亚克隆加插入（SPI） - 一种新型重组工程方法基因打靶载体的快速构建

以下实验的总体目标是使用亚克隆加插入构建基因靶向载体。这是通过用重组质粒转化含有大肠杆菌的 Back 来实现的。第二步涉及生成不对称磷酸化插入盒，并通过聚合酶链反应生成亚克隆质粒。

添加阿拉伯糖后，表达 GBAA 重组蛋白，并对末端修饰的插入盒和亚克隆质粒进行电穿孔。所需的 DNA 序列同时从背面捕获，并用插入盒修饰到亚克隆质粒中。现有方法（如标准重组）的这种技术的主要优点是可以在单个反应中进行基因靶向载体构建。

首先，为插入盒和亚克隆质粒设计寡核苷酸，设计每个寡核苷酸，使其包含 180 个碱基对同源臂（位于基因组靶位点两侧）和 20 个碱基对，即插入盒或亚克隆质粒的特异性引发序列。接下来，使用基于 Web 的工具（如 clone db）确定反向克隆的基因组 DNA 插入片段的方向。通过检查背面使用的反向质粒骨架的映射，确定从 或 ES 的复制方向。

文库构建，添加两个末端磷酸化 8 键，使寡核苷酸的五个主要末端与反向克隆上的复制方向相反。接下来，向反向寡核苷酸中添加五引磷酸盐修饰。首先将无菌移液器吸头刺入背琼脂培养物中，并接种 5.0 毫升 odine 肉汤。

将培养物在 37 摄氏度下培养 5 小时，并以 200 RPM 振荡。接下来，冷却，10% 甘油溶液，微量离心机，试管和电穿孔，比色皿放在冰冷却器上，冷藏大型离心机和微量离心机至 4 摄氏度。孵育后，使用分光光度计测定培养物的光密度。

测量吸光度。在 600 纳米处。当 OD 600 读数达到 0.3 至 0.8 时，准备电感受态细胞。

培养物准备好后，在 50 毫升离心管中离心细胞。用 1 毫升冷冻的 10% 甘油洗涤细胞，然后再次旋转。执行这些洗涤步骤总共 3 次。

重悬细胞总体积为 50 μL，并添加 10 至 200 ng 重组质粒。通过上下吹打数次获得单细胞悬液，然后将细胞转移到预冷电穿孔中。Vete 的。接下来，将 vete 放入电穿孔装置中并电作细胞，立即在 1 毫升 LB 中回收细胞，并将细胞转移到 50 毫升离心管中。

在 30 摄氏度下培养 2 小时，以 200 RPM 摇动。在此之后，向回收的培养物中加入 9 毫升 LB。在 30 摄氏度下以 200 RPM 振荡生长过夜，以将同源臂掺入插入盒和亚克隆质粒中。

使用先前制备的长修饰寡核苷酸进行 PCR。或者，使用限制性内切酶将质粒模板线性化，选择一种在 PCR 扩增区域之外切割并被热激活的质粒模板。使用高保真热启动 DNA 聚合酶系统构建 PCR。

制备 PCR 预混液并根据最佳实践进行热循环。反应后，通过 AROS 凝胶电泳分析 PCR 产物。将 1 至 5 μL 的每种 PCR 加载到 1%aros 凝胶上。

接下来，使用 PCR 纯化试剂盒纯化 PCR 产物。根据一组已知的 DNA 标准品或使用 NanoDrop 分光光度计定量 PCR 扩增的 DNA。孵育过夜后，将反向 GBAA 培养物稀释 50 倍，并准备单独的培养物用于阴性对照。

30 摄氏度下以 200 RPM 振荡培养稀释的培养物 1 小时 50 分钟。接下来，如前所述，将所有重组材料和设备冷却至 4 摄氏度。制备每体积重量为 10% 的 OSE 溶液，并通过 0.2 微米注射器过滤器过滤消毒。

当反向培养物的 OD 达到所需水平时，继续诱导重组蛋白。将 200 微升 10%阿拉伯溶液添加到 10 毫升回培养物中，以达到 0.2% 的最终 aose 浓度包括未诱导的培养物作为阴性对照。将培养物转移到 37 摄氏度振荡培养箱中，并以 230 RPM 振荡诱导红色表达 45 分钟。

旋转细胞并用 10% 甘油洗涤 3 次，如前所述，浓度为 600 至 1000 ng。用于重组反应的每个插入盒和亚克隆质粒仅包括一个载体和载体加单个插入片段对照，以检查载体的重组熟练度和完整性。接下来，获得单细胞悬液并如前所述对细胞进行电作。

对于多拷贝质粒，允许在 37 摄氏度的 LB 培养基中回收 1 小时，对于反向载体，允许在 37 摄氏度下的 10 磅培养基中回收 3 小时。在双重选择中，使用回收的培养物完成不同的稀释。琼脂请在 37 摄氏度下生长 16 小时。

准备好后，将菌落挑取到 5 毫升含有选择性抗生素的 LB 中，并在 37 摄氏度下生长过夜。接下来，使用柱纯化试剂盒制备小量制备 DNA，引入适当的限制性内切酶，然后通过凝胶电泳鉴定含有预期片段大小的克隆。最后，对同源臂和插入盒进行 DNA 测序，以检查 oli 光合作用错误。

在这个例子中，含有克隆的 P two RX one EYFP 插入片段的限制性消化分析显示了预期的模式，表明它们包含正确组装的敲入载体。此示意图说明了 bact 修剪的概念。使用亚克隆加 PCR 产物插入分析证实了盒被正确掺入。

此外，当在添加适当的限制性内切酶后分析阳性反向克隆时，获得了预期的模式。对 12 个所述 R SR 两个 SBI 克隆的限制性酶切分析表明，在大多数重组体中具有正确的载体组装。观看此视频后，您应该对如何使用亚克隆加插入快速构建基因靶向载体有了很好的了解。