小鼠骨骼肌肉外泄原发性肌基器的分离和分化
2019年10月15日
肌细胞是增殖前体细胞，分化形成多核肌管，并最终骨骼肌肌纤维。在这里，我们提出了一个协议，从年轻的成年小鼠骨骼肌肉有效隔离和培养原发性肌体。该方法支持对培养中的肌肉细胞进行分子、遗传和代谢研究。
这是一个协议，用于分离原发性小鼠肌肉干细胞，用于研究代谢外体。与过去尝试过的其他协议相比，该协议提供了更多的干细胞。更重要的是，一旦我们把这些干细胞分化成 myotube，它们就表现出正常的生理，所以像昼夜节律一样。
首次尝试此过程时，请做详细的笔记并保存多个图像，因为每个组织外植看起来都不同，并且肌细胞的外培养会有变化。如果没有视觉演示，很难知道是否隔离了正确的单元格。当我们在实验室中建立这种方法时，我们受益于其他人的慷慨帮助， 他们向我们展示了这种方法。
根据手稿准备消毒盘后，将两到三张厚吸水纸放入塑料袋中，用移液器用无菌水润湿纸张表面，准备湿润室。将腔室在紫外线下放置五分钟进行消毒。从四到八周大的老鼠解剖所需的肌肉，并在含有每毫升根霉素40微克的PBS中轻轻冲洗以进行灭菌。
使用无菌钳将肌肉转移到无菌的10厘米非涂层培养皿。在肌肉上加入0.5至1毫升电镀介质，使组织湿润，但无法浮动。使用无菌手术刀或剃刀刀片轻轻地将肌肉切成小碎片。
使用钳子或移液器将肌肉碎片转移到预涂覆的六厘米板表面。非常轻轻地将额外的 0.8 毫升电镀介质覆盖在组织上。将含有湿润室肌肉碎片的六厘米培养皿放在湿润室内，并在 37 摄氏度和 5%的二氧化碳下返回孵化器 48 小时。
在37摄氏度的水浴中准备和预热肌细胞介质、三辛和PBS-根霉素。要为每个肌肉组涂上一个T25烧瓶，在烧瓶表面加入两毫升的涂层溶液，轻轻摇动，在表面形成均匀的涂层，并在四摄氏度下孵育烧瓶一小时。现在用移液器，从肌肉外植中去除电镀介质，然后用两毫升PBS-根霉素轻轻冲洗肌肉外植。
快速拆下 PBS，不要让板位于 PBS 中。然后轻轻加入一毫升PBS-根霉素，将盘子放在37摄氏度的培养箱中一分钟。使用 P1000 移液器将 PBS 与细胞收集到 15 毫升离心管中。
接下来，在盘子中加入一毫升的三辛，然后将其返回到37摄氏度的培养箱中三分钟。轻轻敲击板，将肌细胞进行分离。用单元格收集 trypsin，并结合 PBS 集合。
将八毫升肌细胞介质加入离心管，轻轻倒置混合。轻轻覆盖肌肉板上两毫升电镀溶液，然后将板返回 37 摄氏度的培养箱。在离心机中旋转含有细胞的离心管，以200倍g旋转3分钟。
吸上一道液，在管中保持约一毫升。轻轻添加肌细胞介质，将细胞转移到预涂层的烧瓶中，并将烧瓶放在 37 摄氏度的培养箱中。从 P0 肌爆 T25 烧瓶中吸出介质。
用两毫升温暖的PBS-根霉素短暂冲洗细胞，然后从烧瓶中吸出PBS。将两毫升温暖的PBS放入每个含有肌细胞的烧瓶中。将带 PBS 的烧瓶放入 37 摄氏度的培养箱中三分钟。
然后用力敲击烧瓶的侧面，将细胞分离。在光学显微镜下检查自由漂浮的肌细胞。将烧瓶直立放在组织培养罩中，用 10 毫升肌细胞介质冲洗烧瓶底部两到三次，以确保所有细胞都脱落。
在15毫升离心管中收集细胞介质混合物。在200倍g下离心3分钟。吸气介质在管中留下约一毫升，小心避免细胞颗粒。
轻轻地将适当体积的肌细胞介质添加到离心管中，然后轻轻混合。将细胞混合物分配到新的T75烧瓶中，每个瓶6毫升。在每个新的T75烧瓶中加入10毫升的肌细胞介质。
水平轻轻摇动烧瓶，将细胞分布，并在37摄氏度的培养箱中放置过夜。在该协议中，在标准光显微镜下观察从外植中产生原生细胞。早期收获的肌细胞出现小圆和明亮的球体。
肌细胞分化需要四到六天的时间，在此期间，细胞的形态从单圆球变成拉长融合的长多核纤维。生产了完全差异化的 myotube，这些管管已准备好测量氧气消耗率。这些单元可用于许多下游应用。
例如，我们经常使用它们来研究海马仪器中的基板通量。
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概述
本协议概述了从年轻成年小鼠骨骼肌中分离原代肌母细胞的方法，便于体外研究肌肉细胞代谢。与以往的技术相比，该方法能产生更大数量的干细胞，从而允许进行详细的生理学研究。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 肌肉生理学
背景
- 肌母细胞是分化为肌管和骨骼肌纤维的前体细胞。
- 了解肌肉细胞代谢对各种生物学研究至关重要。
- 以往的协议产生的肌肉干细胞数量较少。
- 视觉演示对于成功分离正确的细胞至关重要。
研究目的
- 提出一种分离原代肌母细胞的高效方法。
- 为肌肉细胞的分子和遗传学研究提供便利。
- 为肌肉细胞代谢和生理学提供见解。
所用方法
- 从小鼠骨骼肌中分离原代肌母细胞。
- 培养肌母细胞以分化为肌管。
- 对程序中组织外植体进行视觉记录。
- 与以往的分离协议进行比较。
主要结果
- 该协议产生更大数量的肌母细胞。
- 从这些细胞衍生的肌管表现出正常的生理特征。
- 组织外植体的变异性需要仔细观察和记录。
- 经验丰富的研究人员的视觉指导可以增强成功分离。
结论
- 该方法对研究肌肉细胞代谢有效。
- 它为获得原代肌母细胞提供了可靠的方法。
- 未来的研究可以利用此协议进行各种与肌肉相关的研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Robust isolation and differentiation of primary myoblasts from mouse skeletal muscle explants enables reproducible ex vivo modeling of muscle cell metabolism for early-stage drug discovery. This system supports high-fidelity investigation of metabolic pathways, substrate utilization, and genetic perturbations in a scalable, standardized format. The approach enhances predictive confidence for target validation and mechanistic de-risking in muscle-related therapeutic programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of metabolic pathways and functional target validation in primary muscle cells.
- Supports mechanistic de-risking by providing physiologically relevant myotube models with normal circadian rhythms.
- Facilitates hypothesis-driven studies on muscle metabolism and gene function using exogenous DNA or viral vectors.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible source of primary myoblasts for quantitative metabolic assays, including substrate flux analysis.
- Supports assay standardization and scalability for downstream compound screening in muscle cell systems.
- Enables preparation of differentiated myotubes suitable for high-content metabolic readouts.
Translational & Preclinical Research
- Offers a disease-relevant ex vivo system for studying metabolic phenotypes across mouse models.
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling direct measurement of oxygen consumption and substrate utilization.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by bridging in vitro and in vivo muscle biology.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early target validation through assay development and preclinical metabolic studies.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification in primary muscle cells.
- Screening: Delivers reproducible, scalable cell populations for quantitative metabolic assays.
- Analytics: Enables measurement of oxygen consumption rates and substrate flux for comparative analysis.
- Translational Research: Provides an ex vivo platform for aligning metabolic findings with in vivo models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow for repeated use across muscle metabolism projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in muscle metabolism studies.
- Operational Value: Enhances reproducibility, scalability, and standardization of primary cell workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency in early-stage muscle target programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of muscle-related therapeutic assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation and differentiation techniques.
- Needs access to sterile tissue culture facilities and metabolic assay instrumentation.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- May require adaptation for different mouse models or muscle tissue sources.
- Visual documentation and training are critical due to variability in explant outgrowth.
