利用捕获法检测基于病毒样颗粒（VLP）疫苗中抗原的中和敏感性表位

在我的实验室中，我们开发用于病毒载体和病毒样颗粒（VLP）疫苗的生产系统。VLP 捕获检测法能够高灵敏度地检测展示在 VLP 上的靶抗原。在该检测中，我们使用针对中和表位的广谱中和抗体，以证明这些表位在 VLP 表面的暴露情况。

这对于疫苗候选物的质量评估至关重要，因为只有展示出中和敏感表位的病毒样颗粒（VLP）才能在接种者体内诱导中和抗体反应。首先通过反复吹打或在50 RPM转速下旋转混匀至少五分钟，使磁珠充分悬浮。同时，制备含有广谱中和抗体（bNABs）的抗体溶液。

每个反应使用200 µL抗体结合与洗涤缓冲液中含10 µg的每种bNAB。每个反应中，将50 µL磁珠溶液转移至1.5 mL反应管中，然后将试管置于磁性分离架上。等待磁珠聚集于管底，以确保所有磁珠均被收集，随后吸除上清液。

移除磁铁，将磁珠重悬于200 µL预先配制的bNAB溶液中。在室温下以50 RPM转速旋转混匀，孵育30分钟至3小时。孵育结束后，将反应管置于磁力分离架上，静置后弃去上清液。

将离心管从磁力架上取下，加入200微升抗体结合与洗涤缓冲液重悬磁珠。用抗体结合与洗涤缓冲液重复洗涤一次，每次尽量彻底去除洗涤缓冲液。将样本加入结合了bNABs的磁珠中。

如果所加样品体积低于一毫升，需加入PBS将样品体积调整至一毫升，然后通过轻轻吹打重悬磁珠。将样品与磁珠在室温下于旋转仪上孵育2.5小时，确保磁珠保持悬浮状态，且孵育过程中溶液充分混匀。将离心管置于磁力架上，吸除上清液，随后用200微升洗涤缓冲液重悬磁珠以洗涤磁珠。

将珠子重悬于100微升洗涤缓冲液中，并将悬液转移至洁净的耐热反应管中。将反应管置于磁力分离架上，彻底去除上清液。为制备变性STS-PAGE样品，将珠子重悬于20至80微升Laemmli缓冲液中，在95摄氏度孵育5分钟。

直接进行SDS-PAGE，将离心管置于磁力架上以分离磁珠与溶液。或者，可将样品在-20摄氏度条件下保存。下图展示了利用bNABs从无细胞的细胞培养上清液及VLP沉淀中首先捕获VLP，随后通过Western blot检测病毒核心蛋白的代表性结果。

用于捕获实验的磁珠包被了三种不同的靶向包膜糖蛋白中和表位的广谱中和抗体（bNABs），以及作为阴性对照的同型抗体。使用同型抗体包被的磁珠时，在含有裸病毒样颗粒（即无Env蛋白的VLPs）或表达Env蛋白的病毒样颗粒（VLPs）样本中均未检测到Gag蛋白，表明病毒样颗粒不会非特异性地结合至包被人源抗体的磁珠，因而不会介导VLP的捕获。裸VLPs也不能被包被广谱中和抗体（bNABs）的磁珠结合，因此在Western blot分析中同样未检测到Gag蛋白。

相比之下，所有三种广谱中和抗体（bNABs）均能捕获表达Env蛋白的病毒样颗粒（VLPs），因此可轻松检测到Gag蛋白，表明VLPs表面展示的Env糖蛋白中存在中和表位。该检测成功的关键在于：将VLPs与抗体包被的磁珠充分混匀。最佳混匀效果可通过在旋转条件下使用大于500微升的体积来实现。

或者，可在非还原条件下洗脱捕获的病毒样颗粒（VLPs），从而能够利用免疫电子显微镜对VLPs进行分析，或通过非变性PAGE检测所展示的抗原。