人骨骼肌中初级成肌细胞和成纤维细胞的分离与定量免疫细胞化学表征

本实验的总体目标是高效、高得率地分离人肌肉活检样本中获得的两种主要细胞群体，以便评估特定的表型和转录因子标志物。首先将人肌肉活检样本解离为单细胞悬液，这是第二步操作。经过七天培养后，利用免疫磁珠分选技术将细胞分离为 CD56 阳性（成肌细胞）和 CD56 阴性（成纤维细胞）两个组分。

然后对细胞进行染色，并对目标表型和蛋白质标志物进行成像。最终，免疫荧光显微镜结合定量图像分析可用于测量分选后细胞群体中特定定位于细胞核的转录因子的强度。该技术相较于现有方法（如荧光激活细胞分选）的主要优势在于其操作温和，能够高效分选人原代肌细胞，获得高产量和高细胞活性，且操作快速。

该技术的意义在于增进我们对衰老以及多种肌肉病理状态下所观察到的纤维脂肪性肌肉退变的细胞基础的理解。获取活检样本后，应尽快分离肌肉来源的前体细胞。首先，称量组织样本的重量，然后用基础培养基多次膨胀肌肉，以彻底清洗掉多余的血液。让肌肉在室温下静置沉淀30至60秒，随后吸除管中除最后两到三毫升以外的全部培养基。

接下来，将离心管倒置在无菌培养皿上，使残留液体将肌肉组织带入培养皿中。清除样本上所有可见的明显脂肪或结缔组织碎片。然后旋转培养皿以混匀残留的培养液，随后吸除全部培养液，按每100至400毫克组织加入三毫升的I型胶原酶和dispase酶溶液，并将肌肉样本切成非常小的1至2立方毫米大小的组织块。

当样品充分剪碎后，使用口径较大的25毫升移液管将组织碎片和酶溶液转移至无菌的10至20毫升锥形管中。用额外的3毫升酶溶液冲洗培养板，然后使用10毫升移液管将剩余的肌肉碎片全部转移至该管中。

将试管置于 37 摄氏度环境中 60 分钟，每 15 分钟用 10 毫升移液管轻轻吹打组织悬液一次。随后加入至少等体积的新鲜预热培养基，以终止酶解消化反应。

接下来，将细胞悬液通过一个100微米的滤网，以去除任何较大的碎片，然后离心收集细胞。将沉淀重悬于7至8毫升培养基中，随后将细胞接种于未包被的T25组织培养瓶中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养7天。

一周结束时，用胰蛋白酶作用细胞单层约三分钟。当细胞脱落后，加入 5 至 10 毫升骨骼肌生长培养基以防止过度消化，并通过离心收集细胞沉淀。计数后，保留部分细胞用于细胞谱系标志物鉴定，其余细胞用 15 毫升 PBS 洗涤，再次离心。

此次将沉淀重悬于170 µL室温的最大分选缓冲液中，轻轻吹打以重悬。加入35 µL充分混匀的与磁性微珠偶联的抗CD56抗体，使细胞悬浮其中。用移液器反复吹打数次混匀细胞溶液，并在4 °C条件下避光孵育15分钟，期间轻柔振荡。

孵育进行到一半时，用10毫升分选缓冲液洗涤细胞和磁珠混合液，离心并重悬。将沉淀物重悬于1毫升新鲜分选缓冲液中。接下来，用500微升分选缓冲液润洗预分离滤器和分选柱。

然后立即混匀，并将全部一毫升细胞悬液通过预分离滤器转移至柱中，用一毫升上样缓冲液冲洗液洗涤柱三次，收集未滞留的成纤维细胞组分，使其流过柱子，进入含有少量生长培养基的无菌50毫升锥形管中。随后将柱子从磁铁上取下，将柱塞推入柱子顶部，以收集CD56阳性细胞组分。在另一个含有温热生长培养基的50毫升锥形管中，生长培养基自此步骤中流出。

如果需要进行二次分选，则需考虑收集到的阳性与阴性细胞组分。若需要通过二次分选以获得更高的纯度，则在第一次分选时不要向CD56阳性细胞收集管中加入培养基，而应在适当的实验终点处，从滤器和柱子的润洗步骤开始重复操作。使用等体积预冷的8%多聚甲醛，将CD56阳性细胞培养物固定在其培养基中。

轻轻振荡孵育10分钟。然后吸除固定剂，并用PBS洗涤细胞两次，以进行细胞表面抗原的免疫染色。用含1% BSA的PBS封闭细胞，时间至少为1小时，随后依次使用相应的初级抗体和次级抗体对细胞进行标记。

根据您的显微镜和染色方法，优化检测器增益、激光功率和曝光设置。成像前，以所需数量的检测通道对细胞进行成像，并在六个以上的不同视野中采集图像。进行分析时，打开相应的TIFF图像文件，并将图像相互拖动以叠加对应的通道。

每个通道将作为独立的图层显示在图层面板中。接下来，在分析窗口中选择“选择数据点”，然后选择“自定义”并选取所需的测量参数。为了分析细胞核荧光强度，打开颜色范围对话框，并从下拉菜单中选择采样颜色。

然后按住 Shift 键，选择标记的细胞核所对应的特定色调。单击“保存”以存储此颜色范围选择掩模，供同一会话中选择的其他图像使用。选定细胞核后，右键单击并选择“填充”。

然后从下拉菜单中选择黑色，并确认不透明度设置为 100%。接下来，点击“选择”并执行反选。然后右键单击，再次选择“填充”，并从下拉菜单中选择白色填充。对当前二值化的细胞核图层执行分水岭算法，以分离任何部分重叠的细胞核。

转到“选择”然后“色彩范围”，接着选择“阴影”以选中各个分离的细胞核。然后将选区转移到包含所需标记物的16位灰度图像的图层，并点击“记录测量值”。最后，将选定的测量数据导出为文本文件，用于相应的分析软件进行进一步的油相处理。

通过将纯化的细胞群体进行红色染色，并结合脂肪生成和肌生成谱系标志物的免疫染色显示，只有成纤维细胞组分能够发生成脂性分化，成纤维细胞中大量脂肪的积聚肉眼可见；在处理第15天时，这些细胞表现出细胞核内PPARγ的强表达，进一步证明其已完全转化，同时这些细胞已将其残余的TE-7A结缔组织抗原释放至基质中。相比之下，肌源性细胞保持其正常表型，包括持续表达结蛋白（desmin）和肌球蛋白重链（myosin heavy chain），且未出现细胞核内PPARγ表达的上调。在本图中，展示了结蛋白阳性肌源性细胞区域的定量分析示例，以及获取这些数据所用的原始视野图像，用以说明在此特定接种密度和时间点下，单个细胞核中肌源性标志物表达的差异情况。

在此图中，展示了该方法在单细胞水平上直接比较不同细胞类型中转录因子水平的实用性。例如，这些 CD56 阴性的肌成纤维细胞表达高水平的核内脂肪生成相关转录因子 PPARγ，而各种 CD56 阳性的肌源性细胞在暴露于脂肪细胞诱导培养基后，仅维持极低水平的核受体转录因子。该技术可使肌肉生物学领域的研究人员探索健康或病理状态下人类肌肉样本中细胞命运决定的机制。

观看本视频后，您应首先充分了解如何获得高产量、经纯化且特征明确的人源肌肉来源细胞，其次掌握如何对免疫荧光染色鉴定的细胞组分进行客观的定量分析。