Name: 从骨骼肌活检程序分离、培养、表征和分化人类肌肉祖细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 s
Description: 学习从骨骼肌活检组织分离、培养和表征人类肌肉祖细胞的方法，用于研究肌肉再生与细胞分化能力。该技术可追踪细胞增殖过程，为再生医学提供可靠的实验模型。

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作者感谢康奈尔大学生物技术资源中心成像设施在荧光激活细胞分选方面的帮助。我们还感谢 Molly Gheller 在受试者招募方面的协助，以及 Erica Bender 进行骨骼肌活检的工作。最后，感谢所有受试者为本研究付出的时间与积极参与。本研究由美国国立卫生研究院下属国家衰老研究所资助，资助编号为 R01AG058630（资助对象：B.D.C. 和 A.E.T.）；同时获得医学研究格伦基金会与美国衰老研究联合会青年教员资助项目（资助对象：B.D.C.）以及康奈尔大学妇女总统委员会（资助对象：A.E.T.）的支持。

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<li>Yokoyama, W. M., Thompson, M. L., Ehrhardt, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+and+thawing+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation and thawing of cells.</a> Current Protocols in Immunology. , Appendix 3, 3G (2012).</li>
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<li>Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+profile+distinguishes+variability+in+human+myogenic+progenitor+cell+expansion+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Transcript profile distinguishes variability in human myogenic progenitor cell expansion capacity.</a> Physiological Genomics. 50 (10), 817-827 (2018).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

原代人肌源性祖细胞（hMPCs）是研究骨骼肌生物学及再生过程的重要实验模型，此外，hMPCs 还具有用于治疗的潜力。然而，在科研和治疗中应用原代 hMPCs 仍存在一些公认的挑战，包括对来源于人类的细胞认知尚不充分10。不同供体来源的细胞培养物在扩增能力方面也存在较大差异，这限制了 hMPCs 的应用潜力，并可能影响研究结果的可重复性11。例如，最近的研究表明，采用本实验方案所述方法分离得到的 hMPCs，其扩增能力存在差异，而这种差异是由转录谱驱动的，且与供体的性别或年龄无关11。
本文介绍一种高效且高产量的方法，可分离获得足够数量的人源肌肉前体细胞（hMPCs），用于多种后续实验应用，包括向肌管细胞分化，从而在体外模拟肌生成过程。本方法依赖流式细胞分选技术（FACS）分离CD56+/CD29+细胞，此类细胞此前已被鉴定为富含表达Pax7的细胞群体12</su...

骨骼肌是人体最大的器官系统，占全身质量的30−40%1。除了在运动中发挥公认的作用外，骨骼肌还维持体温和身体姿势，并在全身营养物质稳态中起核心作用。涉及人类受试者、动物和细胞培养模型的研究对于解答骨骼肌生物学和再生相关问题均具有重要价值。分离和培养人原代肌肉前体细胞（hMPCs）提供了一个可靠的模型，使得细胞培养技术和操作能够应用于人类样本。使用hMPCs的一个优势在于它们保留了每个供体的遗传和代谢表型2,3。供体表型的维持使研究人员能够考察肌源性过程中个体间的差异。例如，我们已采用hMPC表征方法鉴定出hMPC群体扩增能力中与年龄和性别相关的差异4。
本实验方案的目的是详细阐述从骨骼肌活检组织中分离、培养、鉴定和诱导分化&#160;hMPCs 的技术。在先前研究的基础上，这些研究描述了 hMPCs 并鉴定了可用于 hMPCs 分离的潜在细胞表面标志物5,6，本方案填补了从细胞分离到细胞鉴定之间的重要知识空白。此外，本方案中包含的详细分步操作说明，使得 hMPCs 的分离与鉴定对广大科研人员而言更加易于实施，包括那些此前对 hMPCs 操作经验有限的研究者。我们的方案是最早描述使用成像细胞仪追踪细胞群体的方法之一。新设计的成像细胞仪属于前沿技术，具有高通量、基于微孔板的特点，可在数分钟内实现对培养容器每孔中所有细胞的活细胞成像、细胞计数以及多通道荧光分析。该系统能够在对培养过程干扰极小的情况下，快速量化整个细胞群体在增殖和活力方面的动态变化。例如，我们可在体外连续数天客观地测量汇合度，以确定来自不同供体的各培养样本的生长动力学。文献中的许多实验方案，尤其是涉及 MPCs 分化的方案，通常要求细胞达到特定的汇合度后才能开始诱导分化或处理7。我们的方法可对培养容器中每孔的汇合度进行客观判断，使研究人员能够以无偏倚、非主观的方式启动处理程序。
过去，使用原代 hMPC 的主要局限性在于产量较低，从而限制了可用于实验的细胞数量。我们及其他研究者已证明，从骨骼肌活检组织中获得的 MPC 产量为每毫克组织 1−15 个 MPC（图 1）8。由于本方案允许细胞在经荧光激活细胞分选（FACS）纯化前进行四次传代，因此即使仅使用少量活检组织（50−100 mg）所获得的冻存 hMPC 产量，也足以满足需要开展多项实验的研究需求。我们的 FACS 方案可获得约 80% 纯度（Pax7 阳性）的 MPC 群体，因此本方案在产量和纯度方面均得到了优化。

<table><tbody><tr><td>0.25% 胰蛋白酶，2.21 mM EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-Cl</td><td>用于从细胞培养器皿中消化贴壁的&lt;em&gt;h&lt;/em&gt;MPCs</td></tr><tr><td>10 cm 细胞培养板</td><td>VWR</td><td>664160</td><td>用于培养&lt;em&gt;h&lt;/em&gt;MPCs 的培养板</td></tr><tr><td>15 mL Falcon 管</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td>在&lt;em&gt;h&lt;/em&gt;MPC 分离和培养流程中全程使用的 15 mL 锥形管</td></tr><tr><td>24 孔细胞培养板</td><td>Grenier Bio-One</td><td>662 160</td><td>用于培养&lt;em&gt;h&lt;/em&gt;MPCs 的培养板</td></tr><tr><td>7-AAD 活性染色液</td><td>eBioscience</td><td>00-6993-50</td><td>在 FACS 分选过程中用于识别活细胞的活性染料</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 标记抗人 CD29 抗体，克隆号：TS2/16</td><td>BioLegend</td><td>303016</td><td>用于 FACS 的偶联抗体&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>黑色 96 孔细胞培养板</td><td>Grenier Bio-One</td><td>655079</td><td>适用于使用 Celigo S 进行荧光成像的 96 孔细胞培养板</td></tr><tr><td>Celigo S</td><td>Nexcelcom Bioscience</td><td></td><td>用于追踪&lt;em&gt;h&lt;/em&gt;MPC 培养的成像细胞仪</td></tr><tr><td>细胞滤网</td><td>VWR</td><td>352350</td><td>在骨骼肌活检组织处理过程中用于去除大块碎片的细胞滤网</td></tr><tr><td>Ⅰ型胶原蛋白（大鼠尾来源）</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>用于包被细胞培养板的胶原蛋白&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胶原酶 D</td><td>Roche</td><td>11 088 882 001</td><td>用于降解骨骼肌活检组织中的胶原蛋白及其他结缔组织</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>VWR</td><td>WN182</td><td>用于&lt;em&gt;h&lt;/em&gt;MPCs 的冷冻保存</td></tr><tr><td>中性蛋白酶 II</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>D4693</td><td>用于骨骼肌活检组织酶解消化的蛋白酶</td></tr><tr><td>低糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基粉末</td><td>Gibco</td><td>31600-034</td><td>用于骨骼肌活检组织处理的低糖 DMEM</td></tr><tr><td>Dulbecco 磷酸盐缓冲液</td><td>Gibco</td><td>21600-010</td><td>用于骨骼肌活检组织处理的 PBS</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠盐二水合物</td><td>J.T. Baker</td><td>4040-01&amp;nbsp;</td><td>FACS 缓冲液所需试剂</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>VWR</td><td>89510-186&amp;nbsp;</td><td>用于&lt;em&gt;h&lt;/em&gt;MPC 生长培养基的胎牛血清</td></tr><tr><td>Ham's F12 培养基</td><td>Gibco</td><td>21700-026</td><td>&lt;em&gt;h&lt;/em&gt;MPCs 的基础培养基</td></tr><tr><td>热灭活马血清</td><td>Gibco</td><td>26-050-070</td><td>用于配制&lt;em&gt;h&lt;/em&gt;MPC 分化培养基的马血清</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>iNCyto</td><td>DHC-N0105</td><td>用于细胞计数</td></tr><tr><td>Hibernate A 培养基</td><td>Gibco</td><td>A1247501</td><td>用于保存骨骼肌活检组织的培养基</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 三盐酸盐三水合物</td><td>Life Technologies</td><td>H21492</td><td>用于通过 Celigo S 识别所有细胞的 DNA 染料</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416P-4</td><td>用于&lt;em&gt;h&lt;/em&gt;MPCs 的程序控速冷冻</td></tr><tr><td>Moxi 缓冲液</td><td>Orflo</td><td>MXA006</td><td>自动细胞计数仪专用缓冲液</td></tr><tr><td>Moxi 细胞计数卡盒</td><td>Orflo</td><td>MXC002</td><td>自动细胞计数仪专用卡盒</td></tr><tr><td>Moxi z Mini 自动细胞计数仪</td><td>Orflo</td><td></td><td>自动细胞计数仪</td></tr><tr><td>Mr. Frosty 冷冻容器</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td>市售的程序控速细胞冷冻容器</td></tr><tr><td>正常山羊血清（10%）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50062Z</td><td>用于 FACS 缓冲液的山羊血清</td></tr><tr><td>PE-Cy7 标记小鼠抗人 CD56 抗体，克隆号：B159</td><td>BD Pharmingen</td><td>557747</td><td>用于 FACS 的偶联抗体&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素 100 倍溶液</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td>添加至培养基中的抗生素</td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3566</td><td>用于通过 Celigo S 识别死细胞的 DNA 染料</td></tr><tr><td>重组人碱性成纤维细胞生长因子</td><td>Promega</td><td>G5071</td><td>添加至&lt;em&gt;h&lt;/em&gt;MPC 生长培养基中以防止自发分化的补充因子</td></tr><tr><td>Recovery 细胞培养冷冻保存液&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12648-010</td><td>用于冷冻保存肌肉活检悬液的培养基</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-3</td><td>添加至 Ham's F12 培养基中</td></tr><tr><td>无菌圆底 5 mL 管</td><td>VWR</td><td>60818-565</td><td>用于 FACS 的试管</td></tr><tr><td>UltraComp eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-2222-42</td><td>用于校准流式 FACS 设置的补偿微珠</td></tr></tbody></table>

从骨骼肌活检手术中分离、培养、鉴定及诱导人肌肉前体细胞分化

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

使用原代人体组织和细胞是研究生物学及生理学过程（如骨骼肌再生过程）的理想选择。然而，在使用人原代成体干细胞时存在公认的挑战，尤其是来源于骨骼肌活检的人肌肉前体细胞（hMPCs），其主要问题包括从采集组织中获得的细胞产量较低，以及不同供体来源的细胞在生长和死亡参数方面存在较大异质性。尽管在实验设计中纳入这种异质性需要更大的样本量才能检测到显著效应，但它也使我们能够识别影响hMPC&#160;扩增能力差异的潜在机制，从而更深入地理解骨骼肌再生过程中的异质性。揭示能够区分不同培养物扩增能力的新型机制，有望推动改善骨骼肌再生能力的治疗策略的开发。

可从图1中查看从人肌肉组织中分离人肌肉前体细胞（hMPC）的代表性流式细胞术结果。首先根据侧向散射和前向散射对事件设门，以排除死细胞或碎片，再选择7-AAD阴性细胞以确保细胞具有活性，从而鉴定hMPC。同时表达细胞表面标志物CD56和CD29的细胞即为hMPC群体。仅60 mg的活检组织大约可获得75−250个hMPC。
典型的汇合度扫描结果如图2A所示。图2B中的绿色轮廓由成像细胞仪生成，展示了成像细胞仪如何根据所选的分析设置来确定细胞汇合度。在所示的两幅图像中，成像细胞仪测定的汇合度与用户通过肉眼判断的汇合度一致。然而，这些图像也揭示了成像细胞仪并非完美无缺。例如，红色箭头指示的是培养板上的一个缺陷区域，该区域被误识别为细胞。如果培养板上存在大量此类缺陷，则最终的汇合度结...

我们介绍了从骨骼肌活检组织中分离、培养、鉴定和诱导人原代肌前体细胞（hMPCs）的技术。 通过这些方法获得并鉴定的hMPCs可用于后续研究，以探讨与人类肌生成及骨骼肌再生相关的问题。

使用原代人类组织和细胞是研究骨骼肌等生物与生理过程的理想选择……

分离调控骨骼肌再生的人类肌肉前体细胞，可使我们在保留供体差异性的同时，研究再生过程背后的相关机制。该技术能够从小量组织中获得大量人类肌肉前体细胞，并利用少量细胞对其进行表型分析。该方法专为分离人类肌肉前体细胞而设计，用于追踪其增殖与分化能力，并将这些数据与骨骼肌再生过程相关联。这种相对简单技术最难的部分在于确保每一步操作都具有可重复性，以优化细胞的得率和纯度。要成功分离细胞，需要完成多个步骤。其中一些步骤若通过直观观察会更容易理解。为了从活检组织中分离人肌肉前体细胞，需在无菌条件下将肌肉组织放入无菌培养皿中，并使用无菌手术刀将组织切成一立方毫米大小的碎块。当所有组织均被切碎后，将组织块转移至含有10毫升磷酸盐缓冲液（PBS）的15毫升离心管中，静置使组织自然沉降，随后小心吸除上清液，避免扰动组织沉淀。按照上述方法再次洗涤组织碎片一次后，弃去PBS，加入10毫升低糖型杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco's modified Eagle medium）。待组织沉淀后，移除上清液，并将组织块重悬于 3 毫升消化液中。将组织置于 37 摄氏度孵育 30 分钟，每隔 10 分钟用 1 毫升血清学移液管吹打肌肉碎片一次。孵育结束后，向样品中加入 83 微升额外的消化液和 24 微升 Dispase 溶液，并使用宽口移液管枪头每 5 至 10 分钟吹打组织一次，直至形成均匀的悬液。均匀的悬液对于最大限度回收人类肌肉前体细胞至关重要。如果悬液无法通过标准的1,000微升移液器吸头，则需继续消化。为分离Pax7阳性细胞，应按照方案对细胞进行染色并设门。使用配备100微米喷嘴、压力为20 psi的流式细胞仪，将CD56、CD29双阳性的人肌源性前体细胞分选至含有300微升荧光激活细胞分选缓冲液垫层的收集管中。随后，将分选后的人肌源性前体细胞以每平方厘米3.5 × 10⁴个细胞的浓度接种于包被有胶原的24孔板中，孔内预先加入已预热的生长培养基。为进行汇合度扫描，将培养板载入成像细胞仪，选择“创建新扫描”以及“板类别”、“板配置文件”和“板编号”。在“应用”下选择“汇合度”和“汇合度1”，并选择待观察的孔。 找到一个焦平面，使细胞相对于背景呈现白色，然后选择“手动注册”。使用鼠标选中所有需要扫描的孔，然后选择“开始扫描”。整个孔区域将自动进行扫描。选择针对该培养板和细胞类型的最佳分析设置，然后选择“开始分析”。首先使用成像细胞仪测量汇合度。随后，为在成像细胞仪上进行细胞计数，将每孔中的培养基更换为 200 微升染色液。在37摄氏度孵育15分钟后，将染色液更换为100微升新鲜的Ham's F12培养基。将培养板放回成像细胞仪，在“Application”（应用）中选择“Cell Viability and Live Dead Total”（细胞活力与活死细胞总数）。其中，“Live”（活细胞）通道将显示明场图像，“Dead”（死细胞）通道将显示碘化丙啶染色结果，而“Total”（总细胞）通道将显示Hoechst 33342染色结果。在“对焦设置”中，点击“自动注册”。在“总计通道”下，将通道设置为蓝色。使用“查找对焦”使细胞核清晰对焦，并点击“设置偏移”以选择对焦位置。在“Dead”通道下，将通道设置为红色，使用“Find Focus”功能使死细胞对焦。单击“Set Offset”以选定焦点，然后选择“Start Scan”开始扫描。随后选择适合该培养板和细胞类型的分析参数，并选择“Start Analysis”以开始分析。分析完成后，需目视确认分析是否准确地计数了细胞。若扫描和分析结果满意，则将培养板放回培养箱；否则需重新扫描或调整分析参数。可通过首先根据侧向散射和前向散射面积对事件设门，以排除死细胞或碎片，再选择7-AAD阴性细胞（即活细胞），从而鉴定人肌肉前体细胞。同时表达 CD56 和 CD29 细胞表面标志物的细胞即代表人类肌肉前体细胞群体。人类肌肉前体细胞也可通过其 Pax7 表达来鉴定。事实上，Pax7 在 FACS 分选后的总细胞群体中富集，并可在多次传代过程中维持表达。此处展示了一次具有代表性的汇合度扫描结果。绿色轮廓由成像细胞仪生成，显示了成像细胞仪根据所选分析设置确定汇合度的方式。不同供体之间常表现出相似的异质性和细胞核计数。发现并准确表征这种异质性是成像细胞仪的一项关键应用。然而，来自不同供体的融合度测量结果与细胞核计数高度相关。可通过胚胎型肌球蛋白重链的表达来区分由人肌肉前体细胞分化形成的肌管细胞。在流式细胞仪上选择设门参数时保持一致性非常重要，以确保从每位供体中分离出相同的细胞群体。分离后的人肌肉前体细胞可用于多种用途，包括鉴定人肌肉前体细胞增殖与分化过程中独特的代谢需求。人肌肉前体细胞的分离使得研究人员能够区分人与小鼠肌肉前体细胞在细胞表面标志物表达上的差异。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

从骨骼肌活检程序分离、培养、表征和分化人类肌肉祖细胞

显微解剖外植体技术是一种稳健且可靠的方法，可用于从幼年、成年或胚胎期肌肉中分离出具有增殖能力的骨骼肌细胞，以获取骨骼肌干细胞。这些细胞具有独特性，可通过克隆化培养获得骨骼肌干细胞系，用于体内移植。...

成年与胚胎骨骼肌微植块培养及骨骼肌干细胞的分离

从小鼠骨骼肌中通过酶解分离、表面标记及流式细胞术纯化纤维/脂肪生成和肌源性前体细胞的方法。...

从骨骼肌中纯化前体细胞

肌纤维的分离与培养是金标准 体外...

分离与培养成年骨骼肌单个肌纤维及其卫星细胞

人类骨骼肌中的血管含有多种多能前体细胞群体，非常适合用于再生医学应用。该分离方法可同时从血管的三个结构层中分别纯化出三种多能前体细胞群体：来自内膜的肌源性内皮细胞、来自中膜的周细胞以及来自外膜的外膜细胞。...

从人骨骼肌中分离血管来源的多能前体细胞

从人类肌肉中获得的主要贴壁细胞类型为成肌细胞和成纤维细胞。本实验通过基于CD56抗原的磁性激活细胞分选技术对细胞群体进行富集。随后使用特异性抗体进行免疫标记，并结合图像分析技术，实现对单个细胞胞质和细胞核特征的定量分析。...

人骨骼肌中初级成肌细胞和成纤维细胞的分离与定量免疫细胞化学表征

本方案描述了从肌肉或皮肤组织中分离活细胞并建立成肌细胞和成纤维细胞原代培养体系的技术。同时介绍了一种使这些细胞系永生化的方法。总体而言，这些方案为获取和保存患者来源的细胞以用于后续应用提供了可靠的工具。...

从肌肉活检中分离并永生化患者来源的细胞系用于疾病建模

本方案描述了一种从成年及老年个体的骨骼肌中分离和培养成肌细胞前体细胞的可靠、可重复且简便的方法。所使用的肌肉包括足部和腿部肌肉。该方法能够分离获得富集的原代成肌细胞群体，用于功能研究。...

成人及老年人大骨骼肌中肌源性前体细胞/原代成肌细胞的分离与培养

在此，我们介绍一种从成人肌肉组织中获取纯化人成肌细胞群体的方法。这些细胞可用于研究 体外 骨骼肌分化，特别是研究参与钙离子（Ca）相关过程的蛋白质2+...

人原代成肌细胞的分离、成肌分化评估及牵张激活钙内流检测

成肌细胞是能够增殖的前体细胞，可分化形成多核的肌管，并最终发育为骨骼肌肌纤维。本文介绍一种从小鼠成年早期骨骼肌中高效分离和培养原代成肌细胞的实验方案。该方法可用于在体外培养条件下对肌肉细胞进行分子、遗传和代谢方面的研究。...

从小鼠骨骼肌组织外植体中分离和分化原代成肌细胞

本方案描述了从小鼠单个骨骼肌中分离肌肉干细胞和纤维脂肪形成祖细胞的方法。该方案包括单块肌肉解剖、通过荧光激活细胞分选法分离干细胞、免疫荧光染色评估纯度，以及通过5-乙炔基-2′-脱氧尿苷掺入实验定量检测S期进入情况。...

从单个骨骼肌中分离静息态干细胞群体

本方案通过组织解离、连续过滤、预贴壁及特定培养条件，提供了一种从成年和新生小鼠骨骼肌中分离和富集原代成肌细胞的标准化方法，可用于建立和维持由卫星细胞衍生的成肌细胞培养体系，以支持后续实验应用。...

分离骨骼肌卫星细胞以 体外 肌生成研究

学习从骨骼肌活检组织分离、培养和表征人类肌肉祖细胞的方法，用于研究肌肉再生与细胞分化能力。该技术可追踪细胞增殖过程，为再生医学提供可靠的实验模型。

从骨骼肌活检手术中分离、培养、鉴定及诱导人肌肉前体细胞分化

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