通过实时PCR同时定量T细胞受体切除环（TRECs）和κ删除重组切除环（KRECs）

本实验的总体目标是通过在单次检测中定量T细胞受体切除环（T-cell receptor excision circles，TRECs）和K基因删除重组切除环（K-deleting recombination excision circles，KRECs），来评估胸腺和骨髓的输出功能。首先构建一种三重插入质粒，其中包含TREC序列、KREC序列以及单拷贝参考基因的DNA片段，以确保在DNA扩增后三种目标序列之间保持1:1:1的比例。随后，通过对该三重插入质粒进行系列稀释，建立标准曲线，从而利用实时定量PCR实现对三种目标序列的绝对定量。

最后，进行实时荧光定量PCR检测，以实现对TREC和KREC的绝对定量。所报告的结果展示了健康儿童和成人中胸腺及骨髓输出功能随年龄和性别的变化情况。当我们需要分析新生儿或婴儿的骨髓和胸腺输出功能时，首次提出了该方法的想法，考虑到与成人相比，通常采集的血液量非常有限。

因此，我们决定将轨迹分析与校正定量的两种方法结合为一种单一检测，以优化样品制备和试剂成本。该技术的应用可拓展至原发性和获得性免疫缺陷的诊断，也可用于研究涉及TMB细胞丢失的各种疾病，以及骨髓移植后免疫系统的重建过程。该方法有助于深入理解人类疾病，还可广泛应用于基础研究，尤其是涉及淋巴细胞稳态的研究。

该方法的主要优势在于采用三重插入策略，仅需使用一条标准曲线即可完成检测，从而降低实验变异性。通常，初次接触该方法的研究人员可能会因三重插入质粒制备过程较为繁琐，或因标准曲线制备相关问题而遇到困难。首先，获取含有极可能携带TRX及可通过PCR检测到的裂解片段的细胞样本，例如采用标准密度梯度分离法分离的健康年轻受试者外周血，样本应使用EDTA抗凝管采集。

根据文本方案从细胞中提取DNA后，分离外周血单个核细胞，使用特异性针对TRX REX和TCR alpha恒定区基因的引物扩增Rex信号片段、Rex信号连接片段以及TCR alpha恒定区基因片段。将Trax信号连接片段的PCR产物插入PCR 2.1 topo载体的TA受体位点中，并通过热激法将质粒DNA转化至XL1-blue感受态细胞，筛选失去β-半乳糖苷酶互补功能的氨苄青霉素抗性白色菌落，转移至新的主培养皿中，并利用PCR鉴定含有trek片段的阳性菌落。挑取一个trek阳性菌落后进行培养并提取DNA，使用SP1酶切质粒及TCR alpha恒定区基因的扩增产物，将TCR alpha恒定区基因片段连接入质粒中。

重复转化、菌落筛选与扩增以及DNA提取步骤，以插入正确的片段；使用HindIII而非SP1来消化质粒和正确的PCR片段，并重复连接与DNA提取过程。在确认三个插入片段的序列正确后，扩增菌落并按照文本所述方案通过MIDI试剂盒纯化质粒DNA，用于制备标准曲线。在计算出质粒的质量与浓度后（如图所示），解冻一份质粒样品，并用该线性化DNA样品对两微克质粒进行线性化处理。

使用公式 C₁V₁ = C₂V₂。为配制本处所示系列标准曲线的第一个点，需计算所需稀释体积；随后通过进行1:10系列稀释，获得其余标准曲线点。将质粒稀释液于-80°C保存，直至使用。为实时PCR准备样品时，应设置PCR板，对每个待分析样品至少设置两个重复，按以下方式分别使用两个独立管：一管用于Rex和cracks，另一管用于TCR alpha constant。

根据所需孔数配制主混合液。向板的各孔中加入20 µL。接着，加入5 µL从外周血单个核细胞或P BMCs提取的基因组DNA。

在使用光学粘性封膜密封反应板之前，向无模板对照孔中加入 5 µL 水。随后解冻质粒 DNA 标准曲线稀释液，并制备最高稀释度的样品。仅打开位于 A 至 H 行与 1 至 4 列之间的孔。

短暂涡旋混匀后，将每个稀释梯度的五微升加入指定的孔中。确保孔底部无气泡，且试剂已沉降至孔底。使用实时荧光定量PCR系统，按照以下程序运行检测。

50摄氏度孵育2分钟，初始加热95摄氏度10分钟，随后进行45个循环：95摄氏度变性15秒，以及在60摄氏度退火和延伸1分钟。为分析实时PCR数据，请在软件中打开已保存的结果文件，然后点击窗口顶部的“结果”选项卡。

单击分析菜单，然后选择分析设置。选择所有检测器并为循环阈值选择自动CT，以让软件自动确定阈值。默认情况下，让软件自动设置基线以消除背景干扰。

单击名为“扩增图”的选项卡，在窗口最右侧的下拉菜单中选择三种检测器中的任意一种。紧接着，在窗口下方选择“手动设置CT值”，以手动设定阈值；然后通过按住鼠标左键并拖动，选中与所选检测器对应的标准曲线稀释点的孔位，以显示其扩增曲线图。如需手动调整阈值，请上下拖动红色的阈值线，然后单击“分析”按钮以重新分析结果。

为了检查设定阈值如何影响结果，请选择报告选项卡，查看相应标准曲线稀释点的循环阈值（CT）。在扩增曲线图选项卡中移动阈值以获得最佳位置时，需确认阈值位于指数扩增区域，且明显高于背景噪声，但低于平台期。如果扩增曲线图未以对数刻度显示，请右键单击图表以调出图形设置，并将运行后Y轴设置为对数（log）。

将阈值设定在扩增曲线线性部分的中点位置，并观察各扩增曲线大致相互平行。点击报告标签查看CT结果。确保阈值的设置使每条标准曲线的两个重复样本结果具有最大精确度。

稀释点。在报告选项卡下，检查阈值是否设置在最能反映标准曲线稀释点极端数量级的位置。再次用鼠标拖动窗口下方表格中的相应单元格，以选中标准曲线各孔对应的细胞。对于所有检测器，需确认三个靶标在同一稀释点的扩增循环数（CT值）非常接近。

例如，差异不应超过 0.5 CT，必要时重新调整阈值，并在窗口底部的“报告”选项卡下重新检查。选择 NTC 孔，确认 NTC 孔中无扩增曲线，即 CT 值为未确定。选择“标准曲线”选项卡，在图表窗口右侧的下拉菜单中选择检测器，查看报告的标准曲线斜率是否在 -3.55 至 -3.32 之间，这对应于 PCR 扩增效率为 91% 至 100%。通过检查斜率和截距下方的数值，确保决定系数（R²）大于 0.998。

单击报告选项卡，在图表下方表格的相应单元格中，确认阳性对照的 CT 值与之前针对同一已知阳性对照样本的检测结果一致。单击文件菜单，选择保存，然后导出为 CSV 文件，以将所有孔的定量数据导出为包含逗号分隔值的文本文件。最后，将该 CSV 文件导入电子表格软件，并通过正确设置以下公式，计算每 10⁶ 个 PBMs 中的扩增曲线数或校正值。

本视频中描述的检测在87名健康对照者的代表性样本上进行，包括42名年龄在0至17岁的儿童和45名年龄在24至60岁的成人。如图所示，由于胸腺退化，从出生到3至4岁期间，胸腺输出量随年龄增长而急剧下降。

裂隙数量也取决于性别，因为在男性中其下降速度比女性更快，这可能影响设定适当参考范围的能力。这些图表显示，然而，裂隙数量随年龄增长而减少，这种模式仅在儿童中与T TREXs的变化模式相似。而在成人中，骨髓输出在整个生命过程中相对稳定，且不依赖于性别。

插入质粒的三重制备大约需要两到三周时间，但此后储存的质粒分配物可保存三年。如果操作得当，该技术的其余部分仅需四到五小时即可完成。在进行此操作时，非常重要的一点是在专用区域进行所有与质粒相关的操作，以避免DNA交叉污染。

在结果分析过程中，还必须验证标准管的稳定性，尤其是在其制备完成后。该技术为临床免疫学或血液学领域的研究人员提供了一种改进的工具，可用于鉴定原发性免疫缺陷、监测骨髓移植后免疫重建的效果，或仅用于研究淋巴细胞稳态。观看本视频后，您应能够充分理解如何获取三重质粒、制备标准曲线、运行实时PCR实验，并完成获得TRAX和Cracks可重复绝对定量结果所必需的计算步骤。