亚克隆加插入（SPI）——一种用于快速构建基因靶向载体的新型重组工程方法

以下实验的总体目标是通过亚克隆结合插入的方法构建基因靶向载体。该过程首先通过将含有重组质粒的载体转化至大肠杆菌中实现。第二步涉及通过聚合酶链式反应生成不对称磷酸化插入盒，并对亚克隆质粒进行扩增。

加入阿拉伯糖后，GBAA 重组蛋白得以表达，末端修饰的插入盒和亚克隆质粒通过电穿孔导入。目标 DNA 序列同时从后端被捕获，并与插入盒一起整合到亚克隆质粒中。该技术相较于标准重组等现有方法的主要优势在于，基因靶向载体的构建可在单个反应中完成。

首先设计用于插入盒和亚克隆质粒的引物，使每条引物包含位于基因组靶位点两侧的180个碱基对的同源臂，以及20个碱基对的特异性引物序列，用于插入盒或亚克隆质粒。接下来，使用基于网络的工具（如 Clone DB）确定反向克隆中基因组DNA插入片段的方向。通过查看反向克隆所用质粒骨架的图谱，确认从或ES的复制方向。

文库构建时，在两端添加磷酸八聚体，使得位于复制方向反向的克隆片段寡核苷酸的5′端朝向相反。接下来，对反向寡核苷酸添加5′磷酸化修饰。首先用无菌移液器吸头刺入斜面琼脂培养物，接种至5.0毫升的ODINE肉汤培养基中。

在37摄氏度、200 RPM振荡条件下培养菌液5小时。随后，将10%甘油溶液、微量离心管、电穿孔比色皿置于冰上预冷，同时将大容量冷冻离心机和微量离心机预冷至4摄氏度。培养结束后，使用分光光度计测定菌液的光密度。

测定吸光度。在600纳米波长下进行。当OD 600读数达到0.3至0.8时，制备电转感受态细胞。

当培养物准备就绪后，在50毫升离心管中离心收集细胞。用1毫升预冷的10%甘油洗涤细胞，再次离心。总共重复此洗涤步骤三次。

将细胞重悬于总体积为50 µL的溶液中，并加入10至200 ng的重组质粒。通过反复吹打数次获得单细胞悬液，然后将细胞转移至预冷的电穿孔杯中。接着，将电穿孔杯放入电穿孔仪中进行电击操作，立即用1 mL LB培养基回收细胞，并将细胞转移至50 mL离心管中。

将复苏的菌种在30摄氏度、200 RPM振荡条件下培养两小时。此后，向复苏的菌液中加入九毫升LB培养基。在30摄氏度、200 RPM振荡条件下过夜培养，以将同源臂插入至插入盒及亚克隆质粒中。

使用先前制备的长修饰引物进行PCR。或者，使用限制性内切酶线性化质粒模板，选择一种在PCR扩增区域之外切割且可通过加热失活的酶。采用高保真热启动DNA聚合酶系统进行PCR反应体系的设置。

按照最佳实验规范配制PCR预混液并进行热循环反应。反应结束后，通过AROS凝胶电泳分析PCR产物。将每份PCR产物取一至五微升上样到1% AROS凝胶中。

接下来，使用PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。通过已知的DNA标准品或使用NanoDrop分光光度计对PCR扩增的DNA进行定量。过夜培养后，将GBAA回接培养物稀释50倍，并为阴性对照准备单独的培养物。

将稀释后的培养物在30摄氏度、200转/分钟振荡条件下培养1小时50分钟。随后，将所有用于重组的材料和设备冷却至4摄氏度，操作方法如前所述。配制10%（重量/体积）的OSE溶液，并通过0.2微米针筒滤器过滤除菌。

当扩增培养物的OD达到预期水平后，开始诱导重组蛋白表达。向10毫升扩增培养物中加入200微升10%阿拉伯糖溶液，使终浓度为0.2%。设置未诱导的培养物作为阴性对照。将培养物转移至37摄氏度摇床培养箱中，在230 RPM振荡条件下诱导红色蛋白表达45分钟。

离心收集细胞，并用10%甘油洗涤3次，条件如前所述，为600至1000纳克。每个插入盒和亚克隆质粒在重组反应中均需包含一个仅含载体的对照以及载体加单插入片段的对照，以检测载体的重组效率和完整性。接下来，获得单细胞悬液，并按照之前所述方法对细胞进行电转操作。

对于多拷贝质粒，在 LB 培养基中 37 摄氏度恢复培养 1 小时；对于空载体，则在 10 lb 培养基中 37 摄氏度恢复培养 3 小时。将恢复后的菌液进行不同稀释度的涂布，接种于双抗选择性琼脂平板上，并在 37 摄氏度培养 16 小时。

准备就绪后，挑取菌落至含有选择性抗生素的5毫升LB培养基中，于37摄氏度过夜培养。接着，使用柱纯化试剂盒制备质粒小量提取DNA，加入相应限制性内切酶，然后通过凝胶电泳鉴定含有预期片段大小的克隆。最后，对同源臂和插入盒区域进行DNA测序，以检测是否存在寡核苷酸光合作用相关错误。

在此示例中，对含有 P 二 RX 一 EYFP 插入片段的克隆进行限制性酶切分析，结果显示预期的条带模式，表明这些克隆中含有正确组装的敲入载体。该示意图说明了细菌人工染色体（BAC）修剪的概念。通过亚克隆及PCR产物的插入分析证实，表达盒已正确插入。

此外，在加入适当的限制性内切酶后，对阳性反向克隆进行分析，获得了预期的酶切图谱。对12个所述R SR two SBI克隆进行限制性酶切分析，结果显示大多数重组子具有正确的载体组装。观看本视频后，您应能充分理解如何通过亚克隆结合插入的方法快速构建基因靶向载体。