从小鼠骨骼肌组织外植体中分离和分化原代成肌细胞

本方案用于分离原代小鼠肌肉干细胞，以进行体外代谢研究。与我们过去尝试过的其他方案相比，本方案可获得更大量的干细胞。尤为重要的是，当我们将这些干细胞分化为肌管细胞后，其表现出正常的生理特性，例如昼夜节律等。

首次尝试该操作步骤时，应详细记录并保存多张图像，因为每块组织外植体的外观均有所不同，成肌细胞的迁出情况也会存在差异。若无直观的图像参考，很难判断是否成功分离出正确的细胞。我们在实验室建立该方法时，得益于其他研究者的慷慨帮助，他们曾亲自向我们演示了该技术。

根据文稿要求准备好用于解剖的培养皿后，将两到三层厚的吸水纸放入塑料袋中，制成湿润腔室，并用移液器吸取无菌水润湿纸张表面。将该腔室置于紫外灯下照射五分钟以进行消毒。从一只4至8周龄的小鼠中解剖出目标肌肉组织，并在含有40微克/毫升庆大霉素的磷酸盐缓冲液（PBS）中轻轻冲洗，以达到消毒目的。

使用无菌镊子将肌肉组织转移至一个无菌的10厘米未包被培养皿中。加入0.5至1毫升铺板培养基，使组织保持湿润但不漂浮。使用无菌手术刀或剃刀小心地将肌肉切成小片段。

使用镊子或移液器将肌肉碎片转移至预先包被的6厘米培养皿表面。轻轻覆盖0.8毫升铺板培养基于组织上。将含有肌肉碎片的6厘米培养皿放入湿润 chamber 中，并置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育48小时。

将成肌细胞培养基、胰蛋白酶和含庆大霉素的磷酸盐缓冲液（PBS-庆大霉素）在37摄氏度水浴中预热。为每组肌肉包被一个T25培养瓶，向瓶表面加入2毫升包被液，轻轻摇晃使液体均匀覆盖表面，并在4摄氏度孵育1小时。现在用移液器从肌肉外植体中移除铺板培养基，并用2毫升PBS-庆大霉素轻轻冲洗肌肉外植体。

迅速移除 PBS，切勿让培养板在 PBS 中停留。然后轻轻加入一毫升含庆大霉素的 PBS，并将培养板放入 37 摄氏度培养箱中孵育一分钟。使用 P1000 移液器将含有细胞的 PBS 收集至 15 毫升离心管中。

接着，向培养板中加入1毫升胰蛋白酶，并将其放回37°C培养箱中孵育3分钟。轻轻敲击培养板以使成肌细胞脱落。收集含有细胞的胰蛋白酶溶液，并与PBS收集液合并。

向离心管中加入 8 mL 成肌细胞培养基，轻轻倒置混匀。在肌细胞培养板上轻轻铺加 2 mL 铺板溶液，然后将培养板放回 37°C 培养箱中。将含有细胞的离心管在离心机中以 200 ×g 离心 3 分钟。

吸去上清液，管中保留约一毫升。轻轻加入成肌细胞培养基，将细胞转移至预先包被的培养瓶中，并将培养瓶放入37°C培养箱。吸去P0代成肌细胞T25培养瓶中的培养基。

用两毫升温热的含庆大霉素 PBS 短暂冲洗细胞，然后吸去培养瓶中的 PBS。向每个含有成肌细胞的培养瓶中加入两毫升温热的 PBS。将加有 PBS 的培养瓶放入 37 摄氏度培养箱中孵育三分钟。

然后轻轻敲击培养瓶的侧面，使细胞脱落。在光学显微镜下检查是否有游离的成肌细胞。将培养瓶直立放置于组织培养罩内，用10毫升成肌细胞培养基冲洗培养瓶底部两到三次，以确保所有细胞均被充分脱落。

将细胞培养基混合物收集到15毫升离心管中。在200 × g条件下离心3分钟。吸除上清液，保留约1毫升液体于管中，注意避免触及细胞沉淀。

向离心管中轻柔加入适量的成肌细胞培养基，并轻轻混匀。将细胞混合物以每瓶6毫升的量分配至新的T75培养瓶中。向每个新的T75培养瓶中加入10毫升成肌细胞培养基。

将锥形瓶水平轻轻摇晃以分散细胞，并置于37摄氏度培养箱中过夜。在本方案中，通过标准光学显微镜观察从外植体中长出的原代细胞。早期收获的成肌细胞呈微小、圆形且明亮的球状。

成肌细胞的分化过程耗时四到六天，在此期间，细胞形态由单个圆形球状逐渐转变为细长的、融合的多核纤维。最终获得完全分化的肌管细胞，可用于氧消耗速率的测定。这些细胞还可用于多种后续实验应用。

例如，我们经常使用它们在Seahorse仪器中研究底物通量。