Name: 亚克隆加插入（SPI） - 一种新型重组工程方法基因打靶载体的快速构建 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: 学习亚克隆加插入（SPI）方法，用于在大肠杆菌中快速构建基因打靶载体。该技术通过单次反应完成载体组装，显著提高转基因模型制备效率。

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T.R.R. 提出了研究构想，设计并实施了实验，并撰写了论文。E.J.K. 和 S.E.M. 参与了实验操作。所有作者均对最终论文的形成作出了学术贡献。本研究由莱斯特大学创新研究员项目资助 SEM，以及由英国医学研究理事会（MRC）高级研究员项目资助 S.M.C.（项目编号：MR/J009202/1）。DNA 测序由莱斯特大学核心生物技术服务中心的蛋白质与核酸实验室（PNACL）完成。我们感谢 A. Francis Stewart 提供了 Rox 和 Dre 质粒。pL451 和 pL452 质粒来源于美国弗雷德里克国家癌症研究所（NCI）。

1. 基因靶向设计
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>订购覆盖目标基因组区域的合适BAC克隆，并确保其与拟进行修饰的ES细胞类型具有同源性。 例如， 用于C57BL/6 ES细胞基因靶向的RPCI-23和RPCI-24 BAC克隆</li>
	<li>设计靶向载体时，应遵循常规的基因靶向设计原则。关键参数包括：明确修饰是否需要组成型或条件型，确定基因敲除策略中需删除的关键外显子（CE），以及内含子中插入盒的间距与位置安排。 
	注：上述各项已在其他地方进行了详细讨论10.</li>
	<li>选择目标修饰位点上下游各5-6 kb的基因组区域。 
	注意：亚克隆插入片段的大小通常为10–12 kb，但在使用p15A、pBR322等低拷贝亚克隆质粒时，上限可达80 kb，使用BAC载体时可高达200 kb。</li>
</ol>
2. 多重重组工程寡核苷酸
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>为质粒骨架（亚克隆质粒）和筛选标记（插入盒）设计引物。每条引物应包含180 bp的同源臂（HA），其侧翼为基因组靶位点，并包含20 bp的插入盒或亚克隆质粒特异性引物序列（图2）。 
	注意：同源臂中不应包含任何重复元件，重复元件的存在将导致错误的靶向和亚克隆。可使用基于网络的工具（如“Repeat Masker”）检测重复元件。</li>
	<li>在其中一个载体引物上引入一个独特的限制性内切酶（RE）位点，用于线性化基因靶向载体，以便进行胚胎干细胞（ES细胞）靶向（图2）。</li>
	<li>使用引物分析程序检查引物参数。注意避免引物区域形成二级结构。</li>
	<li>插入盒的较短同源臂（50 bp）可被接受，但重组子数量较低；需确保亚克隆质粒的同源臂始终较长（180 bp）。</li>
	<li>使用基于网络的工具（如“cloneDB”）确定特定BAC克隆中基因组DNA插入片段的方向。通过查看BAC文库构建中所用BAC质粒骨架图谱，确定OriS处的复制方向。 
	注意：对于所有常用BAC质粒，OriS通常与氯霉素（Chl）抗性标记的转录方向相反。</li>
	<li>在BAC克隆复制方向相反一侧的引物5’端添加两个末端硫代磷酸酯（PTO）键。在反向引物上添加5’磷酸化修饰（图2）。 
	注意：不对称硫代磷酸化的PCR盒经Red系统消化后可生成单链DNA（ssDNA）中间体，该中间体可启动复制叉的滞后链引物合成。 
	注意：保护滞后链的盒式结构可观察到最高的多重重组频率。在某些基因座，保护前导链或双链均受保护的盒式结构可能无法产生同等的重组效率。</li>
	<li>订购经PAGE或HPLC纯化的引物。</li>
</ol>
3. 使用 pSC101 BADgbaA 重组质粒转化 BAC 克隆。
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>为了制备 E. coli 携带BAC重组熟练的菌株，用含有Red基因的pSC101 BADgbaA质粒进行转化16. 
	注意：pSC101 BADgbaA 质粒包含受阿拉伯糖诱导型启动子调控的 Red 和 RecA 基因 araC-PBAD 启动子、四环素筛选标记和温度敏感型pSC101复制子。
	<ol>
		<li>用无菌移液器吸头刺入BAC琼脂培养基，接种至5.0 ml含12.5 μg/ml氨苄青霉素的pH 8.0溶菌肉汤（LB）中-1 Chl。37 °C 培养 5 小时&#160;以200 rpm振荡。</li>
		<li>冷却10%（v/v) 甘油溶液、微量离心管和电穿孔比色皿置于冰上。将制冷大容量离心机和微量离心机预冷至 4 °C&#160;.</li>
		<li>使用分光光度计测定培养物的光密度（OD），在600 nm处测量吸光度。当OD达到指定值时，制备电转感受态细胞（如下所述）。600 读数达到 0.3 至 0.8 时。</li>
		<li>在大型离心机中，将细胞于50 ml离心管内以1,216 x g离心&#160;4 °C下，5分钟，1000 × g离心&#160;.</li>
		<li>用1 ml预冷的10%甘油洗涤细胞，于17,949 x g离心沉淀细胞&#160;4 °C下，20秒内离心g&#160;总共进行3次洗涤步骤。</li>
		<li>将细胞重悬于50 μl含10%甘油的溶液中，并加入10–200 ng pSC101 BADgbaA重组工程质粒。用移液器反复吹打数次以获得单细胞悬液，随后将细胞转移至预冷的1 mm间隙电穿孔比色皿中。</li>
		<li>以1.8 kV、25 μF和200 Ω的参数对细胞进行电穿孔。 
		注意：请检查每种品牌电穿孔仪的正确设置。电穿孔的时间常数若小于4，表明存在盐类及其他杂质。</li>
		<li>立即用1 ml LB培养基重悬细胞，并将细胞转移至50 ml离心管中。</li>
		<li>在30 °C下培养BAC gbaA菌液2小时&#160;以200 rpm振荡。 
		注意：当细胞在 37 °C 下培养时，由于温度敏感型复制因子 RepE 失活，pSC101 BADgbaA 质粒会丢失。为维持重组功能，应于 30 °C 培养 gbaA 细胞。</li>
		<li>加入9 ml含有12.5 μg/ml-1 叶绿素和 4 μg/ml-1 向回收的 BAC gbaA 培养物中加入四环素（Tet）。将 BAC gbaA 培养物过夜培养&#160;30时&#160;200 rpm 振荡培养，温度为 °C。 
		注意：电穿孔转染超螺旋 gbaA 质粒的转化效率足够高，可支持过夜饱和培养&#160;在液体培养基中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 插入盒的制备与亚克隆质粒
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>为了将HA插入到插入盒和亚克隆质粒中，使用下述长链修饰的寡核苷酸引物进行聚合酶链式反应（PCR）。
	<ol>
		<li>可选：为防止质粒带入重组反应，可使用具有R6K复制起点或类似窄宿主范围的质粒模板来扩增插入片段。</li>
		<li>或者，使用限制性内切酶（RE）消化将质粒模板线性化（表2）。选择一种在PCR扩增区域之外进行切割且可热失活的限制性内切酶（RE）。按照制造商的建议对该限制性内切酶进行热失活处理。</li>
		<li>使用高保真热启动DNA聚合酶系统进行聚合酶链式反应（PCR）。按照以下说明配制PCR主混合液：表3）。按照所示条件进行热循环（表3).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。上样1-5 μl&#160;将每份PCR产物上样至含0.5 mg/ml溴化乙锭的1%（w/v）琼脂糖凝胶中-1 溴化乙锭 (EtBR) 
	注意：非特异性扩增产物的存在不会干扰重组工程反应。但在某些情况下，引物二聚体可能会降低重组工程效率。</li>
	<li>使用PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。
	<ol>
		<li>可选：用 DpnI 处理以去除 PCR 产物中的质粒模板，随后进行 PCR 纯化。按制造商建议，用最小体积的无菌去离子水洗脱 DNA。 
		注意：将 DpnI 加入未纯化的 PCR 反应体系会导致甲基化质粒 DNA 模板的切割效率降低。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过与已知DNA标准品进行琼脂糖凝胶分析，定量PCR扩增的DNA 例如，λ HindIII 消化或使用 Nanodrop 分光光度计。</li>
</ol>
5. 亚克隆加插入
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>将过夜培养的 gbaA BAC 菌液稀释 50 倍，加入 200 μl&#160;在10 ml LB+Chl+Tet中培养，30℃培养&#160;200 rpm 振荡，°C&#160;1小时50分钟。包括一个用作阴性对照的样本。</li>
	<li>将所有重组工程材料和设备冷却至 4 °C，具体操作如步骤 3.1.2 所述。</li>
	<li>倒入含有适当选择性抗生素的 LB 琼脂 pH 8 平板，抗生素浓度需正确，以确保既能筛选插入的 DNA 片段，又能筛选亚克隆载体表4). 
	注意：某些抗生素对 pH 敏感。通常使用 pH 8 的 LB 琼脂。</li>
	<li>配制10% (w/v)的L-阿拉伯糖溶液，使用0.2 μm针头滤器过滤除菌。 
	注意：阿拉伯糖可诱导来自 gbaA 质粒的重组工程蛋白的表达。</li>
	<li>使用分光光度计检测gbaA BAC菌液的OD值。当OD值达到指定数值时600 当达到 0.25–0.3 时，按照下一步所述诱导重组蛋白表达。</li>
	<li>加入 200 μl&#160;向10 ml BAC培养物中加入10%阿拉伯糖溶液，使阿拉伯糖的终浓度为0.2%。设置未诱导培养物（不加阿拉伯糖）作为阴性对照。</li>
	<li>将BAC菌液转移至37&#160;在37°C摇床培养箱中，以230 rpm转速振荡培养45分钟，诱导Red蛋白表达。 
	注意：在 30 °C 下，红色蛋白的表达效率较低&#160;.</li>
	<li>离心收集细胞，并按照步骤3.1.5所述，用10%甘油洗涤3次。</li>
	<li>向重组反应中加入600-1,000 ng的亚克隆质粒和插入盒（插入片段）各一份。设置仅含载体以及载体加单个插入片段的对照，以检测载体和插入盒的重组效率及完整性。</li>
	<li>通过移液吹打获得单细胞悬液。按照步骤3.1.7所述进行电穿孔，并在37 °C下于1 ml LB培养基中复苏1小时（适用于多拷贝质粒），或在37 °C下于10 ml LB培养基中复苏3小时&#160;用于BAC载体。</li>
	<li>接种不同稀释度的回收培养物 例如， 90%、10%、1% 的双选琼脂平板上，于 37 ℃ 培养&#160;°C 下孵育 16 小时。</li>
</ol>
6. 重组子分析
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>可选：挑取6至12个菌落，使用HA侧翼引物和插入片段特异性引物进行菌落PCR。设置亚克隆质粒、插入片段表达盒质粒以及亲本BAC克隆作为阴性对照。
	<ol>
		<li>对菌落PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。通过观察是否出现预期大小的明亮条带，鉴定阳性克隆。 
		注：SPI克隆技术具有高效率，通常可获得大多数正确的重组子。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将菌落接种至5 ml pH 8的LB培养基中（含选择性抗生素），在37 °C下过夜培养&#160;。&#160;</li>
	<li>按照制造商说明书，使用柱纯化试剂盒制备质粒DNA小量提取物（miniprep）。</li>
	<li>采用标准的酚-氯仿抽提法或类似方案，制备BAC质粒DNA小量提取物。</li>
	<li>对小量提取的DNA进行限制性内切酶（RE）消化，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段。分析限制性酶切图谱，筛选出具有预期片段大小的正确靶向载体克隆。选择一种能够清晰区分未插入载体与插入载体的限制性内切酶。</li>
	<li>可选：为了获得不含BAC的细胞（在重组工程操作后，BAC仍存在于E. coli中），可将小量提取的质粒DNA转化至DH5alpha或DH10B E. coli感受态细胞中。</li>
	<li>对HA标签和插入片段表达盒区域进行DNA测序，以检测寡核苷酸合成过程中可能存在的错误。</li>
</ol>

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T.R.R 是一项关于多重重组工程技术的英国专利申请的发明人。

历史上，构建胚胎干细胞系和小鼠模型通常采用包含修饰等位基因的质粒载体进行基因靶向4。然而，这些复杂的基因靶向载体的构建已被证明是此类模型及时制备过程中的一个显著瓶颈。基于重组工程（recombineering）的载体构建策略的发展，使得载体设计得到改进，组装效率也有所提高。尽管如此，现有的重组工程方案仍涉及多个步骤，需要中间质粒的纯化，并使用不同的细菌菌株。加插亚克隆（Subcloning plus insertion, SPI）提供了一种新颖的载体构建方法，可在BAC宿主菌株中通过一次电穿孔操作完成。本文在多种载体构建应用中测试了SPI在基因靶向中的实用性。在所有检测的情况下，SPI均表现出高效性，并成功产生了正确的重组质粒。在大多数情况下，多个不同的表达盒均被正确插入到靶向载体中。SPI方案能够轻松容纳大片段DNA表达盒和载体，展示了该系统的灵活性。
SPI 依赖于长同源序列以及线性 DNA � cassette 的磷硫酰化（PTO）保护。PTO 修饰可使线性 DNA 免受外切核酸酶降解20,21，而较长的同源臂（HA）可提高重组效率，从而实现多重化操作。然而，合成较长的寡核苷酸序列会增加累积错误（尤其是缺失突变）的概率。如果突变发生在蛋白质编码区，可能对功能造成严重影响。因此，强烈建议对同源臂及插入 cassette 的全长进行 DNA 测序，以排除携带任何序列变异的克隆。同时建议使用高保真 DNA 聚合酶体系，以避免引入 PCR 扩增错误。相对于插入 cassette 而言，亚克隆质粒的同源臂长度和组成更为关键（数据未显示）。对于构建基因敲入载体等特别敏感的应用，若不能容忍外显子区域的任何突变，可缩短插入 cassette 的同源臂长度（50–120 bp），以规避长寡核苷酸带来的问题。插入 cassette 也可保持未修饰状态，或进行双端磷硫酰化修饰（适用于复制方向未知的情况）。但在这些情况下，多重化操作仍需要使用带有长保护性同源臂的亚克隆质粒。该策略的一个局限性在于多重化效率的降低，可能会影响 SPI 克隆在不同位点的效率。
插入盒的长度以及亚克隆质粒的长度是SPI克隆中的另一个重要参数。较大的DNA分子电穿孔效率较低，且由于需要将所有插入盒导入同一个细胞，这种效应具有累积性（数据未显示）。多重化操作在使用较小的插入盒时效率最高。大于3 kb的DNA片段还会限制Red介导的单链DNA加工，而该过程在片段长度不超过3 kb时效率最高30。超过3 kb的插入盒会发生双端切除，并通过一种β蛋白非依赖途径进行重组，效率较低20。因此，在这些情况下，筛选足够数量的菌落以鉴定正确克隆变得尤为重要。电穿孔后延长重组时间也有助于在较难的SPI实验中提高正确克隆的回收概率。在SPI过程中，最多可同时插入四个较小的插入盒（&#60; 1.5 kb），但每增加一个插入盒，多重化效率就会下降（数据未显示）。然而，这反映的是理想SPI实验的结果，在使用多个较大插入盒时，应谨慎考虑多重化的极限。
像成簇规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）-Cas9 核酸酶系统等基因组编辑工具的发展，使得新型基因组修饰的构建成为可能，并推动了更高效的基因组工程36。然而，这些新兴技术目前是对基因靶向载体的补充，而非取代。预计 CRISPR-Cas 系统有望替代抗生素筛选，并进一步优化多重重组工程操作流程。

基因靶向技术的发展使得构建细胞系和小鼠模型以研究不同的生物系统成为可能1-3。对基因组序列进行修饰的关键第一步是设计和构建基因靶向载体4。靶向载体是质粒结构，携带含有预期修饰的目标等位基因，该等位基因两侧包含选择标记（例如&#160;neomycin）以及在哺乳动物细胞中实现高效同源重组所需的长基因组区域5。通过将靶向载体导入胚胎干细胞（ES细胞）6或体细胞7，可实现精确的基因修饰，此时靶向载体上的DNA序列与基因组位点之间的同源序列发生同源重组，从而通过基因转换将预期的修饰转移至基因组中8。这些经过修饰的ES细胞可被注射到小鼠囊胚中，产生嵌合体后代，后者可通过生殖系传递这些修饰后的等位基因9。另一种制备转基因小鼠的方法是将基因表达载体显微注射至单细胞小鼠受精卵中，导致载体随机整合到小鼠基因组中10。传统的载体构建方法依赖于使用限制性内切酶和DNA连接酶进行常规的“切割-粘贴”克隆，以将不同的选择标记和基因组片段克隆至载体骨架中。然而，传统克隆方法的一个固有局限性在于限制性酶切位点的位置和选择，尤其是在处理较长的DNA序列时。这通常需要进行多次亚克隆步骤，并且会向载体中引入额外的DNA序列，往往导致基因靶向效率降低。
重组工程（recombinogenic engineering）是一种DNA工程技术，通过利用噬菌体重组蛋白在E. coli细胞中介导的同源重组（HR）来克服上述限制11,12。由于同源序列的任何区域均可作为重组工程的底物，因此不再受限于限制性酶切位点的可用性。大段DNA序列可直接在体内无缝修饰，从而保持其结构完整性13。重组工程在短同源序列（50 bp）条件下效率很高14，因此同源臂（HA）可方便地整合到合成寡核苷酸序列中。在典型的重组工程实验中，将含有同源臂的寡核苷酸或双链DNA（dsDNA）片段通过电穿孔导入含有目标序列（位于染色体或质粒上）的重组工程感受态E. coli细胞中15。重组能力来源于噬菌体Red重组蛋白的可诱导表达16,17，或来源于rac前噬菌体的RecET蛋白18。Red/RecE外切核酸酶将线性dsDNA转化为单链DNA（ssDNA）中间体，随后由其伴侣蛋白Red/RecT（一种单链退火蛋白，SSAP）结合19。长ssDNA或短寡核苷酸与其复制叉滞后链上的互补靶序列退火，导致该序列整合至靶位点。滞后链ssDNA的重组是重组工程高效率的基础，可用“beta”重组模型加以描述20,21。
典型的基因靶向载体构建重组工程工作流程包含以下两种途径之一。一种途径是从小鼠BAC克隆中亚克隆目标基因组区域至质粒，随后依次插入LoxP重组位点、筛选标记22 等等，或者替代途径是通过多轮重组工程，利用不同的靶向载体元件靶向BAC基因组位点10,23 然后通过缺口修复克隆将修饰后的基因座亚克隆至质粒中24,25该方法的不同变体已被用于不同的高通量重组工程流水线中，作为大规模小鼠生产项目的一部分26,27然而，这些过程涉及复杂且耗时的步骤，需要使用专门的载体和 E. coli 菌株（例如， 表达Cre的细胞）并利用一个或多个中间步骤进行质粒DNA纯化和重新转化（表1）。亚克隆加插入（SPI）是一种新型的重组工程技术，将β重组与缺口修复克隆结合于单一过程之中（图1）。SPI载体组装简单、快速且灵活，相较于标准的重组工程方法具有显著改进表1在此，我们展示了使用SPI进行不同载体构建应用的简便性和实用性，尤其侧重于构建非标准且具有挑战性的载体设计。测试案例包括荧光报告基因敲入载体、双标签蛋白表达敲入载体、BAC荧光报告载体以及条件性基因敲除载体的构建。这些案例分别涉及细胞表面受体的定位、核蛋白复合物的纯化以及基因表达的条件性缺失等需求。

<table><tbody><tr><td>除 Zeocin 外的抗生素</td><td>Sigma: http://www.sigmaaldrich.com</td><td>氨苄青霉素（Ampicillin），A9518-5G；&lt;br/&gt; 氯霉素（Chloramphenicol），C1919-5G；杀稻瘟菌素（Blasticidin），15205-25MG；庆大霉素（Gentamicin），G1264-50MG；潮霉素（Hygromycin），H3274-50MG；卡那霉素（Kanamycin），K1876-1G；&lt;br/&gt; 盐酸四环素（Tetracycline hydrochloride），T7660-5G；甲氧苄啶（Trimethoprim），92131-1G</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Invivogen：&amp;nbsp;</td><td>ant-zn-1</td><td>Zeocin 也可从 Life technologies/Fisher 公司获得</td></tr><tr><td>C57BL/6 BAC 克隆</td><td>CHORI: https://bacpac.chori.org/&amp;nbsp;</td><td>RPCI-23 或 RPCI-24 BAC 文库</td><td>129/Sv BAC 克隆可从 Invivogen 或 Life technologies/Fisher 公司获得</td></tr><tr><td>KOD hotstart DNA 聚合酶系统</td><td>Millipore: https://www.merckmillipore.com</td><td>71086-3</td><td></td></tr><tr><td>L-阿拉伯糖（L-Arabinose）</td><td>Sigma: http://www.sigmaaldrich.com</td><td>A3256-25G</td><td></td></tr><tr><td>长链寡核苷酸（Long oligos）</td><td>IDT: https://www.idtdna.com；Gene Link: https://www.genelink.com</td><td>IDT Ultramers 或 Gene Link 长链寡核苷酸</td><td>PTO 和磷酸化修饰可作为定制选项。强烈推荐对长链寡核苷酸进行 PAGE 纯化。</td></tr><tr><td>MinElute PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen: http://www.qiagen.com&amp;nbsp;</td><td>28004</td><td>优先选用最小洗脱体积的 PCR 纯化试剂盒。</td></tr><tr><td>QIAPrep Spin Mini Prep 试剂盒</td><td>Qiagen: http://www.qiagen.com&amp;nbsp;</td><td>27104</td><td>推荐使用硅胶柱或类似基质的试剂盒。</td></tr><tr><td>限制性内切酶</td><td>NEB: https://www.neb.com</td><td>DpnI: R0176L</td><td>详见 NEB 官网提供的限制性内切酶列表。</td></tr></tbody></table>

亚克隆加插入（spi）——一种用于快速构建基因靶向载体的新型重组工程方法

Subcloning Plus Insertion (SPI) - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

基因靶向是指利用同源重组对特定基因位点进行精确修饰的技术。采用该方法构建新的细胞系和转基因小鼠模型，需要构建一种“靶向”载体，该载体包含与目标基因同源的DNA序列，而这一载体构建步骤多年来一直是该过程中的限制性环节。载体构建可通过一种称为重组工程（recombineering）的技术在Escherichia coli细胞内in vivo完成，该技术利用噬菌体重组酶介导的同源重组实现。重组工程是亚克隆长同源序列（>4 kb）以及多种靶向元件（包括筛选标记）的首选方法，这些元件对于靶向载体与其对应基因组位点之间高效发生等位交换至关重要。典型的重组工程操作流程采用逐步迭代的方式，依次整合靶向元件，并需要中间的纯化和转化步骤。本文中，我们介绍一种基于多重策略的新型重组工程载体构建方法。该方法通过同时从小鼠细菌人工染色体（BAC）文库中捕获基因组序列，并插入双细菌和哺乳动物筛选标记，实现质粒缺口修复。这种亚克隆加插入的方法效率极高，获得的重组子中大部分均为正确重组产物。我们展示了利用该方法构建的不同类型的条件性基因敲除或基因敲入载体，以及BAC报告载体的实验数据。SPI载体构建方法极大地拓展了重组工程工具箱的应用范围，为构建这些高度复杂的载体提供了一种简便、快速且成本效益高的方法。

基因靶向技术可用于产生带有基因敲除、基因敲入和标记等位基因的转基因小鼠。本文中，我们描述了一种在大肠杆菌（E. coli）中进行重组工程的改进方法，我们称之为“亚克隆加插入”法，该方法可用于快速构建定制的基因靶向载体。

亚克隆加插入（SPI）——一种用于快速构建基因靶向载体的新型重组工程方法

基因靶向是指利用同源重组对特定基因位点进行精确修饰的技术。该技术可用于构建新型细胞系和转基因生物……

以下实验的总体目标是通过亚克隆结合插入的方法构建基因靶向载体。该过程首先通过将含有重组质粒的载体转化至大肠杆菌中实现。第二步涉及通过聚合酶链式反应生成不对称磷酸化插入盒，并对亚克隆质粒进行扩增。加入阿拉伯糖后，GBAA 重组蛋白得以表达，末端修饰的插入盒和亚克隆质粒通过电穿孔导入。目标 DNA 序列同时从后端被捕获，并与插入盒一起整合到亚克隆质粒中。该技术相较于标准重组等现有方法的主要优势在于，基因靶向载体的构建可在单个反应中完成。首先设计用于插入盒和亚克隆质粒的引物，使每条引物包含位于基因组靶位点两侧的180个碱基对的同源臂，以及20个碱基对的特异性引物序列，用于插入盒或亚克隆质粒。接下来，使用基于网络的工具（如 Clone DB）确定反向克隆中基因组DNA插入片段的方向。通过查看反向克隆所用质粒骨架的图谱，确认从或ES的复制方向。文库构建时，在两端添加磷酸八聚体，使得位于复制方向反向的克隆片段寡核苷酸的5′端朝向相反。接下来，对反向寡核苷酸添加5′磷酸化修饰。首先用无菌移液器吸头刺入斜面琼脂培养物，接种至5.0毫升的ODINE肉汤培养基中。在37摄氏度、200 RPM振荡条件下培养菌液5小时。随后，将10%甘油溶液、微量离心管、电穿孔比色皿置于冰上预冷，同时将大容量冷冻离心机和微量离心机预冷至4摄氏度。培养结束后，使用分光光度计测定菌液的光密度。测定吸光度。在600纳米波长下进行。当OD 600读数达到0.3至0.8时，制备电转感受态细胞。当培养物准备就绪后，在50毫升离心管中离心收集细胞。用1毫升预冷的10%甘油洗涤细胞，再次离心。总共重复此洗涤步骤三次。将细胞重悬于总体积为50 µL的溶液中，并加入10至200 ng的重组质粒。通过反复吹打数次获得单细胞悬液，然后将细胞转移至预冷的电穿孔杯中。接着，将电穿孔杯放入电穿孔仪中进行电击操作，立即用1 mL LB培养基回收细胞，并将细胞转移至50 mL离心管中。将复苏的菌种在30摄氏度、200 RPM振荡条件下培养两小时。此后，向复苏的菌液中加入九毫升LB培养基。在30摄氏度、200 RPM振荡条件下过夜培养，以将同源臂插入至插入盒及亚克隆质粒中。使用先前制备的长修饰引物进行PCR。或者，使用限制性内切酶线性化质粒模板，选择一种在PCR扩增区域之外切割且可通过加热失活的酶。采用高保真热启动DNA聚合酶系统进行PCR反应体系的设置。按照最佳实验规范配制PCR预混液并进行热循环反应。反应结束后，通过AROS凝胶电泳分析PCR产物。将每份PCR产物取一至五微升上样到1% AROS凝胶中。接下来，使用PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。通过已知的DNA标准品或使用NanoDrop分光光度计对PCR扩增的DNA进行定量。过夜培养后，将GBAA回接培养物稀释50倍，并为阴性对照准备单独的培养物。将稀释后的培养物在30摄氏度、200转/分钟振荡条件下培养1小时50分钟。随后，将所有用于重组的材料和设备冷却至4摄氏度，操作方法如前所述。配制10%（重量/体积）的OSE溶液，并通过0.2微米针筒滤器过滤除菌。当扩增培养物的OD达到预期水平后，开始诱导重组蛋白表达。向10毫升扩增培养物中加入200微升10%阿拉伯糖溶液，使终浓度为0.2%。设置未诱导的培养物作为阴性对照。将培养物转移至37摄氏度摇床培养箱中，在230 RPM振荡条件下诱导红色蛋白表达45分钟。离心收集细胞，并用10%甘油洗涤3次，条件如前所述，为600至1000纳克。每个插入盒和亚克隆质粒在重组反应中均需包含一个仅含载体的对照以及载体加单插入片段的对照，以检测载体的重组效率和完整性。接下来，获得单细胞悬液，并按照之前所述方法对细胞进行电转操作。对于多拷贝质粒，在 LB 培养基中 37 摄氏度恢复培养 1 小时；对于空载体，则在 10 lb 培养基中 37 摄氏度恢复培养 3 小时。将恢复后的菌液进行不同稀释度的涂布，接种于双抗选择性琼脂平板上，并在 37 摄氏度培养 16 小时。准备就绪后，挑取菌落至含有选择性抗生素的5毫升LB培养基中，于37摄氏度过夜培养。接着，使用柱纯化试剂盒制备质粒小量提取DNA，加入相应限制性内切酶，然后通过凝胶电泳鉴定含有预期片段大小的克隆。最后，对同源臂和插入盒区域进行DNA测序，以检测是否存在寡核苷酸光合作用相关错误。在此示例中，对含有 P 二 RX 一 EYFP 插入片段的克隆进行限制性酶切分析，结果显示预期的条带模式，表明这些克隆中含有正确组装的敲入载体。该示意图说明了细菌人工染色体（BAC）修剪的概念。通过亚克隆及PCR产物的插入分析证实，表达盒已正确插入。此外，在加入适当的限制性内切酶后，对阳性反向克隆进行分析，获得了预期的酶切图谱。对12个所述R SR two SBI克隆进行限制性酶切分析，结果显示大多数重组子具有正确的载体组装。观看本视频后，您应能充分理解如何通过亚克隆结合插入的方法快速构建基因靶向载体。

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科研

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生物学

亚克隆加插入（SPI） - 一种新型重组工程方法基因打靶载体的快速构建

同源重组技术通过实现分子水平上精确突变的构建，极大地推动了黑腹果蝇（Drosophila）遗传学的发展。近年来，重组工程（recombineering）技术的应用使得研究人员能够操作大片段DNA并将其转化到黑腹果蝇（Drosophila）中6。本文所介绍的方法结合了这些技术，可快速构建大型同源重组载体。...

在Drosophila中利用重组工程构建同源重组载体

利用DNA组装技术，可在一次克隆反应中并行构建多个CRISPR载体，从而使大量CRISPR载体的构建变得简单。番茄毛状根是验证CRISPR载体和创制突变体材料的优良模型系统。...

高通量CRISPR载体构建及通过番茄毛状根生成对DNA修饰的表征

在此，我们报告一种基于RMCE的快速高效基因编辑方法 AAVS1 人类多能干细胞（hPSCs）的基因座，该系统较以往描述的系统有所改进。利用此技术，可快速、可靠地生成同基因型细胞系，从而开展恰当的比较研究，推动以转基因介导的科研工作 hPSCs.

通过AAVS1位点的重组酶介导的盒式交换快速高效地生成重组人多能干细胞

本实验方案旨在提供一份详细的分步指南，用于基于Golden...

使用模块化Golden Gate克隆技术快速组装多基因结构

本方案利用荧光报告基因和细胞分选技术，简化巨噬细胞和T细胞系中的基因敲入实验。这些简化的基因敲入实验使用两种质粒：一种是表达CRISPR/Cas9和DsRed2的质粒，另一种是表达EBFP2的同源重组供体质粒，后者可永久整合到免疫细胞的Rosa26位点。...

通过CRISPR/Cas9基因敲入及细胞分选在巨噬细胞和T细胞系中实现基因编辑

重组腺相关病毒（rAAV）被广泛用于临床和临床前基因递送。rAAV 一个尚未受到足够重视的用途是，无需纯化即可高效转导培养细胞。针对初次接触 rAAV...

使用未纯化重组腺相关病毒载体在培养细胞中进行转基因表达

本文介绍了一种通过在插入片段的3'端引入合适的限制性酶切位点，获得pVAX1-PRRSV表达载体的实验方案。我们可将载体线性化，并通过同源重组技术将DNA片段逐个连接至该载体。...

一种无缝克隆方法用于构建猪繁殖与呼吸综合征病毒表达载体

我们介绍一种高通量克隆方法——基于CRISPR的穿梭克隆（CRISPRshuttle...

基于CRISPR的穿梭克隆：一种高通量克隆方法

高架十字迷宫实验是测量小鼠焦虑样行为最常用的实验方法之一。本文展示了一段视频，详细演示了该实验的操作流程。...

小鼠高架十字迷宫

利用由fosmid携带的基因组DNA为Caenorhabditis...

利用带有galK可筛选标记的重组工程法构建秀丽隐杆线虫（C. elegans）转基因

学习亚克隆加插入（SPI）方法，用于在大肠杆菌中快速构建基因打靶载体。该技术通过单次反应完成载体组装，显著提高转基因模型制备效率。

亚克隆加插入（SPI）——一种用于快速构建基因靶向载体的新型重组工程方法

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