Name: T细胞受体删除环同时定量（TRECs）和K-删除重组删除环（KRECs）通过实时PCR (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: 学习通过实时PCR同时定量T细胞受体删除环和K-删除重组删除环的方法，用于评估胸腺和骨髓输出功能。该技术适用于免疫学研究和儿科样本分析。

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作者无致谢。

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<li>Zanotti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+accumulation+of+newly+produced+T+and+B+lymphocytes+in+natalizumab-treated+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Peripheral accumulation of newly produced T and B lymphocytes in natalizumab-treated multiple sclerosis patients.</a> Clin. Immunol. 145 (1), 19-26 (2012).</li>
<li>Sottini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-existing+T-+and+B-cell+defects+in+one+progressive+multifocal+leukoencephalopathy+patient%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pre-existing T- and B-cell defects in one progressive multifocal leukoencephalopathy patient.</a> PLoS One. 7, e34493(2012).</li>
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<li>Mensen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+TREC+and+KREC+quantification+for+the+monitoring+of+early+T-+and+B-cell+neogenesis+in+adult+patients+after+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Utilization of TREC and KREC quantification for the monitoring of early T- and B-cell neogenesis in adult patients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.</a> J. Transl. Med. 11, 188(2013).</li>
<li>Serana, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+different+extent+of+B+and+T+cell+immune+reconstitution+after+hematopoietic+stem+cell+transplantation+and+enzyme+replacement+therapies+in+SCID+patients+with+adenosine+deaminase+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The different extent of B and T cell immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplantation and enzyme replacement therapies in SCID patients with adenosine deaminase deficiency.</a> J. Immunol. 185 (12), 7713-7722 (2010).</li>
<li>Borte, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+screening+for+severe+primary+immunodeficiency+diseases+using+high-throughput+triplex+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Neonatal screening for severe primary immunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR.</a> Blood. 119 (11), 2552-2555 (2012).</li>
<li>Baker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementing+routine+testing+for+severe+combined+immunodeficiency+within+Wisconsin%27s+newborn+screening+program%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Health+Rep%22%5BJournal%5D)">Implementing routine testing for severe combined immunodeficiency within Wisconsin's newborn screening program.</a> Public Health Rep. 125 (2), 88-95 (2010).</li>
<li>Lorenzi, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+thymic+function+directly+from+peripheral+blood%3A+a+validated+modification+to+an+established+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Determination of thymic function directly from peripheral blood: a validated modification to an established method.</a> J. Immunol. Meth. 339 (2), 185-194 (2008).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

TREC 和 KREC 的定量可作为评估近期胸腺和骨髓输出功能的良好指标，但需考虑一些注意事项。尽管采用标准曲线的绝对定量方法需要更多的试剂以及占用更多的实时 PCR 反应板空间，但由于未知样本的量是通过已知起始量构建的标准曲线进行插值计算，因此该方法能够确保高度准确的定量结果。此外，该方法更适用于检测低丰度的目标分子。从方法学角度来看，一个关键问题是对应标准曲线各点的冻存质粒稀释液可能比预期更快降解。因此，每次实验前都需要从最初保存的质粒重新制备新的稀释液，尤其是最高稀释度的样本。在最终计算中，以淋巴细胞加单核细胞计数来估算外周血单个核细胞（PBMC）数量时，若存在不完全等效的情况，可能会在每 106 个细胞与每毫升血液之间的数值换算中引入一定偏差。可通过直接从全血提取的已知量 DNA 中测定两个目标物（TRECs 和 KRECs）的量来改进该方法，从而无需进行单核细胞与淋巴细胞计数14。在此特定情况下，严格来说无需使用参考基因进行定量，但可将其作为 DNA 质量和数量的额外质控指标。
结果解读可能受到一些因素的影响。首先，应考虑到参考...

T细胞受体切除环（TRECs）和κ基因删除重组切除环（KRECs）是分别在部分T细胞和B细胞中，于基因组DNA重组过程中被切除的小型环状DNA片段，该过程导致T细胞和B细胞受体高度多样化的库的形成。这些环状DNA无明确功能，但由于其结构稳定且无法复制，每次细胞分裂后会被稀释，仅保留在两个子代细胞中的一个。因此，外周血中TRECs和KRECs的水平可作为胸腺和骨髓输出功能的评估指标。
尽管TREC检测在过去15年中已广泛用于评估胸腺输出水平1，而KREC检测最初是为测量B细胞增殖及其在健康和疾病状态下对B细胞稳态的贡献而开发的2，但直到最近才被提议作为骨髓输出的标志物3,4。本文中，我们描述了所建立的用于同时定量TREC和KREC的方法4。
通过这种联合方法，使用含有TREC、KREC和T细胞受体α恒定区（TCRAC）基因片段的三插入质粒，以1:1:1的比例稀释制备单一标准曲线，从而消除了实时PCR法DNA定量相关的变异性。这使得对TREC和KREC拷贝数的评估更加准确。此外，在同一反应中同时定量两个靶标还可降低试剂成本。
所提出的TREC/KREC检测可用于测量患有严重联合免疫缺陷（SCID）4、常见变异型免疫缺陷5、自身免疫性疾病6-8以及HIV感染9的儿童或成人中T细胞和B细胞新生的程度。此外，该检测还可用于监测造血干细胞移植10、酶替代治疗11以及抗病毒9或免疫调节治疗6-8后的免疫系统重建情况。最后，由于无论潜在的遗传缺陷如何，均可通过TREC检测识别SCID患者，而无丙种球蛋白血症患者可通过KREC定量检测被发现，因此TREC/KREC检测也可用于新生儿筛查项目中免疫缺陷病的检出12。在此情况下，检测必须在从滤纸上采集并干燥的微量血斑中提取的DNA上进行，且必须对目标疾病具有高灵敏度和特异性，同时具备高度可重复性和成本效益。
在检测中引入KREC定量分析应能提高对免疫缺陷病进行新生儿筛查的性能。自2008年威斯康星州率先在其产后筛查项目中开展TREC分析以来，这项筛查已在美国部分地区（WI、MA、CA）常规实施。13

<table><tbody><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma Aldrich SRL</td><td>10771-500 ML</td><td>密度梯度分离法</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Blood Mini Kit (250)</td><td>QIAGEN</td><td>51106</td><td>DNA 提取</td></tr><tr><td>未修饰 DNA 寡核苷酸 HPSF 0.01 mmol</td><td>Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l&amp;nbsp;</td><td></td><td>将冻干产物重悬至 100 pmol/&amp;micro;l</td></tr><tr><td>AmpliTaq DNA 聚合酶：包含 10x Buffer II 和 25 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Applied Biosystems/Life-Technologies</td><td>N8080156</td><td></td></tr><tr><td>GeneAmp dNTP 混合液 (100 mM)</td><td>Applied Biosystems/Life-Technologies</td><td>N8080261</td><td></td></tr><tr><td>用于亚克隆的 TOPO TA 克隆试剂盒</td><td>Invitrogen/Life-Technologies</td><td>K4500-01</td><td></td></tr><tr><td>XL1-Blue 亚克隆级感受态细胞</td><td>Stratagene</td><td>200130</td><td></td></tr><tr><td>PureYield 质粒小量提取系统</td><td>Promega</td><td>A1223</td><td></td></tr><tr><td>SpeI 500U</td><td>New England Biolabs</td><td>R0133S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII-HF 10,000 U</td><td>New England Biolabs</td><td>R3104S</td><td></td></tr><tr><td>PureYield 质粒中量提取系统</td><td>Promega</td><td>A2492</td><td></td></tr><tr><td>XhoI 5,000 U</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>TRIS Utrapure</td><td>Sigma Aldrich SRL</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich SRL</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>TE 缓冲液 (1 mM TRIS 和 0.1 mM EDTA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR 主混合液</td><td>Applied Biosystems/Life-Technologies</td><td>4364338</td><td></td></tr><tr><td>双标记探针 HPLC 0.01 mmol</td><td>Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l&amp;nbsp;</td><td></td><td>将冻干产物重悬至 100 pmol/&amp;micro;l</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c 分光光度计</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems 2720 热循环仪</td><td>Applied Biosystems/Life-Technologies</td><td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>Fast 7500 实时荧光定量 PCR 系统</td><td>Applied Biosystems/Life-Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS 序列检测软件 1.4</td><td>Applied Biosystems/Life-Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

通过实时pcr同时定量t细胞受体切除环（trecs）和κ删除重组切除环（krecs）

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

T细胞受体切除环（TRECs）和κ删除重组切除环（KRECs）是在T细胞和B细胞受体形成过程中，通过基因重排产生的环状DNA片段。由于TRECs和KRECs无法自我复制，每次细胞分裂后其数量都会被稀释，因此它们在细胞中持续存在。外周血中TRECs和KRECs的数量可作为胸腺和骨髓输出功能的评估指标。通过将已建立并广泛应用的TREC检测方法与改良版KREC检测方法相结合，我们开发了一种双重定量实时PCR技术，可在单次检测中同时定量新生成的T淋巴细胞和B淋巴细胞。TREC和KREC的数量通过标准曲线获得，该标准曲线由含有TREC和KREC信号连接区的细菌质粒进行系列稀释制备，同时包含一段T细胞受体α链恒定区基因片段作为参考基因。结果以每106个细胞或每毫升血液中TREC和KREC的数量表示。这些DNA片段的定量检测已被证实可用于监测儿童和成人造血干细胞移植后的免疫重建过程，有助于更准确地表征免疫缺陷疾病，或更深入地理解某些免疫调节药物的作用机制。

在87名健康对照者（42名0至17岁儿童（男性/女性：25/17）和45名24至60岁成人（男性/女性：29/16））的代表性样本中进行了检测。结果以每106个PBMC中的TREC和KREC数量表示，随后计算出每毫升血液中的TREC和KREC数量。
由于胸腺退化，TREC 的数量随年龄增长而减少4，特别是在0至3-4岁期间急剧下降。在成人中，TREC 数量还与性别有关，因其在男性中的下降速度比女性更快5。这可能在设定适当的参考范围时带来问题，若需对正常值进行非常精确的估计，则应根据年龄并可能结合性别进行区分。
<img alt="TREC 水平与年龄的关系，散点图 A-D，显示细胞和体积 TREC 下降的数据分析。" src="/files/ftp_upload/52184/52184fig3display.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" d...

本文介绍了一种同时定量T细胞受体切除环（TRECs）和κ删除重组切除环（KRECs）的方法。TREC/KREC检测可作为胸腺和骨髓输出功能的标志物。

通过实时PCR同时定量T细胞受体切除环（TRECs）和κ删除重组切除环（KRECs）

T细胞受体切除环（TRECs）和K基因删除重组切除环（KRECs）是在重组过程中形成的环状DNA元件……

本实验的总体目标是通过在单次检测中定量T细胞受体切除环（T-cell receptor excision circles，TRECs）和K基因删除重组切除环（K-deleting recombination excision circles，KRECs），来评估胸腺和骨髓的输出功能。首先构建一种三重插入质粒，其中包含TREC序列、KREC序列以及单拷贝参考基因的DNA片段，以确保在DNA扩增后三种目标序列之间保持1:1:1的比例。随后，通过对该三重插入质粒进行系列稀释，建立标准曲线，从而利用实时定量PCR实现对三种目标序列的绝对定量。最后，进行实时荧光定量PCR检测，以实现对TREC和KREC的绝对定量。所报告的结果展示了健康儿童和成人中胸腺及骨髓输出功能随年龄和性别的变化情况。当我们需要分析新生儿或婴儿的骨髓和胸腺输出功能时，首次提出了该方法的想法，考虑到与成人相比，通常采集的血液量非常有限。因此，我们决定将轨迹分析与校正定量的两种方法结合为一种单一检测，以优化样品制备和试剂成本。该技术的应用可拓展至原发性和获得性免疫缺陷的诊断，也可用于研究涉及TMB细胞丢失的各种疾病，以及骨髓移植后免疫系统的重建过程。该方法有助于深入理解人类疾病，还可广泛应用于基础研究，尤其是涉及淋巴细胞稳态的研究。该方法的主要优势在于采用三重插入策略，仅需使用一条标准曲线即可完成检测，从而降低实验变异性。通常，初次接触该方法的研究人员可能会因三重插入质粒制备过程较为繁琐，或因标准曲线制备相关问题而遇到困难。首先，获取含有极可能携带TRX及可通过PCR检测到的裂解片段的细胞样本，例如采用标准密度梯度分离法分离的健康年轻受试者外周血，样本应使用EDTA抗凝管采集。根据文本方案从细胞中提取DNA后，分离外周血单个核细胞，使用特异性针对TRX REX和TCR alpha恒定区基因的引物扩增Rex信号片段、Rex信号连接片段以及TCR alpha恒定区基因片段。将Trax信号连接片段的PCR产物插入PCR 2.1 topo载体的TA受体位点中，并通过热激法将质粒DNA转化至XL1-blue感受态细胞，筛选失去β-半乳糖苷酶互补功能的氨苄青霉素抗性白色菌落，转移至新的主培养皿中，并利用PCR鉴定含有trek片段的阳性菌落。挑取一个trek阳性菌落后进行培养并提取DNA，使用SP1酶切质粒及TCR alpha恒定区基因的扩增产物，将TCR alpha恒定区基因片段连接入质粒中。重复转化、菌落筛选与扩增以及DNA提取步骤，以插入正确的片段；使用HindIII而非SP1来消化质粒和正确的PCR片段，并重复连接与DNA提取过程。在确认三个插入片段的序列正确后，扩增菌落并按照文本所述方案通过MIDI试剂盒纯化质粒DNA，用于制备标准曲线。在计算出质粒的质量与浓度后（如图所示），解冻一份质粒样品，并用该线性化DNA样品对两微克质粒进行线性化处理。使用公式 C₁V₁ = C₂V₂。为配制本处所示系列标准曲线的第一个点，需计算所需稀释体积；随后通过进行1:10系列稀释，获得其余标准曲线点。将质粒稀释液于-80°C保存，直至使用。为实时PCR准备样品时，应设置PCR板，对每个待分析样品至少设置两个重复，按以下方式分别使用两个独立管：一管用于Rex和cracks，另一管用于TCR alpha constant。根据所需孔数配制主混合液。向板的各孔中加入20 µL。接着，加入5 µL从外周血单个核细胞或P BMCs提取的基因组DNA。在使用光学粘性封膜密封反应板之前，向无模板对照孔中加入 5 µL 水。随后解冻质粒 DNA 标准曲线稀释液，并制备最高稀释度的样品。仅打开位于 A 至 H 行与 1 至 4 列之间的孔。短暂涡旋混匀后，将每个稀释梯度的五微升加入指定的孔中。确保孔底部无气泡，且试剂已沉降至孔底。使用实时荧光定量PCR系统，按照以下程序运行检测。50摄氏度孵育2分钟，初始加热95摄氏度10分钟，随后进行45个循环：95摄氏度变性15秒，以及在60摄氏度退火和延伸1分钟。为分析实时PCR数据，请在软件中打开已保存的结果文件，然后点击窗口顶部的“结果”选项卡。单击分析菜单，然后选择分析设置。选择所有检测器并为循环阈值选择自动CT，以让软件自动确定阈值。默认情况下，让软件自动设置基线以消除背景干扰。单击名为“扩增图”的选项卡，在窗口最右侧的下拉菜单中选择三种检测器中的任意一种。紧接着，在窗口下方选择“手动设置CT值”，以手动设定阈值；然后通过按住鼠标左键并拖动，选中与所选检测器对应的标准曲线稀释点的孔位，以显示其扩增曲线图。如需手动调整阈值，请上下拖动红色的阈值线，然后单击“分析”按钮以重新分析结果。为了检查设定阈值如何影响结果，请选择报告选项卡，查看相应标准曲线稀释点的循环阈值（CT）。在扩增曲线图选项卡中移动阈值以获得最佳位置时，需确认阈值位于指数扩增区域，且明显高于背景噪声，但低于平台期。如果扩增曲线图未以对数刻度显示，请右键单击图表以调出图形设置，并将运行后Y轴设置为对数（log）。将阈值设定在扩增曲线线性部分的中点位置，并观察各扩增曲线大致相互平行。点击报告标签查看CT结果。确保阈值的设置使每条标准曲线的两个重复样本结果具有最大精确度。稀释点。在报告选项卡下，检查阈值是否设置在最能反映标准曲线稀释点极端数量级的位置。再次用鼠标拖动窗口下方表格中的相应单元格，以选中标准曲线各孔对应的细胞。对于所有检测器，需确认三个靶标在同一稀释点的扩增循环数（CT值）非常接近。例如，差异不应超过 0.5 CT，必要时重新调整阈值，并在窗口底部的“报告”选项卡下重新检查。选择 NTC 孔，确认 NTC 孔中无扩增曲线，即 CT 值为未确定。选择“标准曲线”选项卡，在图表窗口右侧的下拉菜单中选择检测器，查看报告的标准曲线斜率是否在 -3.55 至 -3.32 之间，这对应于 PCR 扩增效率为 91% 至 100%。通过检查斜率和截距下方的数值，确保决定系数（R²）大于 0.998。单击报告选项卡，在图表下方表格的相应单元格中，确认阳性对照的 CT 值与之前针对同一已知阳性对照样本的检测结果一致。单击文件菜单，选择保存，然后导出为 CSV 文件，以将所有孔的定量数据导出为包含逗号分隔值的文本文件。最后，将该 CSV 文件导入电子表格软件，并通过正确设置以下公式，计算每 10⁶ 个 PBMs 中的扩增曲线数或校正值。本视频中描述的检测在87名健康对照者的代表性样本上进行，包括42名年龄在0至17岁的儿童和45名年龄在24至60岁的成人。如图所示，由于胸腺退化，从出生到3至4岁期间，胸腺输出量随年龄增长而急剧下降。裂隙数量也取决于性别，因为在男性中其下降速度比女性更快，这可能影响设定适当参考范围的能力。这些图表显示，然而，裂隙数量随年龄增长而减少，这种模式仅在儿童中与T TREXs的变化模式相似。而在成人中，骨髓输出在整个生命过程中相对稳定，且不依赖于性别。插入质粒的三重制备大约需要两到三周时间，但此后储存的质粒分配物可保存三年。如果操作得当，该技术的其余部分仅需四到五小时即可完成。在进行此操作时，非常重要的一点是在专用区域进行所有与质粒相关的操作，以避免DNA交叉污染。在结果分析过程中，还必须验证标准管的稳定性，尤其是在其制备完成后。该技术为临床免疫学或血液学领域的研究人员提供了一种改进的工具，可用于鉴定原发性免疫缺陷、监测骨髓移植后免疫重建的效果，或仅用于研究淋巴细胞稳态。观看本视频后，您应能够充分理解如何获取三重质粒、制备标准曲线、运行实时PCR实验，并完成获得TRAX和Cracks可重复绝对定量结果所必需的计算步骤。

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