Name: 从人类骨骼肌成肌原细胞和成纤维细胞的分离和定量免疫细胞化学表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T13:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: 学习从人体肌肉活检样本中高效分离成肌细胞和纤维母细胞的方法，利用CD56免疫磁珠分选技术获得高产量和高活性的细胞群体，并通过免疫细胞化学染色和定量图像分析评估特定表型标志物和转录因子表达水平。

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作者感谢 Carl Hobbs 和 Lindsey Majoram 提供的技术支持，以及 Pat Doherty 教授提供的显微镜设备使用许可。Agley 博士获得了伦敦国王学院研究生奖学金的支持。同时感谢 Spurrell 信托基金提供的经费支持。

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<li>Pawley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+39+steps%3A+A+cautionary+tale+of+quantitative+3-D+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">The 39 steps: A cautionary tale of quantitative 3-D fluorescence microscopy.</a> Biotechniques. 28, 884-887 (2000).</li>
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<li>Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy+-+avoiding+the+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy - avoiding the pitfalls.</a> J. Cell Sci. 120, 1703-1705 (2007).</li>
<li>Bareja, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+Mouse+Skeletal+Muscle+Stem+Cells%3A+Convergent+and+Divergent+Mechanisms+of+Myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Human and Mouse Skeletal Muscle Stem Cells: Convergent and Divergent Mechanisms of Myogenesis.</a> PLoS ONE. 9, e90398(2014).</li>
<li>Castiglioni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Progenitors+that+Exhibit+Myogenic%2FOsteogenic+Bipotency+In+by+Fluorescence-Activated+Cell+Sorting+from+Human+Fetal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of Progenitors that Exhibit Myogenic/Osteogenic Bipotency In by Fluorescence-Activated Cell Sorting from Human Fetal Muscle.</a> Stem Cell Reports. 2, 560(2014).</li>
<li>Fukada, S. -i, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD90-positive+cells%2C+an+additional+cell+population%2C+produce+laminin+%CE%B12+upon+transplantation+to+dy3k%2Fdy3k+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">CD90-positive cells, an additional cell population, produce laminin α2 upon transplantation to dy3k/dy3k mice.</a> Exp. Cell Res. 314, 193-203 (2008).</li>
<li>Stickland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+development+in+the+human+fetus+as+exemplified+by+m.+sartorius%3A+a+quantitative+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Muscle development in the human fetus as exemplified by m. sartorius: a quantitative study.</a> J. Anat. 132, 557-579 (1981).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

我们已描述了一种免疫磁珠分选方法，可用于从小量肌肉活检组织样本中选择性富集人源肌肉来源前体细胞。该技术在我们的实验室中极为重要，不仅有助于克服人源肌肉来源细胞培养过程中被成纤维细胞过度生长所污染的问题，还有助于深入理解不同群体肌肉来源前体细胞的独特生物学行为。经纯化后的成肌细胞可用于蛋白质和/或基因表达变化的研究，或用于后续实验。
除了细胞纯化外，我们还详细描述了一种快速且简便的方法，用于分析荧光显微镜所得显微图像中的特定感兴趣区域。荧光显微镜的数字图像包含大量可供细胞生物学家提取的信息；实际上，像素中包含的数据并不一定都能被人眼直接识别。利用该技术，可从群体中大量单个细胞获取定量数据。与流式细胞术相比，图像分析的一个独特优势在于能够将蛋白质表达水平的变化与细胞形态变化或细胞间相互作用的变化相关联。此外，创建并保存优化且具代表性的选择掩膜的能力，使得可在多个视野中快速、准确且可重复地进行测量，从而降低人为偏差的可能性。
基于 MACS 的细胞纯化
该方法...

骨骼肌的修复与再生依赖于卫星细胞1的作用，即成肌干细胞2,3。体内这些细胞处于可逆的静息状态，位于每条肌纤维的肌膜与基底膜之间；当肌肉组织受损、修复和再生时，它们被激活，进而增殖、融合并分化3。可通过酶消化法从年轻和老年个体的人体肌肉活检样本中分离卫星细胞4，并在原代培养中进一步研究其成肌特性5。该分离过程的效率，包括细胞群体的得率和纯度，取决于所采用的方法，且在不同样本间可能存在差异。酶消化后获得的两种主要贴壁细胞类型为卫星细胞（现称为成肌细胞或肌肉前体细胞），最初被鉴定为CD56+/desmin阳性细胞；以及来源于肌肉的成纤维细胞，被鉴定为CD56–、TE7+细胞5。成纤维细胞具有快速增殖能力，且在细胞间接触时不会像成肌细胞那样发生不可逆的生长停滞和终末分化；因此，在混合细胞群体中，成纤维细胞可能过度生长并占据培养体系的主导地位。
成纤维细胞常常被视为肌肉生物学家的困扰，然而，目前人们越来越关注成纤维细胞本身作为独立研究对象的价值，尤其是研究发现它们在肌肉修复过程中与成肌细胞具有协同作用6。因此，在研究这两种细胞在体外培养中的固有行为时，从人类肌肉组织中分离和纯化不同细胞类型便成为一项重要的方法学考量。荧光激活细胞分选（FACS）是一种可用于分选细胞以进行后续研究和/或计数与分析的技术。FACS已被证明能够可靠地富集人类成肌细胞，但迄今为止，用于后续培养的细胞产量仍较低7。鉴于体细胞（如卫星细胞来源的成肌细胞）增殖潜能有限，且衰老相关的增殖与分化能力显著下降4，因此需要更为温和的技术手段。单根肌纤维培养提供了另一种较为温和的方法，可用于获取仍处于其亚膜龛位的小鼠卫星细胞，以及在体外激活后的卫星细胞8,9。然而，这种方法通常难以应用于人类肌肉活检样本（因为极少能获得从肌腱到肌腱的完整肌纤维），这意味着许多致力于研究人类肌肉来源细胞的研究实验室可能无法采用该技术。此外，单纤维培养所能提供的细胞数量极为有限。
本文介绍一种基于温和酶消化的细胞分选系统，首先使用胶原酶和分散酶对细胞进行消化，随后进行两轮连续的磁性激活细胞分选（MACS），可获得高纯度（&#62;95% 成肌细胞）和高得率（约 2.8 × 106 ± 8.87 × 105 个细胞/克组织），适用于体外培养实验。CD56 被认为是原位（in situ10）和体外（in vitro11）鉴定人卫星细胞的金标准表面标志物，是磁珠结合的理想候选表面标记。在此方法中，与含铁氧化物和多糖的超顺磁性磁珠偶联的 CD56 抗体与细胞结合后，将细胞悬液通过置于强磁场中的高梯度磁性细胞分离柱12,13。分离柱内填充有铁磁性钢丝绒或铁球基质，可将磁力线聚焦至其表面，从而产生强磁梯度（约 4 特斯拉）14。在此类柱中，即使弱磁性的细胞也会被吸引并吸附至柱表面14。未结合的细胞（CD56‒）流过分离柱，而被磁性微珠标记的 CD56+ 细胞则被保留在柱内，直至移出磁场后被洗脱收集12,15。
分选过程任一阶段的细胞悬液均可按所需密度接种，用于后续实验。在特定干预处理后，可利用免疫细胞化学方法鉴定细胞成分，通过宽场或共聚焦荧光显微镜成像，并采用图像分析方法进行定量分析，该方法可对任意给定图像中所有标记细胞进行快速、客观的测量。在本实验室中，我们已采用这种双重免疫磁珠分选结合图像分析的方法16，证明CD56–人成纤维细胞可高效转分化为脂肪细胞，而起源于卫星细胞的成肌细胞则对这种脂肪生成转化具有高度抗性5。

<table><tbody><tr><td>胶原酶&amp;nbsp; D</td><td>Roche&amp;nbsp;</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>分散酶 II</td><td>Sigma</td><td>D4693-1G</td><td>使用前必须过滤除菌</td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA</td><td>(Gibco) Invitrogen</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;#956;m 细胞筛</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>胶原蛋白溶液（0.1% 乙酸中含 3 mg/ml）</td><td>Sigma, Dorset, UK</td><td>C8919&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Minisart SRP15 注射器滤器（0.2 &amp;#956;m）</td><td>Sartorius</td><td>17573ACK</td><td>聚四氟乙烯（PTFE）膜</td></tr><tr><td>CD56 人源微珠</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-050-401</td><td>注意微珠保质期有限</td></tr><tr><td>抗成纤维细胞微珠，人源</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-050-601</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;mu;m 预分离滤器</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>大细胞柱</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-202</td><td>这些柱子配有流阻器。获得本文所述的高成肌纯度时，无需使用流阻器。</td></tr><tr><td>LS 柱&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MiniMacs 分离器</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-102</td><td>该分离器适用于大细胞柱，但不适用于 LS 柱。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MidiMACS</td><td>Miltenyi Biotech&amp;nbsp;</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MACS 多联支架</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td></td><td>使用前必须过滤除菌</td></tr><tr><td>油红 O</td><td>Sigma</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>三乙基磷酸酯</td><td>Sigma</td><td>538728</td><td></td></tr><tr><td>沃特曼滤纸</td><td>Sigma</td><td>Z241121-1PAK</td><td>42 号，无灰。制备滤纸时，将圆形滤纸对折成半圆，再将半圆对折一次形成圆锥形。将圆锥形滤纸放入漏斗中用于过滤。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ProLong Gold 抗荧光淬灭试剂</td><td>Molecular Probes, Invitrogen</td><td>P36930</td><td>该试剂可购买含或不含 DAPI 的版本，且不会淬灭初始荧光。</td></tr><tr><td>AxioVision</td><td>Carl Zeiss</td><td>联系 Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop CS5 Extended</td><td>Adobe（从 Pugh Computers 购买）</td><td>ADPH16982*&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

人骨骼肌中初级成肌细胞和成纤维细胞的分离与定量免疫细胞化学表征

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

骨骼肌的修复与再生依赖于卫星细胞的作用，这些细胞是定居在肌肉中的干细胞。可通过酶消化法从人体肌肉活检样本中分离卫星细胞，并在体外培养中研究其成肌特性。从酶消化过程中获得的两种主要贴壁细胞类型在数量上分别为：（i）卫星细胞（称为成肌细胞或肌肉前体细胞），最初通过CD56鉴定；+ 以及随后的CD56+/结蛋白+ 细胞和（ii）源自肌肉的成纤维细胞，鉴定为CD56– 和 TE-7+成纤维细胞在培养中增殖效率很高，在混合细胞群体中可能过度生长并取代肌源性细胞，从而成为培养物中的优势细胞。因此，在研究各类细胞在培养中固有行为时，从人肌肉组织中分离和纯化不同类型细胞是一个重要的方法学考量。本文描述了一种基于温和酶解的细胞分选系统，即使用胶原酶和中性蛋白酶对细胞进行消化，随后采用磁性激活细胞分选技术（MACS），该方法可同时实现高纯度（&#62;95% 成肌细胞）且产量良好（约 2.8 x 106 ± 8.87 × 105 细胞/克组织，7天后 体外) 用于培养实验。该方法基于将混合的肌肉来源细胞群体与连接有抗CD56抗体的磁性微珠孵育，随后使细胞通过磁场。CD56+ 被微珠标记的细胞被磁场滞留，而CD56– 细胞可不受阻碍地流经层析柱。分选过程任意阶段的细胞悬液均可接种并进行培养。在特定干预处理后，可通过特异性抗体进行免疫荧光标记，并结合图像处理与分析软件，对细胞形态以及包括核转录因子在内的蛋白质表达与定位进行定量分析。

纯化的成肌细胞和成纤维细胞可在成脂分化培养基中培养三天，随后在成脂营养培养基中培养7至30天不等，以评估其成脂潜能。利用纯化的细胞群体，通过油红O染色结合成脂和成肌谱系标志物的免疫染色显示，仅有成纤维细胞组分具备成脂分化能力（图2）。成纤维细胞中大量脂肪的积聚肉眼可见（图A），其完全的转分化过程由细胞核内PPARγ的强烈表达所证实（图2 图B和C以及图3）。经15天处理后，这些细胞已将其残余的TE-7（一种结缔组织抗原）释放至基质上（图D）。相比之下，成肌细胞维持其正常表型，包括表达结蛋白（desmin）和肌球蛋白重链（myosin heavy chain）（图2 图E和F），且不上调细胞核内PPARγ的表达（图3C）。
肌源性细胞群（desmin）的定量分析示例+) 如图所示 图3图B显示了所分析的视野，图A显示了经背景校正后的荧光强度定量结果。该方法清晰地...

从人类肌肉中获得的主要贴壁细胞类型为成肌细胞和成纤维细胞。本实验通过基于CD56抗原的磁性激活细胞分选技术对细胞群体进行富集。随后使用特异性抗体进行免疫标记，并结合图像分析技术，实现对单个细胞胞质和细胞核特征的定量分析。

骨骼肌的修复与再生依赖于卫星细胞的作用，这些细胞是定居在肌肉组织中的成肌干细胞。这些细胞可以被分离……

本实验的总体目标是高效、高得率地分离人肌肉活检样本中获得的两种主要细胞群体，以便评估特定的表型和转录因子标志物。首先将人肌肉活检样本解离为单细胞悬液，这是第二步操作。经过七天培养后，利用免疫磁珠分选技术将细胞分离为 CD56 阳性（成肌细胞）和 CD56 阴性（成纤维细胞）两个组分。然后对细胞进行染色，并对目标表型和蛋白质标志物进行成像。最终，免疫荧光显微镜结合定量图像分析可用于测量分选后细胞群体中特定定位于细胞核的转录因子的强度。该技术相较于现有方法（如荧光激活细胞分选）的主要优势在于其操作温和，能够高效分选人原代肌细胞，获得高产量和高细胞活性，且操作快速。该技术的意义在于增进我们对衰老以及多种肌肉病理状态下所观察到的纤维脂肪性肌肉退变的细胞基础的理解。获取活检样本后，应尽快分离肌肉来源的前体细胞。首先，称量组织样本的重量，然后用基础培养基多次膨胀肌肉，以彻底清洗掉多余的血液。让肌肉在室温下静置沉淀30至60秒，随后吸除管中除最后两到三毫升以外的全部培养基。接下来，将离心管倒置在无菌培养皿上，使残留液体将肌肉组织带入培养皿中。清除样本上所有可见的明显脂肪或结缔组织碎片。然后旋转培养皿以混匀残留的培养液，随后吸除全部培养液，按每100至400毫克组织加入三毫升的I型胶原酶和dispase酶溶液，并将肌肉样本切成非常小的1至2立方毫米大小的组织块。当样品充分剪碎后，使用口径较大的25毫升移液管将组织碎片和酶溶液转移至无菌的10至20毫升锥形管中。用额外的3毫升酶溶液冲洗培养板，然后使用10毫升移液管将剩余的肌肉碎片全部转移至该管中。将试管置于 37 摄氏度环境中 60 分钟，每 15 分钟用 10 毫升移液管轻轻吹打组织悬液一次。随后加入至少等体积的新鲜预热培养基，以终止酶解消化反应。接下来，将细胞悬液通过一个100微米的滤网，以去除任何较大的碎片，然后离心收集细胞。将沉淀重悬于7至8毫升培养基中，随后将细胞接种于未包被的T25组织培养瓶中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养7天。一周结束时，用胰蛋白酶作用细胞单层约三分钟。当细胞脱落后，加入 5 至 10 毫升骨骼肌生长培养基以防止过度消化，并通过离心收集细胞沉淀。计数后，保留部分细胞用于细胞谱系标志物鉴定，其余细胞用 15 毫升 PBS 洗涤，再次离心。此次将沉淀重悬于170 µL室温的最大分选缓冲液中，轻轻吹打以重悬。加入35 µL充分混匀的与磁性微珠偶联的抗CD56抗体，使细胞悬浮其中。用移液器反复吹打数次混匀细胞溶液，并在4 °C条件下避光孵育15分钟，期间轻柔振荡。孵育进行到一半时，用10毫升分选缓冲液洗涤细胞和磁珠混合液，离心并重悬。将沉淀物重悬于1毫升新鲜分选缓冲液中。接下来，用500微升分选缓冲液润洗预分离滤器和分选柱。然后立即混匀，并将全部一毫升细胞悬液通过预分离滤器转移至柱中，用一毫升上样缓冲液冲洗液洗涤柱三次，收集未滞留的成纤维细胞组分，使其流过柱子，进入含有少量生长培养基的无菌50毫升锥形管中。随后将柱子从磁铁上取下，将柱塞推入柱子顶部，以收集CD56阳性细胞组分。在另一个含有温热生长培养基的50毫升锥形管中，生长培养基自此步骤中流出。如果需要进行二次分选，则需考虑收集到的阳性与阴性细胞组分。若需要通过二次分选以获得更高的纯度，则在第一次分选时不要向CD56阳性细胞收集管中加入培养基，而应在适当的实验终点处，从滤器和柱子的润洗步骤开始重复操作。使用等体积预冷的8%多聚甲醛，将CD56阳性细胞培养物固定在其培养基中。轻轻振荡孵育10分钟。然后吸除固定剂，并用PBS洗涤细胞两次，以进行细胞表面抗原的免疫染色。用含1% BSA的PBS封闭细胞，时间至少为1小时，随后依次使用相应的初级抗体和次级抗体对细胞进行标记。根据您的显微镜和染色方法，优化检测器增益、激光功率和曝光设置。成像前，以所需数量的检测通道对细胞进行成像，并在六个以上的不同视野中采集图像。进行分析时，打开相应的TIFF图像文件，并将图像相互拖动以叠加对应的通道。每个通道将作为独立的图层显示在图层面板中。接下来，在分析窗口中选择“选择数据点”，然后选择“自定义”并选取所需的测量参数。为了分析细胞核荧光强度，打开颜色范围对话框，并从下拉菜单中选择采样颜色。然后按住 Shift 键，选择标记的细胞核所对应的特定色调。单击“保存”以存储此颜色范围选择掩模，供同一会话中选择的其他图像使用。选定细胞核后，右键单击并选择“填充”。然后从下拉菜单中选择黑色，并确认不透明度设置为 100%。接下来，点击“选择”并执行反选。然后右键单击，再次选择“填充”，并从下拉菜单中选择白色填充。对当前二值化的细胞核图层执行分水岭算法，以分离任何部分重叠的细胞核。转到“选择”然后“色彩范围”，接着选择“阴影”以选中各个分离的细胞核。然后将选区转移到包含所需标记物的16位灰度图像的图层，并点击“记录测量值”。最后，将选定的测量数据导出为文本文件，用于相应的分析软件进行进一步的油相处理。通过将纯化的细胞群体进行红色染色，并结合脂肪生成和肌生成谱系标志物的免疫染色显示，只有成纤维细胞组分能够发生成脂性分化，成纤维细胞中大量脂肪的积聚肉眼可见；在处理第15天时，这些细胞表现出细胞核内PPARγ的强表达，进一步证明其已完全转化，同时这些细胞已将其残余的TE-7A结缔组织抗原释放至基质中。相比之下，肌源性细胞保持其正常表型，包括持续表达结蛋白（desmin）和肌球蛋白重链（myosin heavy chain），且未出现细胞核内PPARγ表达的上调。在本图中，展示了结蛋白阳性肌源性细胞区域的定量分析示例，以及获取这些数据所用的原始视野图像，用以说明在此特定接种密度和时间点下，单个细胞核中肌源性标志物表达的差异情况。在此图中，展示了该方法在单细胞水平上直接比较不同细胞类型中转录因子水平的实用性。例如，这些 CD56 阴性的肌成纤维细胞表达高水平的核内脂肪生成相关转录因子 PPARγ，而各种 CD56 阳性的肌源性细胞在暴露于脂肪细胞诱导培养基后，仅维持极低水平的核受体转录因子。该技术可使肌肉生物学领域的研究人员探索健康或病理状态下人类肌肉样本中细胞命运决定的机制。观看本视频后，您应首先充分了解如何获得高产量、经纯化且特征明确的人源肌肉来源细胞，其次掌握如何对免疫荧光染色鉴定的细胞组分进行客观的定量分析。

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Developmental Biology

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