从骨骼肌活检手术中分离、培养、鉴定及诱导人肌肉前体细胞分化

分离调控骨骼肌再生的人类肌肉前体细胞，可使我们在保留供体差异性的同时，研究再生过程背后的相关机制。该技术能够从小量组织中获得大量人类肌肉前体细胞，并利用少量细胞对其进行表型分析。该方法专为分离人类肌肉前体细胞而设计，用于追踪其增殖与分化能力，并将这些数据与骨骼肌再生过程相关联。

这种相对简单技术最难的部分在于确保每一步操作都具有可重复性，以优化细胞的得率和纯度。要成功分离细胞，需要完成多个步骤。其中一些步骤若通过直观观察会更容易理解。

为了从活检组织中分离人肌肉前体细胞，需在无菌条件下将肌肉组织放入无菌培养皿中，并使用无菌手术刀将组织切成一立方毫米大小的碎块。当所有组织均被切碎后，将组织块转移至含有10毫升磷酸盐缓冲液（PBS）的15毫升离心管中，静置使组织自然沉降，随后小心吸除上清液，避免扰动组织沉淀。按照上述方法再次洗涤组织碎片一次后，弃去PBS，加入10毫升低糖型杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco's modified Eagle medium）。

待组织沉淀后，移除上清液，并将组织块重悬于 3 毫升消化液中。将组织置于 37 摄氏度孵育 30 分钟，每隔 10 分钟用 1 毫升血清学移液管吹打肌肉碎片一次。孵育结束后，向样品中加入 83 微升额外的消化液和 24 微升 Dispase 溶液，并使用宽口移液管枪头每 5 至 10 分钟吹打组织一次，直至形成均匀的悬液。

均匀的悬液对于最大限度回收人类肌肉前体细胞至关重要。如果悬液无法通过标准的1,000微升移液器吸头，则需继续消化。为分离Pax7阳性细胞，应按照方案对细胞进行染色并设门。

使用配备100微米喷嘴、压力为20 psi的流式细胞仪，将CD56、CD29双阳性的人肌源性前体细胞分选至含有300微升荧光激活细胞分选缓冲液垫层的收集管中。随后，将分选后的人肌源性前体细胞以每平方厘米3.5 × 10⁴个细胞的浓度接种于包被有胶原的24孔板中，孔内预先加入已预热的生长培养基。为进行汇合度扫描，将培养板载入成像细胞仪，选择“创建新扫描”以及“板类别”、“板配置文件”和“板编号”。在“应用”下选择“汇合度”和“汇合度1”，并选择待观察的孔。

找到一个焦平面，使细胞相对于背景呈现白色，然后选择“手动注册”。使用鼠标选中所有需要扫描的孔，然后选择“开始扫描”。整个孔区域将自动进行扫描。

选择针对该培养板和细胞类型的最佳分析设置，然后选择“开始分析”。首先使用成像细胞仪测量汇合度。随后，为在成像细胞仪上进行细胞计数，将每孔中的培养基更换为 200 微升染色液。

在37摄氏度孵育15分钟后，将染色液更换为100微升新鲜的Ham's F12培养基。将培养板放回成像细胞仪，在“Application”（应用）中选择“Cell Viability and Live Dead Total”（细胞活力与活死细胞总数）。其中，“Live”（活细胞）通道将显示明场图像，“Dead”（死细胞）通道将显示碘化丙啶染色结果，而“Total”（总细胞）通道将显示Hoechst 33342染色结果。

在“对焦设置”中，点击“自动注册”。在“总计通道”下，将通道设置为蓝色。使用“查找对焦”使细胞核清晰对焦，并点击“设置偏移”以选择对焦位置。

在“Dead”通道下，将通道设置为红色，使用“Find Focus”功能使死细胞对焦。单击“Set Offset”以选定焦点，然后选择“Start Scan”开始扫描。随后选择适合该培养板和细胞类型的分析参数，并选择“Start Analysis”以开始分析。

分析完成后，需目视确认分析是否准确地计数了细胞。若扫描和分析结果满意，则将培养板放回培养箱；否则需重新扫描或调整分析参数。可通过首先根据侧向散射和前向散射面积对事件设门，以排除死细胞或碎片，再选择7-AAD阴性细胞（即活细胞），从而鉴定人肌肉前体细胞。

同时表达 CD56 和 CD29 细胞表面标志物的细胞即代表人类肌肉前体细胞群体。人类肌肉前体细胞也可通过其 Pax7 表达来鉴定。事实上，Pax7 在 FACS 分选后的总细胞群体中富集，并可在多次传代过程中维持表达。

此处展示了一次具有代表性的汇合度扫描结果。绿色轮廓由成像细胞仪生成，显示了成像细胞仪根据所选分析设置确定汇合度的方式。不同供体之间常表现出相似的异质性和细胞核计数。

发现并准确表征这种异质性是成像细胞仪的一项关键应用。然而，来自不同供体的融合度测量结果与细胞核计数高度相关。可通过胚胎型肌球蛋白重链的表达来区分由人肌肉前体细胞分化形成的肌管细胞。

在流式细胞仪上选择设门参数时保持一致性非常重要，以确保从每位供体中分离出相同的细胞群体。分离后的人肌肉前体细胞可用于多种用途，包括鉴定人肌肉前体细胞增殖与分化过程中独特的代谢需求。人肌肉前体细胞的分离使得研究人员能够区分人与小鼠肌肉前体细胞在细胞表面标志物表达上的差异。