Name: 影像性流式细胞仪对人体免疫突触的定性和定量分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: 学习使用影像性流式细胞仪对人体T细胞与抗原呈递细胞之间的免疫突触进行定性和定量分析的方法。该技术可在短时间内对未纯化的人外周血T细胞进行离体分析，为免疫学研究提供重要工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由德国研究基金会（DFG）资助，项目编号为 SFB-938-M 和 SA 393/3-4。

1. 全白细胞的制备
<ol>
	<li>使用肝素化注射器从健康供体（或患者）抽取 1 mL 外周血。确保已获得相关伦理委员会对献血的批准。</li>
	<li>在 50 mL 离心管中，将 1 mL 人外周血与 30 mL ACK 裂解缓冲液（150 mM NH4Cl、1 mM KHCO3 和 0.1 mM EDTA，pH 7.0）混合，并在室温下孵育 8 分钟。</li>
	<li>用 PBS 注满离心管，以 300 x g 离心 6 分钟。吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于 30 mL ACK 裂解缓冲液中。</li>
	<li>重复步骤 1.2 和 1.3，直至上清液澄清。最后用 PBS 洗涤细胞，在室温下以 300 x g 离心 6 分钟，将细胞沉淀重悬于 2 mL 培养基（RPMI1640 + 10% FCS）中，并在 37 °C 下孵育 60 分钟。</li>
</ol>
2. 用 SEB 负载 Raji 细胞
<ol>
	<li>准备两个15 mL Falcon离心管，每管中加入1.5 × 106个Raji细胞。离心细胞（300 × g，6分钟，室温），弃去上清液。</li>
	<li>用残留的培养基（约50–100 µL）重悬细胞，加入1.9 µL（1.9 µg）SEB，室温孵育15分钟。加入5 mL培养基，离心细胞（300 × g，6分钟，室温），然后将细胞沉淀重悬于培养基（RPMI1640 + 10% FCS）中，调整细胞密度为1 × 106 个细胞/mL。</li>
</ol>
3. 免疫突触的诱导与染色方案
<ol>
	<li>移液器 500 µL 将SEB负载的Raji细胞加入FACS管中的制备过程 500 µL 将未加载的Raji细胞转移至另一FACS管中。加入 650 µL 将全白细胞加入各管中，离心收集细胞（300 × g，室温离心10分钟）。弃去上清液，将沉淀重悬于 150 µL 培养基（RPMI1640 + 10% FCS）中。37°C 培养 37 °C （通常为 45 分钟）。</li>
	<li>轻轻涡旋细胞（1000 rpm，10 s），并在涡旋过程中加入1.5 mL多聚甲醛（1.5%）以固定细胞。加入1 mL PBS + 1% BSA终止固定。离心收集细胞（300 × g 室温孵育10分钟后，将细胞沉淀重悬于1 mL PBS + 1% BSA中。</li>
	<li>沉淀（300 × g 室温下孵育10分钟）并将细胞重悬于 100 µL 加入 PBS + 1% BSA + 0.1% 皂苷，室温孵育 15 分钟以透化细胞（96 孔板，U 型孔）。</li>
	<li>用 PBS + 1% BSA + 0.1% 皂苷溶液洗涤细胞，离心（300 x g 在室温下孵育10分钟）后，将细胞沉淀重悬于 50 µL 含荧光标记抗体或化合物的 PBS + 1% BSA + 0.1% 皂苷溶液（CD3-PE-TxRed（1:30）、鬼笔环肽-AF647（1:150）和 DAPI（1:3,000））</li>
	<li>在室温避光条件下孵育细胞 30 分钟。加入 1 mL PBS + 1% BSA + 0.1% saponin 重悬细胞，洗涤 3 次。300 x g 离心 g 室温下孵育10分钟。将细胞重新悬浮于 60 µL 用于成像流式细胞术的 PBS</li>
</ol>
4. 使用流式细胞仪进行图像采集
注意：以下图像采集程序和数据分析基于使用 ImageStream（IS100）、INSPIRE 和 IDEAS 等软件的成像流式细胞术。然而，也可使用其他流式细胞仪和分析软件。
<ol>
	<li>在连接成像流式细胞仪的计算机上打开分析软件，点击仪器菜单中的“初始化流路系统”。当提示时，将微珠加入右侧进样口。</li>
	<li>从“文件”菜单中加载默认模板，然后点击“运行/设置”。在“视图”下拉菜单中选择“微珠”。</li>
	<li>如果明场照明光源的指示值低于200，则点击“设置强度”以调节明场照明光源。</li>
	<li>在“辅助”选项卡中点击“全部启动”，运行校准和测试程序。</li>
	<li>点击“冲洗/锁定/加载”，并在提示时将样本加入左侧进样口。将细胞加载到流式细胞仪后，打开“细胞分类器”并按以下参数进行调整：每个通道的峰值强度上限设为1,022；通道2（DAPI）和通道5（CD3-Pe-TxR）的峰值强度下限设为50；通道1（侧向散射）的面积下限设为50，上限设为1,500。</li>
	<li>在“设置”选项卡中，将激发激光功率调整为405 nm（15 mW）、488 nm（200 mW）和647 nm（90 mW）。</li>
	<li>在“视图”下拉菜单中切换“细胞”和“微珠”视图，以评估细胞分类器和激光功率的设置效果。 
	注意：通过调整细胞分类器参数和/或激发激光功率，确保所有单个细胞及成对细胞均出现在“细胞”视图中，而细胞团块、碎片以及存在饱和像素的图像均出现在“碎片”视图中。</li>
	<li>在“设置”选项卡中定义样本名称及需采集的图像数量（样本为15,000–25,000张，补偿对照为500张）。点击“运行/设置”以开始数据采集。</li>
</ol>
5. 数据分析
<ol>
	<li>将原始图像文件（.rif）传输至数据分析计算机，并打开分析软件。</li>
	<li>根据“补偿”下拉菜单中的说明生成补偿矩阵。将补偿矩阵保存为 comp_Date.ctm。</li>
	<li>打开一个原始图像文件（.rif），在弹出的窗口中应用 comp_Date.ctm，生成补偿后的图像文件（.cif）和默认的数据分析文件（.daf）。</li>
	<li>打开补偿后的图像文件。将图像转换为彩色模式，并调整图像库属性工具栏中的查找表，以获得最佳的可见颜色效果。使用图像库属性工具栏中的“复合”选项卡生成RGB合并图像。</li>
	<li>从“分析”下拉菜单中打开掩膜管理器（Mask Manager）。创建用于定义T细胞和免疫突触的掩膜，步骤如下：
	<ol>
		<li>选择T细胞掩膜：“(Fill(Threshold_Ch05, 60)”；选择谷值掩膜：“Valley(Ch02,3)”；选择T细胞突触掩膜：“T-cell mask AND Valley(M02,Ch02, 3)”。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从“分析”下拉菜单中打开特征管理器（Feature Manager）。计算以下特征：
	<ol>
		<li>对于T细胞中总的CD3表达量，选择“Intensity_T-cells_Ch5”；对于T细胞中F-actin的总量，选择“Intensity_T-cells_Ch6”；对于免疫突触中CD3的表达量，选择“Intensity_T-cell synapse_Ch5”；对于免疫突触中F-actin的量，选择“Intensity_T-cell synapse_Ch6”。</li>
		<li>为计算T细胞面积，选择“Area_T-cells”；为计算T细胞免疫突触面积，选择“Area_T-cell synapse”。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在特征管理器中使用以下公式计算免疫突触中F-actin和CD3的富集程度： 
	<img alt="F-actin和CD3富集公式，T细胞突触强度分析的计算方法" src="/files/ftp_upload/55345/55345eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式"></li>
	<li>使用分析区域中的直方图和点图应用以下设门策略（更多细节参见参考文献17和19）：
	<ol>
		<li>通过绘制“Gradient RMS_M2_Ch2”的直方图排除失焦细胞；将阈值设为15。</li>
		<li>绘制SSC与CD3强度的点图。对CD3阳性事件设置门控。</li>
		<li>绘制M02（DAPI染色）的“长宽比”与M02（DAPI染色）面积的关系图。根据T细胞单细胞和细胞对进行门控。根据之前所述方法17,19，利用突触掩膜的面积校正真实的细胞对。</li>
		<li>确定T细胞单细胞以及T细胞/APC细胞对中T细胞的F-actin含量，以及免疫突触中F-actin所占百分比。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Esensten, J. H., Helou, Y. A., Chopra, G., Weiss, A., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD28+Costimulation%3A+From+Mechanism+to+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy.</a> Immunity. 44 (5), 973-988 (2016).</li>
<li>Samstag, Y., Eibert, S. M., Klemke, M., Wabnitz, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cytoskeletal+dynamics+in+T+lymphocyte+activation+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+leukocyte+biology%22%5BJournal%5D)">Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migration.</a> Journal of leukocyte biology. 73 (1), 30-48 (2003).</li>
<li>Samstag, Y., John, I., Wabnitz, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin%3A+a+redox+sensitive+mediator+of+actin+dynamics+during+T-cell+activation+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Cofilin: a redox sensitive mediator of actin dynamics during T-cell activation and migration.</a> Immunol Rev. 256 (1), 30-47 (2013).</li>
<li>Comrie, W. A., Burkhardt, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+and+Traction%3A+Cytoskeletal+Control+of+Receptor+Triggering+at+the+Immunological+Synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Action and Traction: Cytoskeletal Control of Receptor Triggering at the Immunological Synapse.</a> Front Immunol. 7, 68(2016).</li>
<li>Piragyte, I., Jun, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+engine+in+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Immune+Netw%22%5BJournal%5D)">Actin engine in immunological synapse.</a> Immune Netw. 12 (3), 71-83 (2012).</li>
<li>Rossy, J., Pageon, S. V., Davis, D. M., Gaus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+of+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy of the immunological synapse.</a> Curr Opin Immunol. 25 (3), 307-312 (2013).</li>
<li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+immunological+synapse+by+dual+color+time-gated+stimulated+emission+depletion+%28STED%29+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li>
<li>Comrie, W. A., Babich, A., Burkhardt, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F-actin+flow+drives+affinity+maturation+and+spatial+organization+of+LFA-1+at+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">F-actin flow drives affinity maturation and spatial organization of LFA-1 at the immunological synapse.</a> J Cell Biol. 208 (4), 475-491 (2015).</li>
<li>Markey, K. A., Gartlan, K. H., Kuns, R. D., MacDonald, K. P., Hill, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+immunological+synapse+between+dendritic+cells+and+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging the immunological synapse between dendritic cells and T cells.</a> J Immunol Methods. 423, 40-44 (2015).</li>
<li>Bouma, G., Burns, S. O., Thrasher, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wiskott-Aldrich+Syndrome%3A+Immunodeficiency+resulting+from+defective+cell+migration+and+impaired+immunostimulatory+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Wiskott-Aldrich Syndrome: Immunodeficiency resulting from defective cell migration and impaired immunostimulatory activation.</a> Immunobiology. 214 (9-10), 778-790 (2009).</li>
<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li>
<li>Dustin, M. L., Depoil, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+T+cell+synapse+from+single+molecule+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">New insights into the T cell synapse from single molecule techniques.</a> Nature reviews. Immunology. 11 (10), 672-684 (2011).</li>
<li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+views+of+the+human+NK+cell+immunological+synapse%3A+recent+advances+enabled+by+super-+and+high-resolution+imaging+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques.</a> Front Immunol. 3, 421(2012).</li>
<li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+generated+T+cell+receptor+microclusters+initiate+and+sustain+T+cell+activation+by+recruitment+of+Zap70+and+SLP-76%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76.</a> Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).</li>
<li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+LFA-1+cluster+formation+in+the+immune+synapse+requires+the+combined+activities+of+L-plastin+and+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Sustained LFA-1 cluster formation in the immune synapse requires the combined activities of L-plastin and calmodulin.</a> European journal of immunology. 40 (9), 2437-2449 (2010).</li>
<li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-plastin+phosphorylation%3A+a+novel+target+for+the+immunosuppressive+drug+dexamethasone+in+primary+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells.</a> Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).</li>
<li>Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((InFlow+microscopy+of+human+leukocytes%3A+A+tool+for+quantitative+analysis+of+actin+rearrangements+in+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse.</a> J Immunol Methods. , (2015).</li>
<li>Basiji, D., O'Gorman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 423, 1-2 (2015).</li>
<li>Wabnitz, G. H., Samstag, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+Characterization+of+Human+T-Cell+Immune+Synapses+by+InFlow+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiparametric Characterization of Human T-Cell Immune Synapses by InFlow Microscopy.</a> Methods Mol Biol. 1389, 155-166 (2016).</li>
<li>Balta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+and+quantitative+analysis+of+PMN%2FT-cell+interactions+by+InFlow+and+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Qualitative and quantitative analysis of PMN/T-cell interactions by InFlow and super-resolution microscopy.</a> Methods. , (2016).</li>
<li>Hochweller, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+control+T+cell+tonic+signaling+required+for+responsiveness+to+foreign+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells control T cell tonic signaling required for responsiveness to foreign antigen.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5931-5936 (2010).</li>
<li>Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+techniques+for+assaying+lymphocyte+activation+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action.</a> Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所展示的工作流程可实现对人T细胞（离体）与抗原呈递细胞（APCs）之间免疫突触的定量分析。值得注意的是，本研究采用红细胞裂解后的全白细胞作为T细胞来源，从而无需进行T细胞纯化步骤。B细胞淋巴瘤细胞系Raji被用作替代性抗原呈递细胞。这一策略具有显著优势，因其允许在不同供血者之间对免疫突触的T细胞侧进行比较。此外，自体树突状细胞（DCs）难以直接从外周人血中获取，而单核细胞来源的树突状细胞（moDCs）的制备需耗时数天，限制了其在临床研究中的应用。然而，本文所介绍的成像流式细胞术及分析策略亦可应用于其他类型的抗原呈递细胞（例如, 转分化中性粒细胞20此外，研究证明了CD4 T细胞与离体DCs之间的免疫突触9 或B细胞21 可利用成像流式细胞术对小鼠进行评估。因此，该方法可进一步拓展用于评估抗原呈递细胞功能，而不仅限于免疫突触中的T细胞侧。
该方法最关键的步骤是将泛白细胞与抗原呈递细胞在小体积中充分混合，并采用正确的设门策...

T细胞是适应性免疫系统的主要调节者，通过主要组织相容性复合体（MHC）呈递的抗原肽被激活。T细胞的完全激活需要两个信号：一是通过抗原特异性的T细胞受体（TCR）/CD3复合物传递的能力信号，二是通过辅助受体传递的共刺激信号。这两个信号均通过T细胞与抗原呈递细胞（APC）的直接相互作用而产生。成熟的APC通过MHC-肽复合物为T细胞激活提供能力信号，并表达共刺激配体（例如, CD80 或 CD86）以确保T细胞活化的进程1共刺激的一个重要功能是重组肌动蛋白细胞骨架2,3,4静息T细胞中的皮层F-actin相对稳定。通过携带抗原的抗原提呈细胞（APCs）刺激T细胞，可引起肌动蛋白细胞骨架的显著重排。肌动蛋白动态变化（即, 快速的肌动蛋白聚合/解聚循环使T细胞能够产生用于运输蛋白质或细胞器等物质的作用力。此外，肌动蛋白细胞骨架对于T细胞与抗原呈递细胞（APC）之间形成一种称为免疫突触的特殊接触区域至关重要。由于肌动蛋白细胞骨架在免疫突触中的重要作用，开发用于量化T细胞肌动蛋白细胞骨架变化的方法已成为必要。5,6,7,8,9.
通过肌动蛋白细胞骨架的协助，表面受体和信号蛋白在免疫突触内的超分子活化簇（SMACs）中被分隔开来。免疫突触的稳定性由受体与F-肌动蛋白束的结合来维持，这种结合增强了肌动蛋白细胞骨架的弹性。研究表明，免疫突触的形成对于适应性免疫应答的产生至关重要。免疫突触形成缺陷在体内的有害影响最早在患有Wiskott-Aldrich综合征（WAS）的患者中被发现，该疾病中肌动蛋白聚合以及随之而来的免疫突触形成均受到干扰10。WAS患者可能出现湿疹、严重反复感染、自身免疫性疾病以及黑色素瘤。尽管已有上述发现，目前尚不清楚健康个体与患有免疫缺陷或自身免疫性疾病的患者之间，其T细胞的免疫突触形成是否存在差异。
荧光显微镜技术，包括共聚焦显微镜、全内反射荧光显微镜（TIRF）以及超分辨率显微镜，已被用于揭示免疫突触的结构11,12,13,14。这些系统具有高分辨率，并可实现活细胞成像，从而能够获取免疫突触中肌动蛋白细胞骨架以及细胞表面或细胞内蛋白的精确时空信息。然而，许多研究结果仅基于对数十个T细胞的分析。此外，此类荧光显微镜实验必须使用纯化的T细胞。但对于许多研究问题而言，使用未纯化细胞的重要性远高于追求尽可能高的分辨率。这一点在分析患者来源的T细胞时尤为相关，因为捐献的血样量有限，且可能需要同时处理大量样本。
我们建立了可在人体系统中分析免疫突触内肌动蛋白细胞骨架的显微技术15,16,17。这些方法基于成像流式细胞术，也称为流内显微技术18。作为一种多光谱流式细胞术与荧光显微镜的结合技术，成像流式细胞术在分析异质性细胞群体（例如外周血中的泛白细胞）的形态学参数和蛋白质定位方面具有显著优势。我们此前提出了一种方法，能够直接利用全血样本中的人T细胞，定量分析T细胞与抗原呈递细胞（APC）形成的共轭结构中的F-肌动蛋白，而无需耗时且昂贵的细胞纯化步骤17。本文所展示的技术涵盖了从采集血液样本到定量免疫突触中F-肌动蛋白的完整实验流程。

<table><tbody><tr><td>&gt;Multifuge 3 SR</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>LifeTechnologies</td><td>#11875085</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Pan Biotech#3302-P101102</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯圆底管</td><td>Falcon</td><td>#352054</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>培养瓶</td><td>Thermo Scientific</td><td>#178883</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Roth</td><td>#8076.3</td><td></td></tr><tr><td>皂苷</td><td>Sigma</td><td>S7900</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#16005</td><td></td></tr><tr><td>FACS 洗涤皂苷缓冲液</td><td></td><td>PBS 1% BSA 0.15 Saponin</td><td></td></tr><tr><td>反应管</td><td>Sarstedt</td><td>72.699.002</td><td>0.5 mL</td></tr><tr><td>Speed Bead</td><td>Amnis</td><td>#400041</td><td></td></tr><tr><td>微量振荡器 MS1</td><td>IKA Works</td><td>&amp;nbsp;MS1</td><td></td></tr><tr><td>微孔板</td><td>Greiner Bio One</td><td>#650101</td><td>96U</td></tr><tr><td>肠毒素 SEB</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4881</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>1:3000</td></tr><tr><td>CD3-PeTxR</td><td>Invitrogen</td><td>MHCD0317</td><td>1:30</td></tr><tr><td>鬼笔环肽-AF647</td><td>Molecular Probes</td><td>A22287</td><td>1:150</td></tr><tr><td>IS100</td><td>Amnis</td><td></td><td>成像流式细胞仪</td></tr><tr><td>IDEAS</td><td>Amnis</td><td></td><td>软件</td></tr><tr><td>INSPIRE</td><td>Amnis</td><td></td><td>软件</td></tr></tbody></table>

利用成像流式细胞术对人类系统中免疫突触进行定性和定量分析

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

免疫突触是T细胞与抗原呈递细胞（APCs）之间进行通讯的区域。T细胞将表面受体和蛋白质极化至免疫突触，以确保稳定的结合和信号交换。传统共聚焦显微镜、全内反射荧光显微镜（TIRF）或超分辨率显微镜已被用于研究免疫突触。由于这些方法需要手动采集图像并进行耗时的定量分析，因此对稀有事件的成像具有挑战性。本文中，我们描述了一种可实现数万个细胞形态学分析的工作流程。免疫突触的形成发生于全白细胞制备物中的原代人T细胞与 金黄色葡萄球菌 载有肠毒素B（SEB）的Raji细胞作为抗原呈递细胞（APCs）。图像采集采用成像流式细胞术（也称为In-Flow显微镜），该技术结合了流式细胞仪和荧光显微镜的特性。文中提供了完整的设门策略，用于识别T细胞与抗原呈递细胞的结合体并分析免疫突触。由于该工作流程可在未纯化的全白细胞样本中分析免疫突触，因此仅需少量血液样本（即, 1 mL），可将其应用于患者样本。重要的是，可同时制备、测量和分析多个样本。

本文所述方法的一个主要目标是量化蛋白质富集（例如, F-肌动蛋白）在来自小体积（1 mL）人全血样本的未纯化泛白细胞中，由替代性抗原呈递细胞（Raji细胞）与T细胞之间形成的免疫突触中的分布。截图显示于 图1 概述了该方法的关键门控策略。左侧显示图像库，右侧显示分析区域（图1）。图像图库展示了“焦点”门控。图中所示主要为粒细胞和两对T细胞/抗原呈递细胞（APC）。在编号为30272的细胞对中，F-actin和CD3富集明显。用于定量此类富集细胞对数量的设门策略见分析区域，并在本方案（见步骤5.8）或其他文献中有详细描述。17,19分析区域中的最后一个散点图显示了免疫突触中CD3（x轴）和F-actin（y轴）的蛋白含量（蛋白百分比）。若超过30%的蛋白位于免疫突触掩膜范围内，则认为该蛋白在免疫突触中存在富集20. 用于展示富...

本文介绍了一种用于分析人原代T细胞与抗原呈递细胞之间免疫突触的定性和定量完整工作流程。该方法基于成像流式细胞术，可在相对较短的时间内获取并分析数千个细胞的图像。

免疫突触是T细胞与抗原呈递细胞（APCs）之间进行通讯的区域。T细胞会将表面受体和蛋白质极化……

该方法有助于解答人类免疫学领域的关键问题，例如白细胞在分子和细胞水平上如何进行相互通讯。该技术的主要优势在于，可在相对较短的时间内对外周血未经纯化的原代人类T细胞进行离体分析。本实验操作将由本实验室的技术员 Henning Kirchgessner 演示。首先，在50毫升锥形管中，将1毫升新鲜采集的人外周血与30毫升ACK裂解缓冲液混合。室温孵育8分钟后，用PBS加满试管，进行离心洗涤，并将沉淀重悬于2毫升培养基中，在37摄氏度下孵育60分钟。孵育结束后，在各FACS管中分别加入5 × 10⁵个金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）负载或未负载的Raji细胞，溶于500微升培养基中，随后加入650微升泛白细胞悬液。离心共培养物，将沉淀重悬于150微升新鲜培养基中，在37摄氏度下孵育45分钟。然后，在加入1.5毫升1.5%多聚甲醛的同时，以100转/分钟轻轻涡旋细胞10秒。室温下作用10分钟后，加入1毫升含1%BSA的PBS终止固定，并通过离心收集细胞。将沉淀重悬于 100 微升含 BSA 和 0.1% 皂苷的 PBS 中，并将细胞样品加入 96 孔 U 型底板的两个独立孔中。室温孵育 15 分钟后，离心平板，并将沉淀重悬于 50 微升含 BSA 和皂苷的 PBS 中，加入荧光标记的抗体或目标化合物，室温避光孵育 30 分钟。孵育结束后，用 150 微升含 BSA 和皂苷的 PBS 洗涤细胞三次，并将沉淀重悬于 60 微升 PBS 中。为了通过流式细胞术对细胞进行成像，首先打开分析软件，检查液体水平，然后在“仪器”菜单中点击“启动”。接着点击“加载”，并在提示时将样品加载到进样口。在“照明”选项卡下，将激发激光功率调整至适当的纳米长度。然后，调整第四通道和第十一通道的门控，并调整第一通道的区域。为评估门控和激光功率的设置，将“视图”菜单切换至相应的门控，调节门控和激光功率，直至细胞及细胞对清晰可见。接着，在“文件采集”选项卡中，设定样本名称、需采集的图像数量以及适用于CD3染色的门控，点击“采集”以开始图像获取。为了分析获取的细胞图像，请打开相应的分析软件。根据补偿下拉菜单中的说明，生成补偿矩阵，并将该矩阵保存为 comp date ctm。接着，打开一个原始图像文件，在窗口中应用 comp date ctm 以生成已补偿的图像以及默认的数据分析文件。打开补偿后的图像文件后，将图像转换为彩色模式。在图像库属性工具栏中调整查找表，以获得最佳的可见颜色。在分析菜单中打开掩膜管理器，通过为第五通道选择60%阈值掩膜并填充掩膜，定义T细胞，从而生成T细胞掩膜。接下来，为第二通道选择宽度为三像素的谷值掩膜（Valley mask），以生成谷值掩膜，并将T细胞掩膜与谷值掩膜合并，创建T细胞突触掩膜。为计算T细胞中总的CD3表达量，打开特征管理器（Feature Manager），创建特征：强度、T细胞、第五通道。为计算T细胞中F-actin的总量，创建特征：强度、T细胞、第六通道。为了评估免疫突触中CD3的含量，创建特征：强度、T细胞突触、通道五。为了确定免疫突触中F-actin的含量，创建特征：强度、T细胞突触、通道六。最后，为了定义F-actin和CD3的富集程度，分别计算免疫突触中F-actin或CD3的比值与所选蛋白的总表达量的比值。这些图展示了利用小体积人血样本中未纯化的全白细胞，对替代性抗原呈递细胞（APCs）与T细胞之间免疫突触内蛋白质富集进行定量分析的关键设门策略概览。此处显示的是在无SEB存在时，T细胞-APC共轭复合物在免疫突触内CD3和F-actin水平较低的代表性图像；而在SEB存在时，这些T细胞-APC共轭复合物在免疫突触处表现出明显的CD3和F-actin富集。在无超抗原存在时，15%的T细胞在免疫突触处表现出CD3和F-actin的共富集，而在超抗原存在时，该比例达到29%。事实上，在缺乏超抗原的情况下，细胞中少于20%的总F-肌动蛋白在免疫突触处聚集，而在存在超抗原时，该比例超过30%。值得注意的是，即使在无超抗原的情况下，CD3也能在免疫突触处聚集，尽管加入超抗原后其聚集程度显著增加，这表明该方法适用于定量分析T细胞-抗原提呈细胞免疫突触处的蛋白质聚集情况。一旦掌握，该技术若操作得当，可在6至7小时内完成。在进行该操作时，重要的是要包含所有相关的对照，包括不含超抗原的样本，因为即使使用不含SEB的抗原呈递细胞，也会发生蛋白质富集。完成该操作后，可进一步采用超分辨率显微镜等其他方法，以探究免疫突触精细结构的相关问题。该技术建立后，为细胞通讯领域的研究人员探索人类免疫突触的结构与功能奠定了基础，推动了基础研究、临床试验及转化医学的发展。观看本视频后，您应能够充分理解如何在体外分析人T细胞中T细胞与抗原呈递细胞之间的连接区域及免疫突触。请务必注意，操作原代人源材料可能存在生物安全风险，因此在进行本实验时，应始终采取相应预防措施，例如佩戴手套或在生物安全二级条件下操作。

qualitative-quantitative-analysis-immune-synapse-human-system-using

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

影像性流式细胞仪对人体免疫突触的定性和定量分析

本方案详细介绍了如何通过免疫细胞化学方法，在分离的神经元培养物和脑切片中定量突触数量。利用特定区室的抗体，我们标记突触前终末以及突触后特化位点。我们将突触定义为这些标记物产生的信号之间共定位的位点。...

量化突触：一种基于免疫细胞化学的突触数量检测方法

我们介绍了ImageStream技术（www.amnis.com）的应用，该技术结合了定量流式细胞术与同步高分辨率数字成像，用于量化来自明确定义的患者队列的原代免疫细胞的细胞机制。我们的研究为转化研究提供了蓝图，可用于量化来自受试者队列小样本中谱系特异性的细胞反应。...

从小份人血样本中单核细胞和树突状细胞谱系特异性Toll样受体介导信号通路的定量成像

该视频分析了未纯化的全白细胞制剂中T细胞之间免疫突触的形成 金黄色葡萄球菌...

利用成像流式细胞术分析人T细胞与SEB负载的Raji细胞之间的免疫突触

来源： Hidmark, A. S., 等. 利用流式细胞术分析单只小鼠单侧坐骨神经和背根神经节中的免疫细胞. J. Vis. Exp. (2017).

利用流式细胞术分析小鼠神经系统组织中的免疫细胞

炎症在缺血性脑卒中的发病机制中起着核心作用。越来越多的证据表明，炎症具有双重作用：一方面会加剧早期脑损伤，另一方面也参与后期的修复过程。本方案描述了从缺血脑组织中分离免疫细胞，并对其进行后续流式细胞术表型分析的方法。...

从小鼠缺血脑组织中分离免疫细胞及其流式细胞术分析

为了研究T细胞免疫突触中丝状肌动蛋白的流动速度和方向性，将活细胞超分辨率成像与全内反射荧光技术相结合，并利用时空图像相关光谱法进行定量分析。...

基于结构化照明显微镜数据的时空图像相关光谱法量化T细胞中的皮层肌动蛋白流

本方案用于成像免疫突触的形成过程以及随后向免疫突触定向的分泌性物质运输。细胞 conjugates 由经超抗原刺激的 Raji 细胞（作为抗原呈递细胞）与 Jurkat 克隆细胞（作为效应辅助性 T...

成像人类免疫突触

从分离的植入物中提取细胞，并通过流式细胞术对其进行表征，可显著促进对植入物免疫应答模式的理解。本文描述了一种从分离的植入物中精确分离细胞并进行染色以用于流式细胞分析的方法。...

高维流式细胞术用于分离的植入物组织免疫功能分析

本文介绍了两种利用流式细胞术定量分析小胶质细胞吞噬vGLUT1阳性突触以及pHRodo Red标记的粗制突触体的实验方案。...

利用流式细胞术定量小胶质细胞对突触物质的吞噬作用

本文将详细介绍使用流式细胞术在固定细胞和活细胞中检测钙蛋白酶活性的实验方案。...

通过流式细胞术测量固定和活细胞中的钙蛋白酶活性

学习使用影像性流式细胞仪对人体T细胞与抗原呈递细胞之间的免疫突触进行定性和定量分析的方法。该技术可在短时间内对未纯化的人外周血T细胞进行离体分析，为免疫学研究提供重要工具。

利用成像流式细胞术对人类系统中免疫突触进行定性和定量分析

探索更多视频