圆柱对称平均后的全局平均结构对齐，以确保所有子体素具有相同的质心。</li>
 <li>剔除与更新后的全局平均结构相关性最差的 10% 子体素。此步骤旨在去除最有可能被错误识别为刺突蛋白的密度。</li>
 <li>在不使用外部参考结构的前提下，对刺突蛋白体素进行比对和分类，并正确考虑缺失楔形区域的影响（详见 Bartesaghi et al. 2008）4。在每次迭代中逐步优化子体素的比对，并对刺突蛋白体素进行分类。</li>
 <li>在分类的早期阶段应能清晰观察到三重对称性；在第四次迭代时施加三重对称性约束。每一轮中，选择最清晰定义的类别进行平均，并作为下一轮的参考结构。</li>
 <li>通常每个数据集应选择约 4000 个刺突蛋白。最终的密度图在经过约 5–12 轮优化后获得，每轮优化中每个数据集约有 50% 的子体素参与贡献。</li>
</ol>
7. 坐标拟合
<ol>
 <li>在 UCSF Chimera 中打开步骤 6.8 得到的密度图12。</li>
 <li>使用 Chimera 或 EMAN10对X射线坐标生成模拟的 20 Å 分辨率的密度图。</li>
 <li>将坐标以随机取向进行对接。利用 Chimera 内置的最速上升法局部优化功能，通过执行多次 100 步的最速上升步骤，对坐标进行拟合，直至达到收敛。</li>
</ol>
8. 代表性结果
利用三维平均化和坐标拟合技术，已解析出多种HIV和SIV Env刺突蛋白的结构。图3A展示了HIV-1毒株BaL（紫色）的包膜刺突结构。该刺突蛋白具有三重对称性，从膜表面至刺突顶端的高度约为120 Å，在刺突基部宽度最宽处约为150 Å，向下逐渐变细至基部约35 Å。如图3B所示，通过将利用冷冻电子断层扫描技术获得的三聚体Env密度图与通过X射线晶体学确定的单体gp120结构（红色，源自PDB编号2NY7）相结合，我们得以构建出三聚体包膜糖蛋白复合物的工作分子模型（PDB编号，3DNN）9。
我们的方法还允许对三聚体Env与多种gp120特异性蛋白片段及抗体之间形成的复合物进行结构分析。其中一个示例如图4A所示，其中Env与广谱中和性b12 Fab片段形成复合物（整个复合物以紫色显示）。在该图中，对应于b12的额外密度从刺突向外延伸，并与膜平行。通过将密度图与刺突蛋白部分的原子坐标拟合（结合相应的配体），可将此类复合物的结构解释延伸至分子水平。如图4B所示，当该密度图与gp120刺突蛋白（红色，来源于PDB编号2NY7）与b12 Fab（白色）结合的坐标进行拟合时，可以分辨出三个gp120核心的相对取向（PDB编号3DNL）。这些构象关系有助于理解此类配体如何与刺突蛋白相互作用并干扰病毒活性。利用本文所述方法解析的其他一些未结合配体及结合配体的Env结构还包括：HIV-1 R3A、SIV CP-MAC、SIVmneE11S和SIVmac239，HIV-1 Bal Env、sCD4与17b Fab形成的三元复合物，以及SIV CP-Mac Env与7D3抗体形成的复合物9,14。
<img src="/files/ftp_upload/2770/2770fig1.jpg" align="Figure 1" alt="病毒冷冻电镜流程图：玻璃化、电子显微镜、断层重建。" data-altupdatedat="1787630408000"> 
图1. 从病毒悬液到三维结构：冷冻电子显微镜与三维重建的概念步骤。
<img src="/files/ftp_upload/2770/2770fig2.jpg" align="Figure 2" alt="冷冻电子显微镜、断层扫描结果；病毒颗粒结构与可视化。" data-altupdatedat="1787630408000"> 
图2. (A) HIV-1病毒颗粒断层图像的代表性切片。(B) 单个HIV-1病毒颗粒，核心和表面刺突结构以示意图形式展示。
<img src="/files/ftp_upload/2770/2770fig3.jpg" align="Figure 3" alt="冷冻电镜结构分析、三维蛋白质模型比较、分子可视化图示。" data-altupdatedat="1787630408000"> 
图3. (A) HIV-1 BaL 包膜糖蛋白（表面刺突）在病毒膜表面展示的三维结构。(B) 通过将三份由X射线晶体学解析得到的单体gp120（红色）结构置入密度图中，确定的三聚体刺突的分子模型9。
<img src="/files/ftp_upload/2770/2770fig4.jpg" align="Figure 4" alt="蛋白质结构建模；三维可视化；示意图；分子分析；结构比较。" data-altupdatedat="1787630408000"> 
图4. (A) HIV-1 BaL 包膜糖蛋白与一种广谱中和抗体 b12 的 Fab 片段形成的复合物的三维结构。(B) 通过将三份由X射线晶体学解析得到的单体gp120-B12 Fab复合物结构置入密度图中所构建的复合物分子模型9。

<ol><li>Amat, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markov+random+field+based+automatic+image+alignment+for+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Markov random field based automatic image alignment for electron tomography.</a> J. Struct. Biol. 161, 260-275 (2008).</li>
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<li>Liu, J., Bartesaghi, A., Borgnia, M. J., Sapiro, G., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+native+HIV-1+gp120+trimers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of native HIV-1 gp120 trimers.</a> Nature. 455, 109-113 (2008).</li>
<li>Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMAN%3A+Semiautomated+Software+for+High-Resolution+Single-Particle+Reconstructions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">EMAN: Semiautomated Software for High-Resolution Single-Particle Reconstructions.</a> J. Struct. Biol. 128, 82-97 (1999).</li>
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<li>Suloway, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+molecular+microscopy%3A+the+new+Leginon+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated molecular microscopy: the new Leginon system.</a> J. Struct. Biol. 151, 41-60 (2005).</li>
<li>White, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architectures+of+trimeric+SIV+and+HIV-1+envelope+glycoproteins+on+intact+viruses%3A+strain-dependent+variation+in+quaternary+structure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+Pathog%22%5BJournal%5D)">Molecular architectures of trimeric SIV and HIV-1 envelope glycoproteins on intact viruses: strain-dependent variation in quaternary structure.</a> PLoS. Pathog. 6, e1001249-e1001249 (2010).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

冷冻电子显微镜及三维分类与平均化方法可实现包膜糖蛋白复合物三维结构的解析 &tilde; 20 &Aring; 分辨率。将单体组分的X射线坐标拟合到密度图中，可实现分子水平的结构解析。低成本计算设备的持续进步，结合开源科学工具的发展以及网络基础设施的普及，使得以往难以想象的科学协作成为可能。我们充分利用这些进展，证明先进的科学技术可以惠及各个年龄段的学生。

<table><tbody><tr><td>多孔A型碳支持膜载网</td><td>Quantifoil Micro Tools</td><td>-</td><td>200目</td></tr><tr><td>蛋白A金胶体</td><td>乌得勒支大学 - 荷兰</td><td>-</td><td>直径10 nm</td></tr><tr><td>HIV-1 BaL</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>-</td><td>约 10&lt;sup&gt;11&lt;/sup&gt; 病毒颗粒/mL</td></tr><tr><td>冷冻电镜样品储存盒</td><td>Pacific Grid Tech</td><td>GB-4R</td><td>4孔，圆形</td></tr><tr><td>Vitrobot Mark III</td><td>FEI</td><td>-</td><td>6秒 blot 时间，-2 mm 偏移量，100% 湿度</td></tr><tr><td>Tecnai G2 Polara 透射电子显微镜</td><td>FEI</td><td>-</td><td>200 keV</td></tr><tr><td>Gatan 成像滤镜</td><td>Gatan</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Gatan Post-GIF CCD</td><td>Gatan</td><td>-</td><td>2K × 2K 像素</td></tr><tr><td>Gatan 冷冻工作站</td><td>Gatan</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Gatan Solarus 950 等离子清洗系统</td><td>Gatan</td><td>-</td><td>氧气和氢气等离子体</td></tr><tr><td>C型夹</td><td>FEI</td><td>ZIT0634</td><td>-</td></tr><tr><td>Biowulf 计算集群</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>-</td><td>&lt;a href=&quot;http://biowulf.nih.gov/">http://biowulf.nih.gov/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>UCSF Chimera</td><td>加利福尼亚大学 - 旧金山</td><td>-</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/">http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>IMOD</td><td>科罗拉多大学 - 博尔德</td><td>-</td><td>&lt;a href=&quot;http://bio3d.colorado.edu/imod/">http://bio3d.colorado.edu/imod/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>EMAN</td><td>贝勒医学院</td><td>-</td><td>&lt;a href=&quot;http://blake.bcm.tmc.edu/eman/">http://blake.bcm.tmc.edu/eman/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RAPTOR</td><td>斯坦福大学</td><td>-</td><td>&lt;a href=&quot;http://www-vlsi.stanford.edu/TEM/index.htm">http://www-vlsi.stanford.edu/TEM/index.htm&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

利用冷冻电子断层扫描与自动化子断层平均化技术测定hiv包膜糖蛋白的分子结构

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

自近30年前被发现以来，人类免疫缺陷病毒（HIV）已感染了超过6000万人<a href="http://www.usaid.gov">(www.usaid.gov)</a>。该病毒通过感染并破坏CD4+ T细胞，从而严重损害免疫系统，导致获得性免疫缺陷综合征（AIDS）2。感染始于HIV包膜糖蛋白“刺突”与CD4+ T细胞表面的CD4受体接触。这一相互作用诱导刺突发生构象改变，进而促进其与第二个细胞表面共受体的结合5,9。这些蛋白质相互作用在HIV感染通路中的关键作用，使其在基础HIV研究以及HIV疫苗的开发中具有极其重要的意义。
更好地理解 HIV 与细胞接触及中和过程中的分子尺度相互作用，推动了用于确定 HIV 刺突蛋白与细胞表面受体蛋白以及阻断感染的分子相互作用结构的技术发展。利用冷冻电子断层扫描技术与三维图像处理方法，我们近期证明了可在天然病毒表面解析此类结构的能力，达到 &tilde;20 &Aring; 分辨率 9,14该方法不仅限于解析HIV包膜蛋白结构，还可推广至其他病毒膜蛋白以及在脂质体上重建的蛋白质。在本方案中，我们描述了从纯化的HIV病毒颗粒出发，逐步制备冷冻玻璃态样品、采集冷冻电子显微镜数据、重构和处理三维数据集、对三维蛋白质子体积进行平均与分类，以及解析结果以生成蛋白质模型，最终获得HIV包膜糖蛋白结构的全过程。本方法的计算部分已整合为多个模块，可通过美国国立卫生研究院（NIH）的Biowulf GNU/Linux并行计算集群远程访问并执行。 <a href="http://biowulf.nih.gov">（http://biowulf.nih.gov）</a>这种远程访问能力，结合低成本的计算机硬件和高速网络接入，使得研究人员和学生能够在学校或家中开展工作。

本方案描述了一种利用冷冻电子断层扫描和三维图像处理技术测定膜蛋白结构的高通量方法。内容涵盖了样品制备、数据采集、数据处理与解析的详细步骤，并以HIV-1包膜糖蛋白作为该方法的代表性研究目标进行示例。这些计算处理流程的设计使得研究人员和学生能够远程开展工作，参与数据处理与结构分析。

利用冷冻电子断层扫描与自动化子断层平均化技术测定HIV包膜糖蛋白的分子结构

自近30年前被发现以来，已有超过6000万人感染了人类免疫缺陷病毒（HIV）（www.usaid.gov）。

已有超过6000万人感染了导致艾滋病的病毒——人类免疫缺陷病毒（HIV）。HIV/AIDS 是一场全球性的公共卫生危机，尽管深入的研究工作已显著延长了感染者的寿命，但真正有效的疫苗至今仍未问世。目前HIV疫苗研究的一个主要方向是病毒的包膜糖蛋白，HIV正是利用这种蛋白进入靶细胞。在本视频中，我们展示了如何利用一种名为冷冻电子断层扫描的成像技术，获得这种重要蛋白质的结构。从纯化的HIV开始，我们演示了冷冻样品制备的步骤、从这些冷冻样品中采集透射电子显微镜图像的步骤，以及将这些图像转化为可用于HIV艾滋病疫苗设计的结构模型的步骤。本视频展示内容的一个独特之处在于，实验工作将由实验室成员亲自完成，其年龄跨度广泛，包括初中和高中学生、大学及研究生阶段的学生，直至博士后研究员和资深科学家。制备适用于冷冻电子断层扫描的玻璃化病毒样品，需将病毒的水相悬浮液铺展在由铜网支撑的碳膜小孔上，随后迅速冷冻病毒。该步骤的目的是制备出完整病毒颗粒的冷冻样品，使其保持接近天然状态。首先，将载网放入电晕放电仪中。该设备通过将载网暴露于离子化气体中对其进行清洁。现在载网已准备就绪，接下来制备含有病毒悬浮液与微小金颗粒的混合物。这些颗粒对于数据的采集与处理至关重要。接下来，将一滴病毒悬液置于 freshly plasma cleaned 载网上。然后将载网放入机器人装置中，用滤纸吸去多余液体，使液滴形成一层薄膜。随后将样品迅速浸入液态乙烷中，使病毒以超过每秒 100,000 开尔文的速率快速冷冻。将冷冻后的载网转移至储存盒中，以便运送至显微镜。重复此步骤，直至制备出所需数量的载网。现在病毒样品载网已准备就绪，下一步是将其装入显微镜中。在成像过程中，此步骤可手动完成，也可借助机器人辅助完成。当手动加载样品载网时，操作人员坐在专用操作台前，在液氮环境下对样品进行操作，随后将样品放入一个便携式氮气冷却腔室中，密封、抽真空，然后连接至显微镜。较新型的显微镜具备更高程度的自动化样品加载能力。在此Titan Cryos显微镜中，用户将冷冻样品送入显微镜，随后通过机器人自动装载载有样品的载网。在开始成像之前，用户可对每张载网进行检查。针对样品载网上具有感兴趣特征的每个区域，需分别设置显微镜参数。在此情况下，这些特征是HIV病毒。每当定义一个新的区域时，显微镜的计算机将存储该区域特定的成像参数。当用户定义完所有感兴趣的位点后，计算机会自动重新访问每个位点并采集一组数据。每个数据集的采集都需要相对于电子束倾斜样品网格，同时确保电子束始终聚焦在网格的同一位置上。在电子显微镜中，数据采集传统上要求用户坐在显微镜前，并与设备进行物理交互。这种显微镜操作方式在奥巴马总统参观英特尔工厂期间的访问中有所展示。显微镜计算机接口的最新进展使得用户能够通过实验室内外的远程计算机实时监控和调整数据采集。为了可视化包膜和糖蛋白刺突的形态，必须对数百张单独图像的信息进行平均处理，以增强信号。这一计算密集型过程在此通过使用名为 Bio Wolf 的计算机集群来完成。位于美国国立卫生研究院（NIH），研究人员已开发出强大的方法，能够提取单个体积数据，并利用可在高噪声水平下运行的算法对信息进行平均。这类数据固有的特性使得从天然病毒以及与生物学重要分子形成复合物的病毒中获得的密度图，为HIV的结构生物学提供了丰富的信息数据库。当这些数据与包膜糖蛋白刺突各个亚基的X射线晶体学信息相结合时，密度图便在分子细节层面呈现出生动的结构图像。这些断层扫描产生的数据可能非常密集且难以解释。可以使用娱乐行业的三维软件，通过添加颜色、纹理和光照来可视化三维模型，从而使其更易于分析。常用的可视化软件包括 Mirror 3D Studio Max 和 Maya。我们刚刚逐步演示了如何从纯化的 HIV 出发，获得包膜糖蛋白结构的分子模型。利用该方法，我们还确定了包膜糖蛋白与多种能够结合并利用该病毒的分子形成复合物后的结构。在此，我们展示了包膜糖蛋白与一种名为B12的抗体形成复合物的结构示例。了解为何某些分子能够结合并利用病毒，而其他分子则不能，对于合理设计疫苗至关重要。解析来自HIV或其他病毒（如流感病毒和埃博拉病毒）的包膜糖蛋白的分子结构，是理解病毒进入和利用机制的关键。正如您所见，冷冻电子断层扫描技术现已成为实现这一目标的强大工具。

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免疫学与感染

使用低温电子断层扫描和自动子断层扫描平均HIV包膜糖蛋白分子结构的测定

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了解如何使用低温电子断层扫描和自动子断层扫描平均技术测定HIV包膜糖蛋白分子结构。该方法通过冷冻样品制备、数据采集与计算处理，为疫苗设计提供关键的结构生物学信息。

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