Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

超过 6000 万人感染了 HIV，这种病毒会导致艾滋病。HIV AIDS 是一场全球性的健康危机，尽管密集的研究工作极大地帮助了感染者的生命，但真正的疫苗仍然难以捉摸。HIV 疫苗研究的一个主要重点是包膜糖蛋白，HIV 利用包膜糖蛋白进入靶细胞。

在本视频中，我们演示了如何使用称为冷冻电子断层扫描的成像技术获得这种重要蛋白质的结构。从纯化的 HIV 开始，我们展示了准备冷冻标本的步骤、从这些冷冻标本中记录电子显微图像的步骤以及将这些图像转换为可用于 HIV 艾滋病疫苗设计的结构模型的步骤。我们在本视频中展示的一个独特之处在于，这项工作将由她实验室的成员演示，年龄范围很广，从初中生和高中生到大学和研究生，一直到博士后研究员和高级科学家。

适用于冷冻电子断层扫描的玻璃化病毒样品的制备是通过将病毒水性悬浮液铺布在铜网格支撑的碳膜上的小孔中，然后快速冷冻病毒来完成的。此步骤的目标是制备以接近天然状态捕获的完整病毒的冷冻标本。首先，将网格放置在辉光放电装置内。

该设备通过将电网暴露在电离气体中来清洁电网。现在网格已准备好使用，准备了混合了小金颗粒的病毒悬浮液。这些颗粒对于数据收集和处理至关重要。

接下来，将一滴病毒悬浮液滴放在新鲜等离子体清洁的网格上。然后将网格加载到机器人中，机器人用滤纸吸干，将液滴减少为一层薄薄的液体。然后将样品浸入液态乙烷中，液态乙烷以超过每秒 100， 000 开尔文的速度迅速冻结病毒。

然后将插入式冷冻网格转移到储存箱中，以便运输到显微镜中。重复此作，直到冻结所需的网格数量。现在病毒样品网格已准备就绪，下一步是将它们加载到显微镜中。

对于成像，这可以手动或在机器人协助下完成。手动加载样品网格时，用户坐在专门的工作站上，可以在液氮下处理样品，将样品放入便携式氮气冷却室中，该室被密封、抽真空，然后连接到显微镜上。较新的显微镜能够实现更自动化的样品加载。

在 Titan Cryos 显微镜中，冷冻样品由用户输送到显微镜中，然后自动加载显微镜中加载的样品网格。用户可以在开始成像之前检查每个网格。显微镜参数针对样品网格上具有感兴趣特征的每个区域进行设置。

在这种情况下，特征是 HIV 病毒。定义每个新区域时，显微镜计算机会存储特定区域的成像参数。当用户定义了所有感兴趣的位置后，计算机会自动重新访问每个位置并收集数据集。

每个数据集都是通过使样品网格相对于电子束倾斜来收集的，同时确保电子束聚焦在网格上的同一位置。传统上，电子显微镜中的数据收集需要用户坐在显微镜前并与设备进行物理交互。这里展示了这种显微镜交互方式，当时奥巴马总统访问了一家英特尔工厂。

显微镜计算机界面的最新进展现在允许用户从实验室或其他地方的远程计算机实时监控和调整数据收集。为了可视化包膜的形状，必须对来自数百个单独图像的信息进行平均，以增强信号。这是一个计算密集型过程，在这里通过使用名为 Bio Wolf 的计算机集群来完成。

位于 NIH 的 NIH 已经开发了强大的方法来提取单个体积并使用可在高噪声水平下工作的算法对信息进行平均。此类数据固有的是从天然病毒和复杂到生物学重要分子的病毒获得的密度图提供了有关 HIV 结构生物学的丰富信息数据库。当数据与构成包膜糖蛋白加标的单个亚基的 X 射线晶体学信息相结合时，密度图在分子细节上变得生动起来。

从这些 tomos 中产生的数据可能非常密集且具有挑战性interpret. 3D娱乐行业的软件可以通过添加颜色、纹理和照明来可视化 3D 模型，使其更易于分析。常用的可视化软件包括 Mirror、3D Studio Max 和 Maya。

我们刚刚演示了如何获得包膜结构的分子模型的分步程序。糖蛋白，从纯化的 HIV 开始。使用这种方法，我们还确定了包膜糖蛋白与各种可以结合和利用病毒的分子复合物的结构。

在这里，我们展示了一个包膜糖蛋白与称为 B12 的抗体复合物的结构示例。了解为什么有些分子可以结合和利用病毒，而另一些分子则不能，这对于合理的疫苗设计非常重要。确定来自 HIV 或其他病毒（如流感和埃博拉病毒）的包膜糖蛋白的分子结构是了解病毒进入和利用的关键。

如您所见，冷冻电子断层扫描现在正在成为实现这一目标的强大工具。