从人类骨骼肌成肌原细胞和成纤维细胞的分离和定量免疫细胞化学表征

该程序的总体目标是以高效率和高产量分离从人肌肉活检样本中获得的两个主要细胞群，以允许评估特定的表型和转录因子标志物。这是通过首先解离，将人体肌肉活检样本解离成单细胞悬液来实现的。在第二步中。培养 7 天后，通过免疫磁珠分离细胞，分为 CD 56 阳性（即致肌细胞）和 CD 56 阴性组分（成纤维细胞）。

然后对细胞进行染色和成像，以获得所需的目标表型和蛋白质标志物。最终，免疫荧光显微镜和定量图像分析可用于测量分选细胞群中选定核定位转录因子的强度。与荧光激活细胞分选等现有方法相比，这种技术使用免疫磁性细胞分选，其主要优点是它温和，可以以高产量和活力对人类原代肌肉细胞进行出色的分选，并且可以快速进行。

这项技术的影响延伸到增加我们对在衰老以及许多肌肉病理学中观察到的纤维脂肪肌变性的细胞基础的理解 在获得活检后尽快分离肌肉来源的前体细胞。首先，确定组织样本的重量，然后在基础培养基中使肌肉膨胀数次，以洗去样本中多余的血液。让肌肉在室温下沉淀 30 到 60 秒，然后从试管中吸出除最后 2 到 3 毫升的培养基。

接下来，将试管倒置到无菌培养皿上，让剩余的液体将肌肉带到培养皿上。现在清洁样品中任何明显的脂肪或结缔组织的任何可见碎片。然后旋转培养皿以动员剩余的培养基，然后吸出所有培养基，每 100 至 400 毫克组织加入 3 毫升一种胶原酶和 disbe 酶溶液，并将肌肉样品切成非常小的 1 至 2 毫米的立方体。

当样品充分切碎时。使用 25 毫升宽公猪移液管将组织片段和酶溶液转移到无菌的 10 至 20 毫升锥形管中。再用 3 毫升酶溶液清洗板，然后使用 10 毫升移液器将任何剩余的肌肉碎片转移到试管中。

将试管置于 37 摄氏度下 60 分钟。用 10 毫升移液器每 15 分钟重新测定组织悬液。然后用至少等量的新鲜复温生长培养基终止酶解离。

接下来，将细胞悬液通过 100 微米过滤器以去除任何大块碎片，然后离心细胞复苏。将沉淀悬浮在 7 至 8 mL 生长培养基中，然后在未包被的 T 25 组织培养瓶中孵育细胞。37 摄氏度，二氧化碳含量为 5%，持续 7 天。

在一周结束时，胰蛋白酶观察细胞单层 3 分钟。当细胞分离后，加入 5 至 10 毫升骨骼肌生长培养基以防止过度消化，并通过离心使细胞沉淀。然后在计数后，保留一些细胞用于细胞谱系标志物表征，并在 15 毫升 PBS 离心机增益中洗涤剩余的细胞。

这次将沉淀重悬于 170 微升室温最大分选缓冲液中，然后轻轻移液以复苏。将细胞悬浮在 35 μL 充分混合的抗 CD 56 抗体偶联的磁性微珠中。用移液管将细胞溶液混合几次，并在 4 摄氏度下与温和的植物一起孵育混合物 15 分钟。

在孵育后的中途，用 10 mL 分选缓冲液离心机和reus 洗涤细胞和珠子溶液。将沉淀悬浮在一毫升新鲜的分选缓冲液中。接下来，用 500 μL 源缓冲液润滑预分离过滤器和色谱柱。

然后立即混合并转移整个 1 毫升细胞悬液通过预分离过滤器并进入色谱柱，用 1 毫升源缓冲液强力清洗液冲洗色谱柱 3 次，收集非保留成纤维细胞组分，通过色谱柱进入含有少量生长培养基的无菌 50 毫升锥形管中。然后从磁力架上取下色谱柱，将柱塞压入色谱柱顶部，以收集 CD 56 阳性细胞组分。在含有温生长的单独 50 毫升锥形管中，该步骤排放培养基。

如果要进行双重排序，则考虑收集的正和负细胞组分。如果需要双重来源以获得更高的纯度，则不要在第一次排序时将培养基放入 CD 56 阳性收集管中，而是在适当的实验终点处从过滤器和色谱柱润滑开始重复步骤。将 CD 56 阳性细胞培养物固定在培养基中，使用等体积的冰冷 8% 对位甲醛。

10 分钟，植被柔和。然后吸出固定剂并用 PBS 洗涤细胞两次，以对细胞表面抗原进行免疫染色。在 PBS 中的 1% BSA 中封闭细胞至少一小时，然后用相关的一抗和二抗标记细胞。

优化与显微镜和染色剂相关的检测器增益、激光功率和曝光设置。在成像之前，细胞在所需数量的检测通道和超过 6 个不同的视野中拍摄细胞图像。要进行分析，请打开相应的 TIFF 图像文件，然后将图像相互拖动，以叠加相应的通道。

每个通道将在 Layers 面板中显示为一个单独的图层。接下来，在分析窗口中，选择 select data points（选择数据点），然后选择 Custom（自定义）并选择所需的测量值。要分析细胞核荧光强度，请打开 color range 对话框，然后从下拉菜单中选择 sampled colors。

然后按住 Shift 键，选择特定于标记的细胞核的音调。单击"保存"以存储此颜色范围选择蒙版，以便与在同一会话中选择的其他图像一起使用。选择原子核后，写下 click 并选择 fill。

然后选择 黑色 从下拉菜单中确认不透明度设置为 100%接下来，单击 选择 并反转。然后右键单击并选择 填充 再次并从下拉菜单中选择一个白色填充。执行分水岭算法以分离现在二进制核层上任何部分重叠的原子核。

转到 select 然后 color range，然后转到 shadows 以选择单个分离的细胞核。然后将选区传输到包含所需标记的 16 位灰度图像的图层，然后单击 Record measurements（记录测量）。最后，将所选测量值作为文本文件导出到相应的分析软件中，以便进一步处理油。

纯化细胞群的红色染色与成脂和成肌谱系标志物的免疫染色相结合，显示只有成纤维细胞部分能够发生表观分化，成纤维细胞的脂肪大量积累是肉眼可见的，并且在治疗第 15 天通过这些细胞强烈表达核 PPAR γ 进一步证明它们的完全转化， 这些细胞已将任何剩余的 TE 7 A 结缔组织抗原释放到其底物上。相比之下，生肌细胞保持其正常表型，包括它们结蛋白和肌球蛋白重链的表达，而没有上调核 PPAR γ 表达。在该图中，显示了 Desmond 阳性生肌细胞区域的定量分析示例以及从中获得这些数据的区域，说明了在这个特定接种密度和时间点单个细胞核中生肌表达的变化。

在此图中，展示了该方法按细胞水平直接比较细胞上不同细胞类型中转录因子水平的实用性。例如，这些 CD 56 阴性肌成纤维细胞表达高水平的核成脂转录因子 PPAR γ，而各种 CD 56 阳性肌原细胞在暴露于脂肪细胞诱导培养基后仅维持非常低水平的核受体转录因子。该技术使肌肉生物学领域的研究人员能够探索健康或病理人类肌肉样本中细胞命运决定的机制。

看完这个视频，您首先应该对如何获得高产量的纯化和表征良好的人肌源性细胞有很好的了解，其次，如何对免疫荧光染色鉴定的细胞成分进行客观定量分析。