Name: 使用捕获测定法检测基于病毒样颗粒（VLP）的疫苗上显示的抗原中和敏感表位 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 15 s
Description: 学习使用捕获测定法检测病毒样颗粒（VLP）疫苗上的中和敏感表位。该方法利用广谱中和抗体（bNABs）结合磁珠捕获技术，通过SDS-PAGE和Western blot分析评估疫苗候选物的质量，为疫苗开发提供可靠的质量控制手段。

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本工作由德国联邦教育与研究部资助项目“应用科技大学研究”（Forschung an Fachhochschulen）提供支持，合同编号分别为13FH767IA6和13FH242PX6（授予JS）。图1和图2使用BioRender.com制作。

1. 样品制备
<ol>
	<li>接种表达HIV结构基因的源自293-F细胞的VLP生产悬浮细胞系 gag 单独或协同作用 环境 30 在细胞密度为 0.5 x 10 的低密度条件下6 每毫升293-F表达培养基中的细胞数。</li>
	<li>让它们在3-4天内扩增 37 °C 和 8% CO2 在振荡培养箱中以5 cm轨道直径、135转/分钟（rpm）的转速旋转培养。</li>
	<li>通过离心在 100 x g 5 分钟。使用滤膜过滤澄清的上清液，以去除残留的细胞和细胞碎片 0.45 µm 聚偏二氟乙烯（PVDF）膜注射器滤器，用于获取无细胞的细胞培养上清液（CFSN）。 
	注意：此处可暂停实验方案。CFSN 可在 4 °C.</li>
	<li>可直接使用CFSN进行实验，或通过超速离心（112,700 x g）从35 mL CFSN中沉淀VLPs g, 4 °C，1.5 小时）。</li>
	<li>经超速离心后，弃去上清液，并将病毒样颗粒沉淀重悬于 200 µL 每离心管加入15% (w/v) 海藻糖溶液。 
	注意：VLP沉淀通常肉眼不可见。此处可暂停实验流程。VLP可在 -80 °C.</li>
	<li>在进行VLP捕获实验之前，使用ELISA测定含VLP样品中的病毒核心蛋白浓度。此步骤对于标准化捕获实验的加样量至关重要。</li>
</ol>
2. VLP 捕获实验
注意：工作流程概览见图2。
<ol>
	<li>通过反复吹打或在50 rpm转速的旋转仪上混合至少5分钟，使磁珠充分悬浮。</li>
	<li>同时，配制含有bNAb的抗体溶液。每个反应使用10 µg每种bNAb，溶于200 µL抗体结合与洗涤缓冲液中（见材料表）。 
	注意：抗体用量可能因bNAb的亲和力以及所用VLPs表面抗原的密度而有所不同。</li>
	<li>每个反应使用50 µL磁珠溶液（见材料表），将磁珠转移至1.5 mL反应管中。将试管置于磁力分离架上。 
	注意：也可使用强磁铁分别吸附每根试管中的磁珠，以实现与上清液的分离。</li>
	<li>静置数分钟，待磁珠完全聚集于管壁，确保所有磁珠均被收集后，小心吸除上清液。</li>
	<li>移开磁铁，将步骤2.2中配制的bNAb溶液200 µL加入磁珠中，重悬磁珠。室温下在50 rpm转速的旋转仪上孵育30分钟至3小时。</li>
	<li>再次将反应管置于磁力分离架上，静置后吸除上清液。</li>
	<li>从磁铁上取下试管，用200 µL抗体结合与洗涤缓冲液重悬磁珠进行洗涤。</li>
	<li>重复步骤2.4，尽可能彻底去除洗涤缓冲液。</li>
	<li>将待测样品加入已结合bNAb的磁珠中。 
	注意：使用HIV来源颗粒进行捕获实验时，每个反应中病毒核心蛋白的VLP输入量应至少为15 ng。VLP用量可能因bNAb的亲和力及所用VLPs表面抗原密度而异。</li>
	<li>若步骤2.9中加入的样品体积不足1 mL，需加入PBS将总体积调整至1 mL。用移液器轻轻吹打使磁珠重悬。</li>
	<li>将样品与磁珠在室温下于旋转仪上孵育2.5小时，确保磁珠保持悬浮状态，且溶液在孵育过程中充分混合。</li>
	<li>将试管置于磁铁上，待磁珠吸附后吸除上清液。</li>
	<li>用200 µL洗涤缓冲液（见材料表）重悬磁珠进行洗涤，重复该洗涤步骤三次。</li>
	<li>用100 µL洗涤缓冲液重悬磁珠，并将悬液转移至洁净（耐热）的反应管中。</li>
	<li>将试管置于磁力分离架上（见材料表），完全吸除上清液。</li>
	<li>按照步骤2.16.1–2.16.2制备变性SDS-PAGE样品，或按照步骤2.16.3–2.16.5从磁珠上洗脱VLPs以制备非变性样品。
	<ol>
		<li>为制备变性SDS-PAGE样品，将磁珠重悬于20–80 µL Laemmli缓冲液中（每1 ng p55 Gag检测输入量加入0.8 µL Laemmli缓冲液），在95 °C孵育5分钟。</li>
		<li>可直接进行SDS-PAGE分析，或将样品在-20 °C保存。 
		注意：Laemmli缓冲液含有2-巯基乙醇和十二烷基硫酸钠。操作时需佩戴防护手套和护目镜，避免接触皮肤、眼睛和衣物，切勿吸入蒸气。应在通风良好的环境中操作，例如通风橱内。 
		注意：本方案可在此处暂停。</li>
		<li>或者，可进行非变性洗脱，以获得保持天然蛋白结构的VLPs。</li>
		<li>向磁珠中加入25 µL洗脱缓冲液（通常随磁珠配套提供），室温孵育2–5分钟。</li>
		<li>将磁珠分离后，收集洗脱液并转移至洁净试管中。洗脱液可用于后续实验，或在4 °C保存。 
		注意：本方案可在此处暂停。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 捕获的病毒样颗粒样本的分析
注意：对于捕获的病毒样颗粒（VLPs）的分析，需进行SDS-PAGE，随后进行Western印迹分析31,32。
<ol>
	<li>将样本管置于磁力架上，使磁珠与溶液分离。</li>
	<li>取每份样本 10 µL 加入凝胶的各个加样孔中。 
	​注意：本实验方案中，使用针对 HIV Gag 的多克隆兔抗体以及与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的多克隆鸡抗兔 IgG 二抗来检测病毒 p55 Gag 核心蛋白。通过化学发光法检测病毒核心蛋白。</li>
</ol>
<img alt="基于磁珠的蛋白质纯化示意图及电泳结果，展示关键步骤" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63137/63137fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：利用无细胞上清液进行病毒样颗粒（VLP）捕获实验的关键步骤示意图。（1）VLP 捕获实验首先将 HIV-1 广谱中和抗体（bNAbs）与蛋白 G 偶联的磁珠结合。同时，制备含有已知 p55 浓度的 VLP 溶液。无细胞培养上清液包含 p55 Gag VLP、宿主细胞蛋白和核酸的混合物。（2）将偶联了 bNAbs 的磁珠和 VLP 溶液转移至 1.5 mL 反应管中，并在旋转条件下孵育。（3）展示抗原的 VLP 被包被 bNAbs 的磁珠捕获。在磁场中将这些免疫复合物与来源于宿主细胞的污染物分离。（4）通过移液去除上清液，并对磁珠进行三次洗涤，以去除未结合的 VLP。（5）下一步，向包含包被 bNAbs 的磁珠及捕获 VLP 的免疫复合物中加入还原性蛋白上样缓冲液。（6）加热样本使 bNAbs 和靶抗原从磁珠上解离，并裂解 VLP。（7）在磁场中将磁珠从溶液中分离。（8）蛋白样本进行 SDS-PAGE 分析。（9）通过 Western blot 分析检测病毒 p55 Gag 核心蛋白。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63137/63137fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

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</ol>

作者声明不存在利益冲突。

在进行VLP捕获实验之前，应评估VLP的形成情况以及VLP生产细胞系中目标抗原的表达水平。可采用的检测方法包括通过流式细胞术分析抗原在细胞表面的表达，以及针对抗原和病毒核心蛋白的特异性ELISA，检测无细胞上清液（CFSN）和沉淀的VLP样本。
VLP 捕获实验的关键步骤是使用捕获抗体（此处为广谱中和抗体，bNAbs）包被磁珠，以及随后由抗体包被的磁珠捕获抗原阳性的 VLP。磁珠成功包被抗体依赖于所选的偶联免疫球蛋白（Ig）结合蛋白。抗体的供体物种及其 Ig 类型决定了应优先选择蛋白 G 还是蛋白 A 偶联的磁珠。对于大多数物种和 Ig 类型，蛋白 G 是首选配体33。除了蛋白 A/G 偶联磁珠外，也可使用链霉亲和素磁珠来包被生物素标记的抗体。此外，磁珠还可通过共价偶联方式与抗体结合。
病毒样颗粒（VLPs）被抗体包被的磁珠捕获的效率取决于充分混匀、足够的孵育时间、抗原丰度以及捕获抗体的亲和力。根据我们的经验，抗体包被磁珠与VLP样本的充分混合最理想地通过使用特定体积来实现 &#62;500 µL置于1.5 mL离心管中，在室温或4 °C下旋转孵育至少2小时。另一个可能的障碍是样品中病毒样颗粒（VLP）的量过低。对于能强效结合靶抗原的抗体，通常仅需15 ng的Gag蛋白输入量，即可通过Western印迹分析检测到明显量的病毒核心蛋白。然而，低亲和力抗体则需要更高的输入量，例如.，100 ng Gag蛋白，以获得明确的结果（图3，广谱中和抗体 3）
某些表面抗原易受蛋白酶降解。因此，我们建议在VLP样品中添加蛋白酶抑制剂，并在4 °C下孵育。宿主细胞蛋白和VLP与磁珠结合抗体之间的非特异性吸附很少出现，应通过使用适当的阴性对照予以排除，正如本研究中采用模拟样品、无包膜VLP样品以及同型对照抗体所展示的那样。减少非特异性结合的策略包括延长洗涤步骤，以及在洗涤缓冲液中添加酪蛋白34。此外，通过确定抗体与表达抗原的VLP之间的最佳比例，也可进一步优化捕获检测的效果。
在VLP捕获实验的最后一步中，我们描述了通过在还原性Laemmli缓冲液中煮沸，将免疫复合物从磁珠上洗脱下来的过程。在此步骤中，VLPs被解离，捕获抗体和目标抗原从磁珠上分离。值得注意的是，在后续Western blot分析中所使用的初级抗体的免疫宿主必须与捕获抗体的免疫宿主不同，以避免二抗（HRP标记的抗宿主IgG抗体）非特异性地识别捕获抗体。
本文介绍的VLP捕获检测法提供了一种简便且灵敏的方法，用于检测VLP表面展示的结构完整靶抗原上的中和敏感性表位。然而，该捕获检测法无法实现表位的直接定量。为此目的，使用广谱中和抗体（bNAbs）进行的ELISA检测具有重要作用，应平行开展，特别是当所研究的VLP拟用于基于动物模型的临床前研究时35。这一点至关重要，因为抗原的含量可直接与免疫动物体内中和抗体反应的诱导相关，这一点已在猪圆环病毒2型（PCV2）疫苗研究中得到证实36。
理想的疫苗应能够诱导产生靶向病毒颗粒表面中对中和作用敏感的&#160;表位的广谱中和抗体（bNAbs）。分析这些表位，特别是其在颗粒疫苗表面保持完整结构构象的情况，对于鉴定潜在疫苗候选物至关重要。这一点不仅适用于源自HIV的病毒样颗粒（VLP），也适用于当前正在研发的许多其他VLP疫苗37。目前较为突出的基于VLP的疫苗，例如来源于非包膜病毒或衣壳亲本病毒的人乳头瘤病毒（HPV）疫苗。与仅由一种结构核心蛋白（即p55 Gag）构成并包裹来源于VLP生产细胞膜的HIV-1颗粒不同，HPV颗粒仅包含一种或两种结构核心蛋白38,39。同样，正如本文针对包膜VLP所展示的，VLP捕获检测法也可用于检测非包膜VLP上对中和作用敏感的表位。
作为捕获实验的替代方法，病毒样颗粒（VLP）样品可直接进行天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（native PAGE），随后使用广谱中和抗体（bNAbs）及相应的HRP偶联二抗进行Western blot分析40。然而，在分析携带HIV Env蛋白的VLP时，该方法的灵敏度较低，因为每个VLP所含的抗原蛋白数量较少。相比之下，捕获实验能够检测每个VLP中大量存在的核心蛋白；以HIV来源的VLP为例，每个颗粒由超过3,500个Gag蛋白组成27。因此，即使Env蛋白在VLP表面呈低密度展示，其表位也可通过该方法实现高灵敏度的间接检测。
目前，用于检测病毒样颗粒（VLPs）表面抗原上对中和作用敏感的&#160;表位的方法数量有限。可通过表位特异性抗体-荧光染料偶联物对VLPs表面展示的抗原进行标记，并结合纳米颗粒追踪分析法（NTA）实现VLPs的检测与定量。该方法也已成功开发并优化，用于表达细胞表面标志物的外泌体检测41。此外，表面等离子共振（SPR）光谱技术可用于分析未标记的中和抗体与VLPs上相应表位之间的相互作用。尽管该方法不适用于高通量分析，但也可将VLPs与偶联金颗粒的广谱中和抗体（bNAbs）进行标记，随后通过透射电子显微镜（TEM）进行观察42。
总之，VLP 捕获检测具有若干显著优势：（i）可评估 VLP 表面中和敏感型&#160;表位的结构完整性；（ii）即使抗原在 VLP 上呈低密度展示，也能实现敏感且间接的检测；（iii）该方法无需昂贵的分析设备。

病毒样颗粒（VLPs）在结构上类似于天然病毒颗粒，但缺乏病毒基因组，因此具有较高的安全性1，2。VLPs 是一类独特的疫苗，因其具有高免疫原性而被日益广泛开发3，4，5，6，7。对于包膜型 VLPs 尤为如此，它们不仅能够展示同源病毒表面抗原，还能展示异源抗原（如肿瘤抗原）8，9，10。图1 展示了包膜型抗原修饰 VLP 的结构示例。在基于 VLP 的疫苗研发过程中，必须依赖检测方法来分析 VLP 表面所展示的特定靶抗原。这些检测方法应有助于阐明颗粒疫苗的组成：（i）VLP 是否成功修饰了相应的表面抗原？（ii）表面抗原是否保持了其天然结构，可通过中和抗体（bNAbs）对表位的识别来验证；（iii）能否通过检测介导 VLP 形成的病毒蛋白来确认 VLP 的结构完整性？
<img alt="病毒样颗粒示意图；Gag 核心蛋白、脂质膜、抗原、抗体标记。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63137/63137fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：包膜病毒样颗粒（VLP）的示意图。 VLP 由未成熟的前体 Gag 核心蛋白组装而成，并被来源于宿主细胞的脂质膜所包裹。抗原（例如包膜糖蛋白）被整合到脂质膜中，并呈现在 VLP 表面（右侧）。抗原特异性抗体可识别该抗原。左侧显示的是无抗原修饰的“裸”VLP。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63137/63137fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
尤其由人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）的病毒群特异性抗原（Gag）核心前体蛋白p55形成的病毒样颗粒（VLPs），是疫苗开发中用于抗原展示的优选支架，因为已有大量可用的抗体和ELISA试剂盒，能够对这些VLPs进行定量分析11,12。HIV-1包膜糖蛋白（Env），即跨膜蛋白gp41（gp41-TM）和可溶性表面亚基gp120（gp120-SU），二者形成异源二聚体，被整合到颗粒的膜包膜中，是开发抗HIV感染疫苗的关键靶抗原13,14,15。在这些靶抗原中展示对中和作用敏感的表位，是诱导疫苗接种者产生广谱中和抗体反应的前提条件。除针对Gag蛋白的T细胞免疫反应外，这一点被认为是抵抗HIV感染的重要保护相关因素16。因此，在设计和制备携带靶抗原候选物的VLPs后，对其所展示抗原质量的后续分析是疫苗研发过程中的关键步骤。
免疫沉淀（IP）是一种广泛使用的技术，用于检测蛋白质-蛋白质相互作用以及小规模纯化蛋白质复合物17。Barret et al. 于1960年首次报道了IP技术的开发，此后该方法不断得到进一步改进。IP技术通过使用与微珠偶联的抗原特异性抗体（诱饵）固定化，从而从溶液中捕获并分离目标抗原（猎物）18,19。在本实验方案中，我们展示了一种经典的IP应用的变体，其中以膜包被的p55 Gag形成的病毒样颗粒（VLPs）作为猎物，以识别VLP表面包膜蛋白上中和敏感表位的广谱中和抗体（bNAbs）作为诱饵蛋白。该VLP捕获实验的成功应用有助于预测被检测的抗原阳性VLP是否能够在接种疫苗的人群中诱导产生中和性B细胞应答。这类基于VLP的候选疫苗的免疫原性特征通常在小型动物模型中得到验证20,21,22。
为了评估新开发的病毒样颗粒（VLP）候选疫苗的质量，VLP捕获检测已被成功应用5,23,24。然而，已发表的方法数量有限。本文所介绍的VLP捕获检测首先将Env特异性的广谱中和抗体（bNAb）固定在与蛋白G偶联的微珠上，这些微珠可结合来源于哺乳动物抗体的Fc区。常用的抗体固定基质包括琼脂糖微珠或磁珠。然而，磁珠更适用于高通量应用25。下一步，由bNAb包被的微珠捕获表达目标抗原的VLP。由Env阳性VLP与固定化bNAb形成的免疫复合物可通过磁力轻松富集。最后一步中，洗脱分离得到的免疫复合物。随后可对VLP进行生化表征。本研究中，我们采用针对p55 Gag病毒核心蛋白的特异性抗体进行Western blot分析，以证明所沉淀的目标Env抗原不仅含有对中和作用敏感的表位，而且确实展示在由Gag形成的VLP表面。此外，由于Gag蛋白在VLP中的丰度远高于Env，检测病毒核心Gag蛋白可提高捕获检测的灵敏度。在HIV-1中，Env蛋白的数量仅为个位数或两位数26,，而每个病毒颗粒的核心则由超过3,500个Gag分子构成27。
与其他蛋白质-蛋白质相互作用检测技术相比28,29，病毒样颗粒（VLP）捕获实验为无法获得昂贵分析仪器的研究实验室提供了一种替代方法。例如，透射电子显微镜分析（TEM）、表面等离子共振光谱法（SPR）和纳米颗粒追踪分析（NTA）可能成本较高。本文所述的捕获实验还允许将捕获到的抗原阳性VLP样本进一步用于蛋白质表征，例如分别采用凝胶电泳、免疫印迹、电子显微镜和质谱（MS）分析。考虑到目标抗原在VLP捕获实验过程中其天然结构得以保持，因此也可应用非变性PAGE及后续的免疫印迹技术。
病毒样颗粒（VLP）捕获检测是一种易于使用且灵敏的方法，可用于检测病毒样颗粒表面是否装饰有暴露中和敏感表位的目标抗原，从而评估其作为未来候选疫苗的效用。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 反应管</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>4%&amp;ndash;15% Mini-PROTEAN TGX 免染蛋白凝胶</td><td>BioRad</td><td>4568085</td><td></td></tr><tr><td>抗体（bnAbs）</td><td>Polymun Scientic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>同型对照抗体</td><td>invitrogen (Thermo Fisher Scientific)</td><td>02-7102</td><td></td></tr><tr><td>Chemidoc XRS+ 成像系统</td><td>BioRad</td><td>1708265</td><td></td></tr><tr><td>鸡抗兔 IgG HRP 偶联抗体</td><td>Life technologies</td><td>A15987</td><td>在含 2% (w/v) 脱脂奶粉的 TBS-T 中按 1:5000 稀释</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G 免疫沉淀试剂盒</td><td>invitrogen (Thermo Fisher Scientific)</td><td>10007D</td><td>包含缓冲液和洗涤液</td></tr><tr><td>FreeStyle 293-F 细胞</td><td>invitrogen (Thermo Fisher Scientific)</td><td>R790-07</td><td></td></tr><tr><td>FreeStyle 293 表达培养基</td><td>invitrogen (Thermo Fisher Scientific)</td><td>12338026</td><td></td></tr><tr><td>凝胶转印滤纸</td><td>Whatman</td><td>GB005</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Carl Roth</td><td>0079</td><td>转膜缓冲液</td></tr><tr><td>磁力分离架</td><td>New England Biolabs</td><td>S1509S</td><td>适用于 12 × 1.5 mL 或 6 × 1.5 mL 管</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Carl Roth</td><td>4627</td><td>转膜缓冲液</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell 电泳系统</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PageRuler 预染蛋白 Marker</td><td>Thermo Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>聚偏二氟乙烯 (PVDF) 注射式滤器，0.45 &amp;micro;m</td><td>Carl Roth</td><td>KC89.1</td><td></td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>Carl Roth</td><td>T145</td><td>封闭缓冲液</td></tr><tr><td>PVDF 转印膜，0.45 &amp;micro;m</td><td>Carl Roth</td><td>T830.1</td><td></td></tr><tr><td>QuickTiter HIV p24 ELISA 试剂盒</td><td>Cell Biolabs</td><td>VPK-108-H</td><td></td></tr><tr><td>兔多克隆抗 HIV1 p55 + p24 + p17 抗体</td><td>abcam</td><td>ab63917</td><td>在含 2% (w/v) 脱脂奶粉的 TBS-T 中按 1:2000 稀释</td></tr><tr><td>旋转混合仪</td><td>Heidolph</td><td>REAX2</td><td></td></tr><tr><td>ROTI Load 1（Laemmli 缓冲液）</td><td>Carl Roth</td><td>K929.1</td><td>4x 浓缩还原性蛋白上样缓冲液</td></tr><tr><td>ROTIPHORESE 10x SDS-PAGE 缓冲液</td><td>Carl Roth</td><td>3060</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Carl Roth</td><td>3957</td><td>TBS-T 缓冲液</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico PLUS 化学发光底物</td><td>Thermo Scientific</td><td>34579</td><td></td></tr><tr><td>SW28 转子</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>恒温混匀仪</td><td>Cel Media</td><td>basic</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo 转膜系统</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>海藻糖二水合物</td><td>Carl Roth</td><td>8897.2</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Carl Roth</td><td>5429</td><td>转膜缓冲液</td></tr><tr><td>TRIS 盐酸盐</td><td>Carl Roth</td><td>9090</td><td>TBS-T 缓冲液</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Carl Roth</td><td>9127</td><td>TBS-T 缓冲液</td></tr><tr><td>Ultra Clear 离心管</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr></tbody></table>

利用捕获法检测基于病毒样颗粒（vlp）疫苗中抗原的中和敏感性表位

Detection of Neutralization-sensitive Epitopes in Antigens Displayed on Virus-Like Particle (VLP)-Based Vaccines Using a Capture Assay

病毒样颗粒（VLP）捕获实验是一种免疫沉淀方法，通常称为“下拉实验”，用于纯化和分离展示抗原的VLP。特异性针对表面抗原的抗体被偶联并因此固定在固体不溶性基质（如微珠）上。由于这些抗体对靶抗原具有高亲和力，它们能够捕获膜包膜上锚定有相应抗原的VLP。本方案描述了抗原特异性抗体与蛋白A或蛋白G偶联的磁珠的结合过程。在我们的研究中，检测了由人免疫缺陷病毒（HIV）的群特异性抗原（Gag）病毒核心前体蛋白p55 Gag形成的、并展示HIV包膜糖蛋白（Env）的VLP。利用靶向Env中中和敏感表位的广谱中和抗体（bNAbs）来捕获这些VLP。此处所述的VLP捕获实验是一种灵敏且易于操作的方法，可用于证明：（i）VLP表面确实展示了相应的靶抗原；（ii）表面抗原保持了其结构完整性，这通过实验中使用的bNAbs对表位的特异性结合得以证实；以及（iii）VLP的结构完整性，这通过后续Western印迹分析中检测到Gag蛋白而得以揭示。因此，使用bNAbs进行免疫沉淀有助于预测VLP疫苗是否能够在接种疫苗的人群中诱导产生中和性B细胞应答。我们预期该方案将为其他研究人员提供一种有价值且简便的实验方法，用于评估潜在的基于VLP的疫苗。

图3展示了分别从CFSN和VLP沉淀中捕获病毒样颗粒（VLPs）的代表性结果，首先使用广谱中和抗体（bNAbs）进行捕获，随后通过Western blot分析检测病毒核心蛋白。用于捕获实验的磁珠分别包被了三种针对Env糖蛋白中中和敏感表位的广谱中和抗体（bNAbs），以及作为阴性对照的同型抗体。使用包被同型抗体的磁珠时，在含有Env阴性（无包膜VLPs，即“bald VLPs”）或表达Env的VLPs样本中均未检测到Gag蛋白，Western blot分析结果为阴性。这表明VLPs与包被人源抗体的磁珠之间不存在非特异性结合，因而不会导致VLPs的非特异性捕获。无包膜VLPs也无法被包被bNAbs的磁珠结合，因此同样未检测到Gag蛋白。相反，所有三种bNAbs均能有效捕获表达Env蛋白的VLPs（Env VLPs），因而后续可清晰检测到Gag蛋白。如图3所示，该捕获实验可用于分别分析CFSN及沉淀VLP样品中表达目标抗原的VLPs。
<img alt="病毒样颗粒（VLPs）抗体反应的蛋白质印迹分析；显示的蛋白条带。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63137/63137fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 3"> 
图 3：利用广谱中和抗体检测由 p55 Gag 形成的病毒样颗粒（VLPs）表面展示的 HIV-1 包膜糖蛋白中可被中和的表位。在采用三种不同的靶向 HIV-1 包膜糖蛋白（Env）内表位的广谱中和抗体（bNAb 1、bNAb 2 和 bnAb 3）进行 VLP 捕获实验后，使用病毒 Gag 核心蛋白特异性抗体进行蛋白质印迹分析的代表性结果。来自人血清的混合同型人源抗体作为阴性对照。分别从悬浮培养细胞的上清液中收集表达 Env 蛋白的病毒样颗粒（Env VLPs）和不表达 Env 的“裸”VLPs（Env 阴性），以及未表达任何病毒蛋白的空白对照细胞（mock）。来自“裸”VLP 生产细胞培养上清和空白对照细胞培养上清均作为阴性对照。通过低速离心去除污染细胞，并进一步过滤获得无细胞上清液（CFSN）用于分析。在免疫沉淀后，使用多克隆兔抗 Gag 抗体及相应的抗兔 IgG-HRP 二抗进行蛋白质印迹分析。左侧所示为分子量标记物（MW）指示的可见相对分子质量（千道尔顿，kDa）。箭头指示检测到的前体蛋白 p55 Gag。（A）每个样品中，含有 100 ng Gag 蛋白的 CFSN 被用于捕获实验，以标准化 VLPs 的输入量。CFSN 直接与抗体包被的磁珠孵育。（B）通过超速离心从 CFSN 中获得 VLP 沉淀物。含有 100 ng Gag 蛋白的沉淀物使用同型抗体和 bNAb 3 进行捕获实验。bNAb 1 和 bNAb 2 的样品中仅含 25 ng Gag 蛋白。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63137/63137fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种用于检测抗原展示型病毒样颗粒（VLPs）上中和表位的实验方案。利用与蛋白G偶联磁珠结合的包膜糖蛋白特异性单克隆抗体，对来源于人类免疫缺陷病毒（HIV）的VLPs进行免疫沉淀。捕获的VLPs随后通过SDS-PAGE分离，并使用针对病毒核心蛋白Gag的特异性抗体进行Western印迹分析。

利用捕获法检测基于病毒样颗粒（VLP）疫苗中抗原的中和敏感性表位

病毒样颗粒（VLP）捕获实验是一种免疫沉淀方法，通常称为“pull-down 实验”，用于纯化和分离……

在我的实验室中，我们开发用于病毒载体和病毒样颗粒（VLP）疫苗的生产系统。VLP 捕获检测法能够高灵敏度地检测展示在 VLP 上的靶抗原。在该检测中，我们使用针对中和表位的广谱中和抗体，以证明这些表位在 VLP 表面的暴露情况。这对于疫苗候选物的质量评估至关重要，因为只有展示出中和敏感表位的病毒样颗粒（VLP）才能在接种者体内诱导中和抗体反应。首先通过反复吹打或在50 RPM转速下旋转混匀至少五分钟，使磁珠充分悬浮。同时，制备含有广谱中和抗体（bNABs）的抗体溶液。每个反应使用200 µL抗体结合与洗涤缓冲液中含10 µg的每种bNAB。每个反应中，将50 µL磁珠溶液转移至1.5 mL反应管中，然后将试管置于磁性分离架上。等待磁珠聚集于管底，以确保所有磁珠均被收集，随后吸除上清液。移除磁铁，将磁珠重悬于200 µL预先配制的bNAB溶液中。在室温下以50 RPM转速旋转混匀，孵育30分钟至3小时。孵育结束后，将反应管置于磁力分离架上，静置后弃去上清液。将离心管从磁力架上取下，加入200微升抗体结合与洗涤缓冲液重悬磁珠。用抗体结合与洗涤缓冲液重复洗涤一次，每次尽量彻底去除洗涤缓冲液。将样本加入结合了bNABs的磁珠中。如果所加样品体积低于一毫升，需加入PBS将样品体积调整至一毫升，然后通过轻轻吹打重悬磁珠。将样品与磁珠在室温下于旋转仪上孵育2.5小时，确保磁珠保持悬浮状态，且孵育过程中溶液充分混匀。将离心管置于磁力架上，吸除上清液，随后用200微升洗涤缓冲液重悬磁珠以洗涤磁珠。将珠子重悬于100微升洗涤缓冲液中，并将悬液转移至洁净的耐热反应管中。将反应管置于磁力分离架上，彻底去除上清液。为制备变性STS-PAGE样品，将珠子重悬于20至80微升Laemmli缓冲液中，在95摄氏度孵育5分钟。直接进行SDS-PAGE，将离心管置于磁力架上以分离磁珠与溶液。或者，可将样品在-20摄氏度条件下保存。下图展示了利用bNABs从无细胞的细胞培养上清液及VLP沉淀中首先捕获VLP，随后通过Western blot检测病毒核心蛋白的代表性结果。用于捕获实验的磁珠包被了三种不同的靶向包膜糖蛋白中和表位的广谱中和抗体（bNABs），以及作为阴性对照的同型抗体。使用同型抗体包被的磁珠时，在含有裸病毒样颗粒（即无Env蛋白的VLPs）或表达Env蛋白的病毒样颗粒（VLPs）样本中均未检测到Gag蛋白，表明病毒样颗粒不会非特异性地结合至包被人源抗体的磁珠，因而不会介导VLP的捕获。裸VLPs也不能被包被广谱中和抗体（bNABs）的磁珠结合，因此在Western blot分析中同样未检测到Gag蛋白。相比之下，所有三种广谱中和抗体（bNABs）均能捕获表达Env蛋白的病毒样颗粒（VLPs），因此可轻松检测到Gag蛋白，表明VLPs表面展示的Env糖蛋白中存在中和表位。该检测成功的关键在于：将VLPs与抗体包被的磁珠充分混匀。最佳混匀效果可通过在旋转条件下使用大于500微升的体积来实现。或者，可在非还原条件下洗脱捕获的病毒样颗粒（VLPs），从而能够利用免疫电子显微镜对VLPs进行分析，或通过非变性PAGE检测所展示的抗原。

detection-neutralization-sensitive-epitopes-antigens-displayed-on

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

使用捕获测定法检测基于病毒样颗粒（VLP）的疫苗上显示的抗原中和敏感表位

对引起局部感染的病原体（如人乳头瘤病毒）的T细胞表位进行表征具有挑战性，原因是循环中的T细胞数量有限。本文描述了一种方法，该方法从极少量细胞开始，分离并表征稀有的T细胞。...

使用干扰素-γ酶联免疫斑点试验表征人乳头瘤病毒新型T细胞表位

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病毒样颗粒捕获实验：利用中和抗体偶联磁珠从样本中分离展示抗原的病毒样颗粒的方法

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定量微量中和试验的优化

在此，作者介绍了一种利用纯化的单克隆抗体，通过点印迹杂交结合肽段扫描来确定线性抗原表位的简单且高效的方法。所鉴定出的表位可进一步用于治疗和诊断应用。...

借助肽扫描技术鉴定单克隆抗体识别的线性B细胞表位

本方案介绍了一种快速且有效的检测方法，通过评估恢复期血清样本抑制携带刺突糖蛋白的增强型绿色荧光蛋白标记的水疱性口炎病毒假病毒入侵的能力，来测定针对SARS-CoV-2刺突蛋白的中和抗体水平。...

利用高通量荧光成像检测SARS-CoV-2中和抗体的假病毒侵染

本文描述了一种全面的实验室方案和分析流程，用于快速、经济且简便的比色法细胞检测，以检测针对AAV6的中和成分。...

使用比色法细胞检测技术检测抗AAV中和抗体的逐步操作方法

假病毒（PVs）是一类复制缺陷型病毒颗粒，可用于在比操作真实病毒更安全的条件下研究宿主与病毒之间的相互作用。本文展示了一项详细方案，说明如何利用SARS-CoV-2假病毒检测新冠疫苗接种后患者血清的中和能力。...

假病毒作为通过中和试验监测针对SARS-CoV-2体液免疫应答的分子工具

本文介绍了一种新开发的多重荧光免疫测定法，该方法利用双报告系统流式细胞术，同时检测完整严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）病毒颗粒上的两个独特刺突蛋白表位，这些病毒颗粒已被血管紧张素转换酶2偶联的磁性微球捕获。...

通过多重双报告基因策略对病毒颗粒表面蛋白表位进行分析

目前尚无针对戊型肝炎病毒（HEV）的标准病毒中和检测方法，HEV 是一种非致细胞病变的正链 RNA 病毒。本文介绍一种基于荧光标记病毒衣壳蛋白定量的荧光减少中和试验（FRNT），用于评估抗 HEV...

戊型肝炎病毒荧光减量中和试验用于测定中和抗体滴度

学习使用捕获测定法检测病毒样颗粒（VLP）疫苗上的中和敏感表位。该方法利用广谱中和抗体（bNABs）结合磁珠捕获技术，通过SDS-PAGE和Western blot分析评估疫苗候选物的质量，为疫苗开发提供可靠的质量控制手段。

利用捕获法检测基于病毒样颗粒（VLP）疫苗中抗原的中和敏感性表位

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