基于图像的流式细胞仪技术来评估变化粒细胞功能在体外

该程序的总体目标是将粒细胞功能评估为双参数方法。这是通过首先将患者血液样本中的粒细胞与生物颗粒和试剂一起孵育以实现氧化爆发的可视化。在第二步中，阻断孵育后的吞噬作用，然后标记感兴趣的细胞表面受体，以便对粒细胞进行阳性鉴定。

最终，可以通过基于图像的流式细胞术来鉴定和分离活化的粒细胞亚群。这种方法可以帮助回答营养学或临床免疫学领域的关键问题，例如饮食习惯和营养习惯如何导致改变和粒细胞功能。演示此程序的是我实验室的博士生 Eric Prado。

获得外周血样品解冻后，SIU 生物颗粒和 DHE 在室温下浸泡，并在 37 摄氏度 B 浴中浸泡乙基，当试剂解冻后，将 20 微升 ssus 生物颗粒添加到无菌罩内的四个单独的 1.2 毫升试管中。然后将 40 微升解冻的 DHE 添加到每个含有生物颗粒的试管中，并在工作台上轻轻敲击试管以收集试管底部的试剂。向每根试管中加入 100 μL 混合全血后，用棉签涂抹器去除试管内边缘的任何污染血液，并用电动移液器组将血液和试剂混合三个循环。

第三个循环后，将所有试管放入避光的冰桶中。然后将试管在 37 摄氏度的快速浴中孵育 10、20 或 40 分钟，从 40 分钟的试管开始，以确保所有孵育同时完成。孵育结束时，将 15 μL 乙基浆料分配到每个试管中。

30 分钟后，将细胞与每种 10 μL 的适当抗体一起孵育。一小时后，将细胞在 750 μL 白细胞固定红细胞虱溶液中进一步孵育。再过一小时，孵育离心细胞并真空吸出上清液，在细胞沉淀上方留下 100 μL 的残留液体。

现在向每个样品中加入 10 微升新鲜稀释的 7 A a d、50 微升 PBS 和 25 微升校准珠。然后盖上管子，用箔纸包裹并储存在 4 摄氏度。当基于图像的流式细胞仪准备就绪时，运行每个样品管，使用预定义的参数收集至少 3000 个 ULU 位点事件来分析样品。

使用 IDEA 软件的自动软件补偿向导将补偿矩阵应用于原始图像文件并创建补偿成像文件。然后在 IDEA 软件中加载各个 CIF 文件并生成以下图来识别每个患者样本的粒细胞亚群。首先使用未刺激的对照作为参考标准，使用明场梯度均方根的直方图来建立初始门并识别被认为聚焦的细胞。

然后，为了将单重态细胞与碎片和双合体分离，创建明场纵横比与明场面积的点图。一旦确定了干净的细胞群，就建立了 CD 45 与 CD 66 的点图 B.To 确定 CD 45 阳性 CD 66 B 阳性粒细胞。最后，创建金黄色葡萄球的亮部细节强度与氧化爆发的亮部细节强度的点图。

为了识别在通道 1 和 9 中收集明场图像的活化粒细胞的子集、通道 3 中的生物粒子、通道 4 中的 DHA、通道 5 中的 7 a a d、通道 11 中的 CD 66 B 和通道 12 中的 CD 45，还可以生成描述组合 DHE 和生物粒子事件的双色叠加。使用基于图像的流式细胞术，可以将活化的粒细胞群分为三个不同的活化亚群。使用这种方法，解决这三个子集的最有效方法是绘制吞噬作用与氧化爆发的亮细节强度。

进一步使用 IDEAS 软件中的共定位向导可以量化粒细胞同时吞噬作用和氧化爆发的存在，这是高活化的标志。此外，在本实验中，40 分钟的孵育期显示出高活性粒细胞的最大百分比。因此，在方案中包括至少三个潜伏期有助于确定给定的临床治疗如何改变粒细胞的时间激活状态。

按照此程序，可以执行其他方法（如基于磁珠的多重分析）来回答其他问题。例如，暴露于生物颗粒后，腹后粒细胞趋化因子的产生如何变化？