T细胞受体删除环同时定量（TRECs）和K-删除重组删除环（KRECs）通过实时PCR

以下实验的总体目标是通过在单次测定中量化 T 细胞受体切除环或 REX 和 K 删除重组切除环或校正来估计胸腺和骨髓输出量。这是通过首先构建一个包含 TRX 校正 DNA 序列片段和单拷贝参考基因片段的三插入质粒来实现的，以便在 DNA 扩增后保持三个靶标之间的 1 比 1 比例。接下来，通过对三插入质粒进行连续稀释来构建标准曲线，这允许通过实时 PCR 对三个靶序列进行绝对定量。

最后，运行实时 PCR 检测，从而对 tres 和裂纹进行绝对定量。报告的结果显示健康儿童和成人胸腺和骨髓输出量随年龄和性别的变化。当我们需要分析新生儿或婴儿的骨髓和胸腺输出量时，考虑到与成人相比，通常抽取的血液量很少，我们首先想到了这种方法。

因此，我们决定将 track 和 correct 定量两种方法合并到一次分析中，以优化样品制备和试剂成本。该技术的含义延伸到原发性和获得性免疫缺陷的诊断，但该方法也可用于涉及 TMB 细胞丢失的所有疾病，以及研究骨髓移植后的新重建通过这种方法可以深入了解人类疾病。它也可以应用于主要涉及淋巴细胞稳态的基础研究。

其主要优点是采用三重剩余中，只需要一次标准固化，从而减少了实验的可变性。通常，由于三插入质粒制备所需的漫长程序或与标准曲线制备相关的问题，这种方法的新手可能会感到困难。首先获取含有极有可能具有 TRX 和可通过 PCR 检测到的裂缝的细胞的样品，例如使用标准密度梯度分离方法收集到 EDTA 管中的年轻健康受试者的外周血。

根据文本方案从细胞中提取 DNA 后分离外周血单核细胞，使用引物特异性 Fort TRX REX 和 TCR α 常数基因扩增 Rex 信号，联合 Rex 信号关节和 TCR α 常数基因片段。将 Trax 信号接头的 PCR 产物插入 PCR 2.1 拓扑载体的 TA 受体位点，并使用质粒 DNA 通过热休克转化 XL one 蓝色化学感受态细胞，分离出失去 β 乳糖酶互补的氨苄青霉素抗性白色菌落到新的主培养皿上，并使用 PCR 鉴定含有 trek 片段的菌落。在培养一个 trek 阳性菌落并分离 DNA 后，使用 SP one 消化质粒和 TCR α 恒定基因扩增产物，并将 TCR α 恒定基因片段连接到质粒中。

重复转化、菌落选择和扩增以及 DNA 分离以插入正确的片段，使用后 3 而不是 SP 1 消化质粒和正确的 PCR 片段，并重复该过程以连接和分离 DNA。一旦验证了三个插入片段的序列，扩增菌落并根据文本方案通过 MIDI 制备纯化质粒 DNA，以制备标准曲线。如此处所示，在计算质粒的质量和浓度后，解冻质粒的等分试样，然后显示 1 以用线性化的 DNA 等分试样线性化 2 微克。

使用公式 C 一 V 一等于 C 二 V 二。要计算制备系列的第一个标准曲线点所需的稀释体积（如下所示），请准备一系列 1 至 10 次稀释液，以获得剩余的标准曲线点。将质粒稀释液储存在负 80 摄氏度直至使用为了准备用于实时 PCR 的样品 为了准备用于实时 PCR 的样品，请安排一个 PCR 板，该板包括每个样品的至少两个重复，按以下方式使用两个单独的管，一个用于 Rex 和裂纹，另一个用于 TCR α 常数。

为所需的孔总数准备预混液。向板的孔中加入 20 微升。接下来，加入从外周血单核细胞或 P BMC 中提取的 5 微升基因组 DNA。

在使用光学胶盖密封反应板之前，向无模板对照孔中加入 5 微升水。然后解冻质粒 DNA 标准曲线稀释液并制备最高稀释液。仅发现位于 A 行到 H 行以及第 1 列到第 4 列之间的孔。

短暂涡旋后，将每个稀释点 5 μL 加入至指定点。确保孔底部没有气泡，并且试剂沉淀在底部。使用实时 PCR 系统按照以下方案运行检测。

50 摄氏度 2 分钟，在 95 摄氏度下初始加热 10 分钟，然后在 95 摄氏度下进行 45 次变性循环 15 秒。和一个 组合引物探针 e 跪着 并在 60 摄氏度伸长一分钟。要分析实时 PCR 数据，请在软件中打开保存的结果文件，然后单击窗口顶部的结果选项卡。

单击 analysis 菜单并选择 analysis settings。让软件通过选择所有探测器和自动 CT 作为阈值循环来自动确定阈值。默认情况下，让软件设置背景消除的自动基线。

单击名为 Amplification plot 的选项卡，然后在窗口的最右侧，在相应的下拉菜单中选择三个检测器之一。在选择手动 CT 的正下方，在窗口下部手动设置阈值，选择与所选检测器的标准曲线稀释点相对应的孔，通过在表格的相应单元格上单击并拖动鼠标来显示扩增曲线。要手动调整阈值，请上下拖动红色阈值线，然后单击 analyze（分析）以重新分析结果。

要检查设置阈值如何影响结果，请选择报告选项卡并查看相应标准曲线稀释点的结果 CT。当移动阈值以在 Amplification plot（扩增图）选项卡中获得最佳位置时，请验证阈值是否位于指数扩增区域，该区域足够高于背景噪声，但低于平台期。如果扩增图未以对数刻度显示，请右键单击该图以调用图形设置，并将运行后 Y ais 设置设置为 log。

将阈值设置在图的线性部分的中间，并观察彼此大致平行的扩增曲线。单击报告选项卡以查看 CT 结果。确保阈值放置产生的结果使每条标准曲线的两个重复的精度最大化。

稀释点。检查阈值是否放置在最能反映报告选项卡下标准曲线稀释点的极端数量级的点。在窗口下部的表格中再次拖动鼠标，以选择与标准曲线孔相对应的细胞对于所有检测器，验证三个目标的结果 CT 在相同的稀释点上是否非常相似。

例如，差异，不超过 0.5 CT 根据需要重新调整阈值，并在窗口下部的报告选项卡下重新检查。选择 NTC 孔并检查 NTC 孔中是否存在扩增，这对应于 CT 未确定。选择标准曲线选项卡，在绘图窗口右侧，从下拉菜单中选择检测器，查看报告的标准曲线斜率是否在负 3.55 和负 3.32 之间，这对应于 91% 至 100% 的 PCR 效率通过检查其值略低于斜率并截距，确保决定系数或 R 平方高于 0.998。

单击报告选项卡，然后在图表下方表格的相应单元格中，验证阳性对照的 CT 是否与同一已知阳性对照的先前检测结果一致。单击文件菜单，保存，然后导出为 CSV 文件，以将所有孔的数量导出为包含逗号分隔值的文本文件。最后，将 CSV 文件导入电子表格软件中，并通过适当设置以下公式来计算每 10 个轨道数或校正数到 6 个 PBM。

本视频中描述的分析是在 87 个健康对照的代表性样本上进行的。42 名 0 至 17 岁的儿童和 45 名 24 至 60 岁的成年人。如图所示，由于成人胸腺退化从 0 到 3 到 4 岁，徒步旅行的次数随着年龄的增长而急剧减少。

trek 编号还取决于性别，因为男性的 trek 编号下降速度比女性快，这可能会影响设置适当参考范围的能力。这些图表显示，然而，裂纹的数量随着年龄的增长而减少，类似于仅在儿童中观察到的 T TREX 模式。而在成人中，骨髓输出量在一生中相当稳定，不取决于性别。

三合插入质粒制备大约需要两到三周，但此后，储存的质粒分配将持续三年。如果执行得当，该技术的其余部分可以在四到五个小时内完成。在尝试此过程时，在专用区域进行所有质粒相关作以避免 DNA 交叉污染非常重要。

分析结果时验证标准管的稳定性也很重要 开发后。这项技术为临床免疫学或血液学领域的研究人员提供了一种改进的工具，用于识别原发性免疫缺陷，以监测骨髓移植后免疫重建的结果，或简单地研究淋巴细胞稳态。观看本视频后，您应该对如何获得质粒的三联体、准备标准曲线、运行实时 PCR 实验以及进行必要的计算，以获得可重现的 trax 和裂纹绝对定量结果。