Name: 基于图像的流式细胞仪技术来评估变化粒细胞功能在体外 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: 了解基于图像的流式细胞仪技术评估粒细胞功能的双参数方法，该技术可同时检测吞噬作用和氧化爆发，识别三种不同活化状态的粒细胞亚群，为临床免疫学和营养学研究提供重要工具。

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本研究部分得到了德克萨斯大学北部分校向 McFarlin 博士提供的研究启动资助（RIG）。作者未获得完成本研究的直接资助，且不存在利益冲突。

注意：本方法中所述的所有血液采集程序均按照《赫尔辛基宣言》进行，并已获得北德克萨斯大学（UNT）人类受试者机构审查委员会（IRB）的批准。所有受试者均签署了书面同意书，同意采集血液。本方法中使用血液样本以确保受试者明显健康、体重正常且无疾病。
1. 试剂来源与制备
<ol>
	<li>使用 CD66b-APC（克隆号 G10F5；稀释因子=1:50）和 CD45-APCeFluor780（克隆号 2D1；稀释因子=1:50）进行本实验。 
	注意：在研究开始前，已对 CD45 和 CD66b 抗体进行滴定，以确定最佳稀释度，从而清晰区分粒细胞（CD45+/66b+）与其他白细胞（CD45+/66b-） 11加入稀释后的抗体进行染色后，管中最终稀释倍数为875。</li>
	<li>购买并解冻储备液 S. aureus 用pHrodo红染料标记的生物颗粒。将生物颗粒以每毫升1毫克的浓度悬浮于无菌PBS中。分装稀释后的生物颗粒，于-20°C冷冻保存。20 °C 直至用于检测。</li>
	<li>溶解二氢乙啶（DHE），该物质在氧自由基存在下可转化为荧光性的溴化乙啶即， 氧化爆发），在DMSO中配制成终浓度为10 g/ml。</li>
	<li>将N-乙基马来酰亚胺（用于在指定的实验孵育时间后阻止进一步的吞噬作用）与无菌PBS进行两步稀释，浓度分别为200 mg/ml和17.5 mg/ml。在实验中使用15 mM的终浓度。解冻N-乙基马来酰亚胺时，使用一个 37 °C 热块，因为N-乙基马来酰亚胺不会保留在溶液中。</li>
	<li>最后固定步骤完成后，使用 7AAD 对核 DNA 进行染色。染色前，将储存液 7AAD 用无菌 PBS 按 1:10 比例稀释。</li>
</ol>
2. 血液样本采集
<ol>
	<li>要求受试者在过夜禁食（>8小时）且未进行体力活动（>12小时）后到达实验室。</li>
	<li>使用酒精消毒片清洁皮肤后，将无菌采血针插入前臂静脉。</li>
	<li>将血液采集至预先加入肝素钠的商用真空采血管中。</li>
	<li>采血完成后，在受试者手臂穿刺部位贴上粘性创可贴。</li>
	<li>轻轻倒置采血管混匀10次，随后置于摇床上直至进行分析。</li>
</ol>
3. 吞噬作用检测技术
<ol>
	<li>在室温下解冻 S.aureus 生物颗粒和 DHE，将 N-乙基马来酰亚胺在 37 °C 下解冻。</li>
	<li>在无菌操作台中，向 4 个独立的 1.2 ml 离心管中各加入 20 µL S.aureus 生物颗粒。</li>
	<li>向每支含有生物颗粒的离心管中加入 40 µL DHE。</li>
	<li>轻轻敲击管壁，使试剂沉降至管底。</li>
	<li>向已加入生物颗粒和 DHE 的每支离心管中加入 100 µL 混合全血。</li>
	<li>用棉签擦拭管内壁边缘，去除可能残留的污染血液。</li>
	<li>使用电子移液器在加入血液后，以三循环模式混匀血液与试剂。</li>
	<li>将检测管置于冰桶中，并用铝箔覆盖以避光。</li>
	<li>将检测管分别孵育 10、20 和 40 分钟。从 40 分钟的管开始孵育，以确保所有检测管同时结束孵育。</li>
	<li>将 N-乙基马来酰亚胺置于 37 °C 金属浴中解冻。</li>
	<li>向每支检测管中加入 15 µL 上述步骤 1.4 中所述的 N-乙基马来酰亚胺，孵育 30 分钟。</li>
	<li>向每支检测管中加入 10 µL CD66b-APC 和 10 µL CD45-APCeFluor780 稀释抗体（如上述步骤 1.1 所述），孵育 60 分钟。</li>
	<li>向每支检测管中加入 750 µL 白细胞固定/红细胞裂解液，孵育 60 分钟。</li>
	<li>将检测管以 400 × g 离心 10 分钟，以收集细胞沉淀。</li>
	<li>用真空抽吸法去除白细胞裂解液/红细胞固定液，保留约 100 µL 液体在细胞沉淀上方。</li>
	<li>向每支检测管中加入 10 µL 上述步骤 1.5 中所述的稀释 7AAD 溶液和 50 µL PBS。</li>
	<li>向每支检测管中加入一滴校准微球（约 25 µL），盖上管盖，用铝箔包裹，并置于冰箱中。</li>
	<li>将样本管加载至基于图像的流式细胞仪中，使用预设参数至少采集 3,000 个粒细胞事件：自动进样器，蓝色激光（488 nm；60 mW），红色激光（640 nm；100 nW），侧向散射光 SSC（785 nm；8.5 mW）（图 1）。</li>
</ol>
<img alt="流式细胞仪工作站及数据分析；屏幕上显示的细胞分析图和图表。" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 数据采集方法与模板。 样本在基于图像的流式细胞仪上进行采集（A）。采集过程中，使用 INSPIRE v. 100.2.292.0 软件生成明场长宽比（Bright Field Aspect Ratio）与 CD66b-APC 的散点图，以区分粒细胞与添加的校准微球（B）。每个样本通过自动进样器至少采集 5,000 个粒细胞，使用的激光包括蓝色（488 nm；60 mW）、红色（640 nm；100 nW）和侧向散射光 SSC（785 nm；8.5 mW）。请注意，采集过程中会显示多个直方图，用于监测激光设置及其他数据采集参数。所有这些直方图均为可选，仅当实验室标准操作程序要求将其作为质量控制时才需使用。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
4. 样品采集与分析
<ol>
	<li>使用 IDEAS 软件的自动补偿向导对原始图像文件（RIF）应用补偿矩阵，并生成已补偿图像文件（CIF）。</li>
	<li>在 IDEAS 软件中加载各个 CIF 文件，并生成以下图表以鉴定粒细胞亚群：</li>
	<li>使用明场梯度RMS的直方图建立初始门控，以鉴定被认为处于焦点内的细胞图 2A）。以未刺激的对照样本作为参考标准，对每个患者样本进行此项判定。</li>
	<li>使用次级图，通过明场纵横比（细胞高度与宽度的比值）与明场面积的散点图，将单细胞与碎片及双联体分离开来图2B以未刺激的对照样本作为参考标准，对每个患者样本进行此项判定。</li>
	<li>在确定了纯净的细胞群体后，建立 CD45 与 CD66b 的散点图（dot plot）图2C) 以正向鉴定粒细胞（CD45+/66b+）。创建一个子图（图3) 明亮点细节强度的 S. aureus （x轴）与氧化爆发（DHE，y轴）的明亮细节强度对比，以鉴定活化粒细胞亚群。在通道1和通道9采集明场图像，通道2采集生物颗粒，通道4采集DHE，通道5采集7AAD，通道11采集CD66b，通道12采集CD45。</li>
</ol>
<img alt="明场图像分析图表，显示频率、长宽比与面积关系以及标志物比较。" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 分析模板。 本图展示了用于识别处于焦平面内的细胞(A)、单个细胞(B)以及粒细胞(C)的一系列图像分析图。此外还使用了其他图表来区分活化状态的三种粒细胞亚群与非活化粒细胞。所有获取的图像文件分析均使用 IDEAS v.6 软件完成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<ol><li>Kong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+alpha-fetoprotein+on+the+activation+and+phagocytosis+of+granulocytes+and+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatogastroenterology%22%5BJournal%5D)">The effect of alpha-fetoprotein on the activation and phagocytosis of granulocytes and monocytes.</a> Hepatogastroenterology. 59, 2385-2388 (2012).</li>
<li>Prakash, P. S., Caldwell, C. C., Lentsch, A. B., Pritts, T. A., Robinson, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+microparticles+generated+during+sepsis+in+patients+with+critical+illness+are+neutrophil-derived+and+modulate+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Trauma+Acute+Care+Surg%22%5BJournal%5D)">Human microparticles generated during sepsis in patients with critical illness are neutrophil-derived and modulate the immune response.</a> J. Trauma Acute Care Surg. 73, 401-406 (2012).</li>
<li>Salih, H. R., Husfeld, L., Adam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+cytofluorometric+measurement+of+phagocytosis%2C+burst+production+and+killing+of+human+phagocytes+using+Candida+albicans+and+Staphylococcus+aureus+as+target+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Infect%22%5BJournal%5D)">Simultaneous cytofluorometric measurement of phagocytosis, burst production and killing of human phagocytes using Candida albicans and Staphylococcus aureus as target organisms.</a> Clin. Microbiol. Infect. 6, 251-258 (2000).</li>
<li>Tsuji, S., Iharada, A., Taniuchi, S., Hasui, M., Kaneko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+production+of+nitric+oxide+by+phagocytic+stimulated+neutrophils+in+patients+with+chronic+granulomatous+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Hematol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Increased production of nitric oxide by phagocytic stimulated neutrophils in patients with chronic granulomatous disease.</a> J. Pediatr. Hematol. Oncol. 34, 500-502 (2012).</li>
<li>Ortyn, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+measurement+and+compensation+in+spectral+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging.</a> Cytometry A. 69, 852-862 (2006).</li>
<li>McFarlin, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one-year+school-based+diet%2Fexercise+intervention+improves+non-traditional+disease+biomarkers+in+Mexican-American+children%5BTitle%5D)+AND+%22Matern.+Child+Nutr%22%5BJournal%5D)">A one-year school-based diet/exercise intervention improves non-traditional disease biomarkers in Mexican-American children.</a> Matern. Child Nutr. 9, 524-532 (2013).</li>
<li>McFarlin, B. K., Johnson, C. A., Moreno, J. P., Foreyt, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mexican-American+Children+have+differential+elevation+of+Metabolic+Biomarkers+that+is+proportional+to+Obesity+Status%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Gastroenterol.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Mexican-American Children have differential elevation of Metabolic Biomarkers that is proportional to Obesity Status.</a> J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. , (2013).</li>
<li>Strohacker, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderate-intensity%2C+premeal+cycling+blunts+postprandial+increases+in+monocyte+cell+surface+CD18+and+CD11a+and+endothelial+microparticles+following+a+high-fat+meal+in+young+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Physiol.+Nutr.+Metab%22%5BJournal%5D)">Moderate-intensity, premeal cycling blunts postprandial increases in monocyte cell surface CD18 and CD11a and endothelial microparticles following a high-fat meal in young adults.</a> Appl. Physiol. Nutr. Metab. 37, 530-539 (2012).</li>
<li>Carpenter, K. C., Breslin, W. L., Davidson, T., Adams, A., McFarlin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baker%27s+yeast+beta-glucan+supplementation+increases+monocytes+and+cytokines+post-exercise%3A+implications+for+infection+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Baker's yeast beta-glucan supplementation increases monocytes and cytokines post-exercise: implications for infection risk.</a> Br. J. Nutr. , 1-9 (2012).</li>
<li>McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+cytometry+reveals+three+distinct+subsets+of+activated+granulocytes+based+on+phagocytosis+and+oxidative+burst%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst.</a> Cytometry A. 83, 745-751 (1002).</li>
<li>McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+cytometry+reveals+three+distinct+subsets+of+activated+granulocytes+based+on+phagocytosis+and+oxidative+burst%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst.</a> Cytometry A. 83, 745-751 (2013).</li>
<li>Ichii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+sucrose+impairs+phagocytic+function+and+promotes+apoptosis+in+polymorphonuclear+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes.</a> Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).</li>
<li>Ploppa, A., George, T. C., Unertl, K. E., Nohe, B., Durieux, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageStream+cytometry+extends+the+analysis+of+phagocytosis+and+oxidative%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Clin.+Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">ImageStream cytometry extends the analysis of phagocytosis and oxidative.</a> Scand. J. Clin. Lab. Invest. 71, 362-369 (2011).</li>
<li>Van Amersfoort, E. S., Van Strijp, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+flow+cytometric+fluorescence+quenching+assay+of+phagocytosis+of+sensitized+sheep+erythrocytes+by+polymorphonuclear+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a flow cytometric fluorescence quenching assay of phagocytosis of sensitized sheep erythrocytes by polymorphonuclear leukocytes.</a> Cytometry. 17, 294-301 (1994).</li>
<li>Gullstrand, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+autoantibodies+against+different+histone+proteins+influences+complement-dependent+phagocytosis+of+necrotic+cell+material+by+polymorphonuclear+leukocytes+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Combination of autoantibodies against different histone proteins influences complement-dependent phagocytosis of necrotic cell material by polymorphonuclear leukocytes in systemic lupus erythematosus.</a> J. Rheumatol. 39, 1619-1627 (2012).</li>
<li>Fierro, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+phenotypical+impairment+of+polymorphonuclear+cells+in+atopic+dermatitis%3A+an+additional+cause+for+the+known+susceptibility+to+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatology%22%5BJournal%5D)">Functional and phenotypical impairment of polymorphonuclear cells in atopic dermatitis: an additional cause for the known susceptibility to infections.</a> Dermatology. 224, 323-330 (2012).</li>
<li>Gruger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+impact+of+linezolid+on+human+neutrophil+functions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro.</a> Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).</li>
<li>McFarlin, B. K., Venable, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Low+Concentration+Human+Serum+Cytokines+using+a+Millipore+High-Sensitivity+Milliplex+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Measurement of Low Concentration Human Serum Cytokines using a Millipore High-Sensitivity Milliplex Assay.</a> J. Vis. Exp. , (2014).</li>
<li>McFarlin, B. K., Carpenter, K. C., Davidson, T., McFarlin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baker%27s+Yeast+Beta+Glucan+Supplementation+Increases+Salivary+IgA+and+Decreases+Cold%2FFlu+Symptomatic+Days+After+Intense+Exercise%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Diet.+Suppl%22%5BJournal%5D)">Baker's Yeast Beta Glucan Supplementation Increases Salivary IgA and Decreases Cold/Flu Symptomatic Days After Intense Exercise.</a> J. Diet. Suppl. 10, 171-183 (2013).</li>
<li>McFarlin, B. K., Carpenter, K. C., Strohacker, K., Breslin, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+blood+monocytes+and+adipose+tissue+macrophages+in+a+mouse+model+diet-induced+weight+gain%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Med%22%5BJournal%5D)">Comparison of blood monocytes and adipose tissue macrophages in a mouse model diet-induced weight gain.</a> Comp. Med. 62, 462-465 (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突披露。

本方法是对现有利用流式细胞术评估粒细胞功能的方法的改进1,3,4,12-14。该检测的关键步骤通常涉及将血液样本与生物颗粒及二氢乙啶（DHE）充分混匀。混匀不充分会导致结果不准确。尽管充分混匀至关重要，但混匀操作应轻柔进行。建议使用带混匀功能的电子移液器进行混匀，而非涡旋振荡器。检测中的另一个关键步骤是始终确保检测管上半部分无血液污染。可使用无菌棉签去除残留血液。彻底清除非常重要，否则可能导致未裂解的红细胞污染最终的检测样本。
在使用本方法之前，应设置适当的补偿对照，以校正用于识别粒细胞功能不同方面的试剂之间存在的光谱重叠。本方法中的补偿对照包括采集经过40分钟检测孵育处理的血样，然后用单一标记物（即&#160;E. coli、DHE等）进行标记。标记完成后，采集单阳性事件，并利用IDEAS分析软件中的自动向导生成补偿矩阵。若使用本检测方法，必须完成适当的补偿对照，以确保检测结果的准确性。
通过使用特征查找器和共定位向导进行分析，确定亮细节强度是区分细胞群的最佳变量，并明确氧化爆发与吞噬作用信号之间的重叠程度。具体而言，基于图像的细胞计数技术能够将活化的粒细胞分为三个亚群。该亚群划分依据的是吞噬作用与氧化爆发过程中亮细节强度的差异。除了分析这些单一细胞功能外，还鉴定了在同一解剖位置同时发生两种事件（即共定位）的细胞。只有归入“高活性”亚群的粒细胞表现出吞噬作用与氧化爆发之间持续且一致的共定位现象。对活化粒细胞亚群的识别是实验中最需要进行问题排查的关键环节。新用户必须花时间熟悉IDEAS软件中的样本处理工作流程，并掌握利用成像组件对细胞群进行设门的操作原理。用户可能考虑的其他优化包括选择不同的或更长的检测孵育时间。当前方法建议孵育时间为10–40分钟；然而，根据该方法所应用的具体实验模型，可能需要选择更长的孵育时长。此类调整需根据具体实验条件单独评估。
此外，研究确定了检测孵育时间对三种活化亚群出现具有显著影响。本报告所述方法拓展了此前关于粒细胞功能所能获得的信息3,4,13,15。其他实验室已证明，在全面评估免疫功能与疾病时，检测粒细胞功能变化具有重要意义15-17。尽管该检测具有潜力，但仍存在局限性。其中一个主要局限是高通量样本处理所涉及的成本和时间消耗。当研究设计要求在一天内处理大量样本时，这些样本可能难以完成处理。虽然电子移液器和分液器的使用可使处理流程更高效，但这些设备通常价格昂贵，并非所有实验室都具备。
我们的研究领域聚焦于探讨运动和饮食习惯如何影响免疫系统的健康与功能6,8-10,18-20。此类研究目标对人类健康的多个领域具有重要的实际意义。除了运动与营养效应的研究之外，本文所展示的吞噬作用检测方法在其他临床免疫学领域也可能具有应用价值，特别是在吞噬功能的监测对治疗效果至关重要的情况下。本实验方法是众多免疫学检测方法中的首个范例，未来有望借助基于图像的流式细胞仪所提供的独特成像信息，对这类检测进行重新设计与革新。

粒细胞是机体先天免疫系统的一个组成部分，可提供抵御入侵抗原的第一道防线。以往评估粒细胞功能的方法主要集中于通过独立的技术分别检测其吞噬能力或氧化爆发能力，因而难以整体评估粒细胞发生的变化1-4。流式细胞术领域的进步已催生出能够以高通量方式对细胞进行高分辨率、多色成像的台式仪器5。将成像技术与传统流式细胞术相结合，代表了一项重要进展，为改进现有流式细胞术方法提供了所需的技术平台，并有助于获取有关免疫系统的新信息。
在过去的十年中，包括本实验室在内的多个研究团队一直高度关注各种营养和运动干预模式对先天免疫功能的影响6-9。本文所展示的方法在临床免疫学领域具有实际应用价值。本方法利用基于成像的流式细胞术，能够同时检测细菌颗粒的吞噬作用和氧化爆发反应。通过该方法，可利用成像分析部分提供的参数将活化的粒细胞进行区分。这些亚群只有在对单个粒细胞的细胞图像进行评估后才能被识别。进一步研究表明，不同检测孵育时间会影响三种活化亚群之间的转化过程10。因此，采用多个孵育时间点可能有助于建立一种检测特定实验干预后粒细胞功能变化的方法。本文的目的是展示一种利用基于成像的流式细胞术同时评估吞噬作用与氧化爆发反应来检测粒细胞功能的方法。

<table><tbody><tr><td>真空采血管</td><td>BD Life Sciences</td><td></td><td>用于血液采集</td></tr><tr><td>白细胞固定剂/红细胞裂解液</td><td>eBioscience</td><td>00-5333-57</td><td></td></tr><tr><td>CD66b-APC</td><td>eBioscience</td><td>克隆号 G10F5</td><td></td></tr><tr><td>CD45-APCeFluor780</td><td>eBioscience</td><td>克隆号 2D1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;i&gt;S. aureus&lt;/i&gt; 生物颗粒</td><td>Life Technologies</td><td>A10010</td><td></td></tr><tr><td>二氢乙啶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7008</td><td></td></tr><tr><td>N-乙基马来酰亚胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4259</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血细胞分析仪</td><td>Mindray</td><td>BC-3200</td><td></td></tr><tr><td>96通道移液器</td><td>Integra Biosciences</td><td>ViaFlo</td><td></td></tr><tr><td>珠浴孵育器</td><td>LabArmour</td><td>BeadBath</td><td></td></tr><tr><td>成像流式细胞仪</td><td>EMD Millipore</td><td>Amnis FlowSight</td><td></td></tr><tr><td>INSPIRE 软件</td><td>EMD Millipore</td><td>Amnis INSPIRE</td><td></td></tr><tr><td>IDEAS 软件</td><td>EMD Millipore</td><td>Amnis IDEAS</td><td></td></tr><tr><td>X-Pierce 可穿刺板封膜</td><td>Excel Scientific, Inc.</td><td>X-Pierce</td><td></td></tr><tr><td>Dell Precision 工作站</td><td>Dell Computers</td><td>Various</td><td>用于 IDEAS 分析</td></tr></tbody></table>

基于成像的流式细胞术技术评估粒细胞功能变化 体外

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

粒细胞在机体针对细菌和病毒感染的先天免疫应答中发挥关键作用。尽管目前已存在多种检测粒细胞功能的方法，但这些方法在所能提供的信息方面普遍存在局限性。例如，大多数现有检测仅能提供在单一固定孵育时间后被激活的粒细胞所占的百分比。此外，由于检测技术的限制，多数检测仅聚焦于粒细胞功能的某一方面。本报告展示了一种可同时测量粒细胞吞噬细菌能力与氧化爆发活性的技术。通过同时检测这两项功能，共鉴定出三种独特的活化型粒细胞表型：1）低度活化（吞噬作用微弱，无氧化爆发）；2）中度活化（中等程度吞噬作用，部分氧化爆发，但两种功能事件无共定位）；3）高度活化（强烈吞噬作用，强烈氧化爆发，且吞噬作用与氧化爆发存在共定位）。此外，还鉴定出第四类未活化的粒细胞群体。通过设置10、20和40分钟的检测孵育时间，评估了孵育时长对活化粒细胞表型分布的影响。另设一组样本在冰上孵育作为对照。采用连续时间点孵育方式，该检测方法有望揭示某种处理对粒细胞功能在空间上的影响。所有样本均使用配备定量成像（QI）功能、自动进样器及多激光器（488、642和785 nm）的基于图像的流式细胞仪进行检测。

利用基于成像的流式细胞术，可将一群均质的活化粒细胞分为三种不同的活化亚群（图3）。在本方法中，区分这三种活化亚群最有效的方式是绘制吞噬作用（S. aureus）的亮细节强度与氧化爆发（DHE）的对比图（图3；图4）。此外，使用IDEAS软件中的共定位向导功能，可定量分析同时发生吞噬作用和氧化爆发的现象，这是高度活化粒细胞的典型特征。
<img alt="吞噬作用与氧化爆发散点图；10、20、40分钟时的延时显微成像。" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 活化粒细胞亚群的鉴定。 在利用细胞表面标志物（CD45+/66b+）鉴定粒细胞后，生成了以吞噬作用的亮细节强度对氧化爆发的亮细节强度作图的子图。通过该方法，确定了非活性（紫色）、低活性（红色，A）、中等活性（蓝色，B）和高活性（黄色，C）粒细胞的百分比。该门控技术还用于评估检测孵育时间对不同活化粒细胞亚群相对丰度的影响。在孵育40分钟后，高活性粒细胞的比例最高。所有获取图像文件的分析均使用IDEAS v.6软件完成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
除了证明存在三种不同类型的活化粒细胞亚群外，研究还表明，检测孵育时间会影响各活化粒细胞亚群的相对丰度。具体而言，40分钟的孵育时间可获得最高比例的“高活性”粒细胞。通过设置至少三个不同的检测孵育时长，可能有助于确定特定临床治疗如何改变粒细胞活化状态的时间动态。这是首个发表的利用基于成像的流式细胞术，通过同时检测吞噬作用和氧化爆发来识别不同活化粒细胞亚群的方法。
<img alt="荧光显微镜结果；多通道分析、光谱成像、细胞研究。" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig4highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 细胞标志物的代表性图像。 本图展示了被分类为高活性 (A)、中等活性 (B) 和低活性 (C) 的细胞图像合集。S.aureus 生物颗粒位于 Ch03，氧化爆发位于 Ch04，细胞核染色 7AAD 位于 Ch05，侧向散射位于 Ch06，CD66b 位于 Ch11，CD45 位于 Ch12。此外，还显示了吞噬作用（Ch03）与氧化爆发（Ch04）的共定位合并图像。合并图像中的黄色区域表示吞噬作用与氧化爆发在同一解剖空间内同时发生。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

该方法展示了一种通过同时检测细菌吞噬作用和氧化爆发来评估粒细胞功能的技术。基于图像的流式细胞术能够识别出三种不同的活化粒细胞亚群，它们在相对功能能力上均存在差异。

粒细胞在机体针对细菌和病毒感染的先天免疫反应中发挥关键作用。尽管已有方法可用于检测粒细胞……

本实验的总体目标是采用双参数方法评估粒细胞功能。首先，将患者血液样本中的粒细胞与生物微粒及试剂共同孵育，以可视化其氧化爆发反应；在第二步中，终止孵育后阻断吞噬作用，随后标记目标细胞表面受体，从而实现对粒细胞的准确鉴定。最终，可通过基于图像的流式细胞术对活化的粒细胞亚群进行鉴定和分离。该方法有助于回答营养学或临床免疫学领域中的关键问题，例如饮食习惯和营养行为如何影响粒细胞的功能变化。本实验操作将由我实验室的博士生 Eric Prado 进行演示。获得外周血样本后，在室温下解冻SIUs生物颗粒和DHE，并将乙基马拉明置于37摄氏度水浴中。当试剂完全解冻后，在无菌操作台内向四个独立的1.2毫升离心管中各加入20微升ssus生物颗粒。然后向每支含有生物颗粒的离心管中加入40微升解冻后的DHE，轻轻敲击管壁，使试剂沉降至管底。向每支离心管中加入100微升混合全血后，用带棉头的涂抹棒清除管内壁边缘可能存在的污染血液，并使用电子移液器设定三个循环，充分混匀血液与试剂。第三次循环结束后，将所有试管置于避光的冰桶中。然后将试管放入37摄氏度的摇床中孵育10、20或40分钟，从孵育40分钟的试管开始，以确保所有孵育同时结束。孵育结束后，向每支试管中加入15 µL乙基马拉梅德。孵育30分钟后，向细胞中加入适量抗体各10 µL。继续孵育1小时后，向细胞中加入750 µL白细胞固定红细胞裂解液。再经过1小时孵育后，离心细胞，用真空抽吸法移除上清液，保留细胞沉淀上方100 µL的残留液体。现在向每个样本中加入10 µL新稀释的七A a d、50 µL PBS和25 µL校准微球。然后盖紧管盖，用铝箔包裹，并在4°C下保存。当基于图像的流式细胞仪准备就绪后，运行每个样本管，使用预设参数收集至少3000个ULU位点事件以分析样本。使用 IDEA 软件的自动补偿向导对原始图像文件应用补偿矩阵，并生成已补偿的图像文件。然后在 IDEA 软件中加载各个 CIF 文件，并生成以下图谱，以鉴定每位患者样本中的粒细胞亚群。首先以未刺激对照作为参考标准，利用明场梯度均方根直方图设定初始门控，识别被认为处于焦点内的细胞。然后，为了将单细胞与碎片及双细胞分离开，创建明场长径比与明场面积的散点图。在鉴定出清晰的细胞群体后，建立CD45与CD66B的散点图，以明确鉴定CD45阳性且CD66B阳性的粒细胞。最后，创建金黄色葡萄球菌的明场细节强度与氧化爆发的明场细节强度的散点图。为了鉴定活化的粒细胞亚群，需采集第一和第九通道的明场图像、第三通道的生物颗粒、第四通道的DHE、第五通道的7-AAD、第十一通道的CD66B以及第十二通道的CD45。此外，还可生成双色叠加图像，以显示DHE与生物颗粒事件的共定位。利用基于图像的流式细胞术，可将均一的活化粒细胞群体进一步分为三个不同的活化亚群。该方法中，区分这三个亚群最有效的方式是绘制吞噬作用的明场细节强度与氧化爆发之间的散点图。在 IDEAS 软件中进一步使用共定位向导，可对粒细胞同时发生的吞噬作用和呼吸爆发进行定量分析，这是高活性的显著标志。此外，在本实验中，40 分钟的孵育时间显示出最高比例的高活性粒细胞。因此，在方案中包含至少三个孵育时间点，有助于确定特定临床治疗如何改变粒细胞的时序性活化状态。完成此操作后，可进行其他方法，如基于微球的多重检测，以回答更多问题。例如，颗粒细胞趋化因子在仰卧位血清中暴露于生物颗粒后会发生怎样的变化？

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

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