Name: T细胞受体删除环同时定量（TRECs）和K-删除重组删除环（KRECs）通过实时PCR (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: 学习通过实时PCR同时定量T细胞受体删除环和K-删除重组删除环的方法，用于评估胸腺和骨髓输出功能。该技术适用于免疫学研究和儿科样本分析。

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作者无致谢。

<ol><li>Douek, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+thymic+function+with+age+and+during+the+treatment+of+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection.</a> Nature. 396 (6712), 690-695 (1998).</li>
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<li>Fronkova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+reconstitution+after+allogeneic+SCT+impairs+minimal+residual+disease+monitoring+in+children+with+ALL%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">B-cell reconstitution after allogeneic SCT impairs minimal residual disease monitoring in children with ALL.</a> Bone Marrow Transplant. 42 (3), 187-196 (2008).</li>
<li>Sottini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantification+of+recent+thymic+T-cell+and+bone+marrow+B-cell+emigrants+in+patients+with+primary+immunodeficiency+undergone+to+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantification of recent thymic T-cell and bone marrow B-cell emigrants in patients with primary immunodeficiency undergone to stem cell transplantation.</a> Clin. Immunol. 136 (2), 217-227 (2010).</li>
<li>Serana, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+and+bone+marrow+output+in+patients+with+common+variable+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic and bone marrow output in patients with common variable immunodeficiency.</a> J. Clin. Immunol. 31 (4), 540-549 (2011).</li>
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<li>Zanotti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+accumulation+of+newly+produced+T+and+B+lymphocytes+in+natalizumab-treated+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Peripheral accumulation of newly produced T and B lymphocytes in natalizumab-treated multiple sclerosis patients.</a> Clin. Immunol. 145 (1), 19-26 (2012).</li>
<li>Sottini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-existing+T-+and+B-cell+defects+in+one+progressive+multifocal+leukoencephalopathy+patient%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pre-existing T- and B-cell defects in one progressive multifocal leukoencephalopathy patient.</a> PLoS One. 7, e34493(2012).</li>
<li>Quiros-Roldan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+combined+antiretroviral+therapy+on+B-+and+T-cell+release+from+production+sites+in+long-term+treated+HIV-1%2B+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Effects of combined antiretroviral therapy on B- and T-cell release from production sites in long-term treated HIV-1+ patients.</a> J. Transl. Med. 10, 94(2012).</li>
<li>Mensen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+TREC+and+KREC+quantification+for+the+monitoring+of+early+T-+and+B-cell+neogenesis+in+adult+patients+after+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Utilization of TREC and KREC quantification for the monitoring of early T- and B-cell neogenesis in adult patients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.</a> J. Transl. Med. 11, 188(2013).</li>
<li>Serana, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+different+extent+of+B+and+T+cell+immune+reconstitution+after+hematopoietic+stem+cell+transplantation+and+enzyme+replacement+therapies+in+SCID+patients+with+adenosine+deaminase+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The different extent of B and T cell immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplantation and enzyme replacement therapies in SCID patients with adenosine deaminase deficiency.</a> J. Immunol. 185 (12), 7713-7722 (2010).</li>
<li>Borte, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+screening+for+severe+primary+immunodeficiency+diseases+using+high-throughput+triplex+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Neonatal screening for severe primary immunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR.</a> Blood. 119 (11), 2552-2555 (2012).</li>
<li>Baker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementing+routine+testing+for+severe+combined+immunodeficiency+within+Wisconsin%27s+newborn+screening+program%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Health+Rep%22%5BJournal%5D)">Implementing routine testing for severe combined immunodeficiency within Wisconsin's newborn screening program.</a> Public Health Rep. 125 (2), 88-95 (2010).</li>
<li>Lorenzi, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+thymic+function+directly+from+peripheral+blood%3A+a+validated+modification+to+an+established+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Determination of thymic function directly from peripheral blood: a validated modification to an established method.</a> J. Immunol. Meth. 339 (2), 185-194 (2008).</li>
<li>De Boer, R. J., Perelson, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+T+lymphocyte+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Theor.+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantifying T lymphocyte turnover.</a> J. Theor. Biol. 327, 45-87 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

TREC 和 KREC 的定量可作为评估近期胸腺和骨髓输出功能的良好指标，但需考虑一些注意事项。尽管采用标准曲线的绝对定量方法需要更多的试剂以及占用更多的实时 PCR 反应板空间，但由于未知样本的量是通过已知起始量构建的标准曲线进行插值计算，因此该方法能够确保高度准确的定量结果。此外，该方法更适用于检测低丰度的目标分子。从方法学角度来看，一个关键问题是对应标准曲线各点的冻存质粒稀释液可能比预期更快降解。因此，每次实验前都需要从最初保存的质粒重新制备新的稀释液，尤其是最高稀释度的样本。在最终计算中，以淋巴细胞加单核细胞计数来估算外周血单个核细胞（PBMC）数量时，若存在不完全等效的情况，可能会在每 106 个细胞与每毫升血液之间的数值换算中引入一定偏差。可通过直接从全血提取的已知量 DNA 中测定两个目标物（TRECs 和 KRECs）的量来改进该方法，从而无需进行单核细胞与淋巴细胞计数14。在此特定情况下，严格来说无需使用参考基因进行定量，但可将其作为 DNA 质量和数量的额外质控指标。
结果解读可能受到一些因素的影响。首先，应考虑到参考...

T细胞受体切除环（TRECs）和κ基因删除重组切除环（KRECs）是分别在部分T细胞和B细胞中，于基因组DNA重组过程中被切除的小型环状DNA片段，该过程导致T细胞和B细胞受体高度多样化的库的形成。这些环状DNA无明确功能，但由于其结构稳定且无法复制，每次细胞分裂后会被稀释，仅保留在两个子代细胞中的一个。因此，外周血中TRECs和KRECs的水平可作为胸腺和骨髓输出功能的评估指标。
尽管TREC检测在过去15年中已广泛用于评估胸腺输出水平1，而KREC检测最初是为测量B细胞增殖及其在健康和疾病状态下对B细胞稳态的贡献而开发的2，但直到最近才被提议作为骨髓输出的标志物3,4。本文中，我们描述了所建立的用于同时定量TREC和KREC的方法4。
通过这种联合方法，使用含有TREC、KREC和T细胞受体α恒定区（TCRAC）基因片段的三插入质粒，以1:1:1的比例稀释制备单一标准曲线，从而消除了实时PCR法DNA定量相关的变异性。这使得对TREC和KREC拷贝数的评估更加准确。此外，在同一反应中同时定量两个靶标还可降低试剂成本。
所提出的TREC/KREC检测可用于测量患有严重联合免疫缺陷（SCID）4、常见变异型免疫缺陷5、自身免疫性疾病6-8以及HIV感染9的儿童或成人中T细胞和B细胞新生的程度。此外，该检测还可用于监测造血干细胞移植10、酶替代治疗11以及抗病毒9或免疫调节治疗6-8后的免疫系统重建情况。最后，由于无论潜在的遗传缺陷如何，均可通过TREC检测识别SCID患者，而无丙种球蛋白血症患者可通过KREC定量检测被发现，因此TREC/KREC检测也可用于新生儿筛查项目中免疫缺陷病的检出12。在此情况下，检测必须在从滤纸上采集并干燥的微量血斑中提取的DNA上进行，且必须对目标疾病具有高灵敏度和特异性，同时具备高度可重复性和成本效益。
在检测中引入KREC定量分析应能提高对免疫缺陷病进行新生儿筛查的性能。自2008年威斯康星州率先在其产后筛查项目中开展TREC分析以来，这项筛查已在美国部分地区（WI、MA、CA）常规实施。13

<table><tbody><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma Aldrich SRL</td><td>10771-500 ML</td><td>密度梯度分离法</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Blood Mini Kit (250)</td><td>QIAGEN</td><td>51106</td><td>DNA 提取</td></tr><tr><td>未修饰 DNA 寡核苷酸 HPSF 0.01 mmol</td><td>Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l&amp;nbsp;</td><td></td><td>将冻干产物重悬至 100 pmol/&amp;micro;l</td></tr><tr><td>AmpliTaq DNA 聚合酶：包含 10x Buffer II 和 25 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Applied Biosystems/Life-Technologies</td><td>N8080156</td><td></td></tr><tr><td>GeneAmp dNTP 混合液 (100 mM)</td><td>Applied Biosystems/Life-Technologies</td><td>N8080261</td><td></td></tr><tr><td>用于亚克隆的 TOPO TA 克隆试剂盒</td><td>Invitrogen/Life-Technologies</td><td>K4500-01</td><td></td></tr><tr><td>XL1-Blue 亚克隆级感受态细胞</td><td>Stratagene</td><td>200130</td><td></td></tr><tr><td>PureYield 质粒小量提取系统</td><td>Promega</td><td>A1223</td><td></td></tr><tr><td>SpeI 500U</td><td>New England Biolabs</td><td>R0133S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII-HF 10,000 U</td><td>New England Biolabs</td><td>R3104S</td><td></td></tr><tr><td>PureYield 质粒中量提取系统</td><td>Promega</td><td>A2492</td><td></td></tr><tr><td>XhoI 5,000 U</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>TRIS Utrapure</td><td>Sigma Aldrich SRL</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich SRL</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>TE 缓冲液 (1 mM TRIS 和 0.1 mM EDTA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR 主混合液</td><td>Applied Biosystems/Life-Technologies</td><td>4364338</td><td></td></tr><tr><td>双标记探针 HPLC 0.01 mmol</td><td>Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l&amp;nbsp;</td><td></td><td>将冻干产物重悬至 100 pmol/&amp;micro;l</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c 分光光度计</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems 2720 热循环仪</td><td>Applied Biosystems/Life-Technologies</td><td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>Fast 7500 实时荧光定量 PCR 系统</td><td>Applied Biosystems/Life-Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS 序列检测软件 1.4</td><td>Applied Biosystems/Life-Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

通过实时pcr同时定量t细胞受体切除环（trecs）和κ删除重组切除环（krecs）

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

T细胞受体切除环（TRECs）和κ删除重组切除环（KRECs）是在T细胞和B细胞受体形成过程中，通过基因重排产生的环状DNA片段。由于TRECs和KRECs无法自我复制，每次细胞分裂后其数量都会被稀释，因此它们在细胞中持续存在。外周血中TRECs和KRECs的数量可作为胸腺和骨髓输出功能的评估指标。通过将已建立并广泛应用的TREC检测方法与改良版KREC检测方法相结合，我们开发了一种双重定量实时PCR技术，可在单次检测中同时定量新生成的T淋巴细胞和B淋巴细胞。TREC和KREC的数量通过标准曲线获得，该标准曲线由含有TREC和KREC信号连接区的细菌质粒进行系列稀释制备，同时包含一段T细胞受体α链恒定区基因片段作为参考基因。结果以每106个细胞或每毫升血液中TREC和KREC的数量表示。这些DNA片段的定量检测已被证实可用于监测儿童和成人造血干细胞移植后的免疫重建过程，有助于更准确地表征免疫缺陷疾病，或更深入地理解某些免疫调节药物的作用机制。

在87名健康对照者（42名0至17岁儿童（男性/女性：25/17）和45名24至60岁成人（男性/女性：29/16））的代表性样本中进行了检测。结果以每106个PBMC中的TREC和KREC数量表示，随后计算出每毫升血液中的TREC和KREC数量。
由于胸腺退化，TREC 的数量随年龄增长而减少4，特别是在0至3-4岁期间急剧下降。在成人中，TREC 数量还与性别有关，因其在男性中的下降速度比女性更快5。这可能在设定适当的参考范围时带来问题，若需对正常值进行非常精确的估计，则应根据年龄并可能结合性别进行区分。
<img alt="TREC 水平与年龄的关系，散点图 A-D，显示细胞和体积 TREC 下降的数据分析。" src="/files/ftp_upload/52184/52184fig3display.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" d...

本文介绍了一种同时定量T细胞受体切除环（TRECs）和κ删除重组切除环（KRECs）的方法。TREC/KREC检测可作为胸腺和骨髓输出功能的标志物。

通过实时PCR同时定量T细胞受体切除环（TRECs）和κ删除重组切除环（KRECs）

T细胞受体切除环（TRECs）和K基因删除重组切除环（KRECs）是在重组过程中形成的环状DNA元件……

本实验的总体目标是通过在单次检测中定量T细胞受体切除环（T-cell receptor excision circles，TRECs）和K基因删除重组切除环（K-deleting recombination excision circles，KRECs），来评估胸腺和骨髓的输出功能。首先构建一种三重插入质粒，其中包含TREC序列、KREC序列以及单拷贝参考基因的DNA片段，以确保在DNA扩增后三种目标序列之间保持1:1:1的比例。随后，通过对该三重插入质粒进行系列稀释，建立标准曲线，从而利用实时定量PCR实现对三种目标序列的绝对定量。最后，进行实时荧光定量PCR检测，以实现对TREC和KREC的绝对定量。所报告的结果展示了健康儿童和成人中胸腺及骨髓输出功能随年龄和性别的变化情况。当我们需要分析新生儿或婴儿的骨髓和胸腺输出功能时，首次提出了该方法的想法，考虑到与成人相比，通常采集的血液量非常有限。因此，我们决定将轨迹分析与校正定量的两种方法结合为一种单一检测，以优化样品制备和试剂成本。该技术的应用可拓展至原发性和获得性免疫缺陷的诊断，也可用于研究涉及TMB细胞丢失的各种疾病，以及骨髓移植后免疫系统的重建过程。该方法有助于深入理解人类疾病，还可广泛应用于基础研究，尤其是涉及淋巴细胞稳态的研究。该方法的主要优势在于采用三重插入策略，仅需使用一条标准曲线即可完成检测，从而降低实验变异性。通常，初次接触该方法的研究人员可能会因三重插入质粒制备过程较为繁琐，或因标准曲线制备相关问题而遇到困难。首先，获取含有极可能携带TRX及可通过PCR检测到的裂解片段的细胞样本，例如采用标准密度梯度分离法分离的健康年轻受试者外周血，样本应使用EDTA抗凝管采集。根据文本方案从细胞中提取DNA后，分离外周血单个核细胞，使用特异性针对TRX REX和TCR alpha恒定区基因的引物扩增Rex信号片段、Rex信号连接片段以及TCR alpha恒定区基因片段。将Trax信号连接片段的PCR产物插入PCR 2.1 topo载体的TA受体位点中，并通过热激法将质粒DNA转化至XL1-blue感受态细胞，筛选失去β-半乳糖苷酶互补功能的氨苄青霉素抗性白色菌落，转移至新的主培养皿中，并利用PCR鉴定含有trek片段的阳性菌落。挑取一个trek阳性菌落后进行培养并提取DNA，使用SP1酶切质粒及TCR alpha恒定区基因的扩增产物，将TCR alpha恒定区基因片段连接入质粒中。重复转化、菌落筛选与扩增以及DNA提取步骤，以插入正确的片段；使用HindIII而非SP1来消化质粒和正确的PCR片段，并重复连接与DNA提取过程。在确认三个插入片段的序列正确后，扩增菌落并按照文本所述方案通过MIDI试剂盒纯化质粒DNA，用于制备标准曲线。在计算出质粒的质量与浓度后（如图所示），解冻一份质粒样品，并用该线性

simultaneous-quantification-t-cell-receptor-excision-circles-trecs-k

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科研

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免疫学与感染

T细胞受体删除环同时定量（TRECs）和K-删除重组删除环（KRECs）通过实时PCR

蛋白质在质膜内或细胞内特定位置的区室化分布是一种重要的调控机制，可显著影响信号转导的结果；因此，要理解信号转导过程，研究相关蛋白质在空间和时间上的动态行为至关重要。本文介绍了一种基于全内反射荧光（TIRF）显微镜的系统，用于研究T细胞中的信号转导，该系统也具有广泛的适用性。...

一种用于实时同步成像T细胞受体及其相关信号蛋白的TIRF显微镜技术

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利用损伤特异性分子信标对细胞裂解液中碱基切除修复活性进行定量实时分析

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