影像性流式细胞仪对人体免疫突触的定性和定量分析

这种方法可以帮助回答人类免疫学领域的关键问题，例如白细胞之间在分子和细胞水平上如何进行交流。该技术的主要优点是，未净化的人类T细胞可以在相对较短的时间内分析外体。演示这个程序将是海宁基希格斯纳，一个技术人员从我们的实验室。

首先将一毫升新鲜绘制的人类外周血液与 30 毫升的 ACK 解结缓冲液混合在 50 毫升锥形管中。在室温下8分钟后，用PBS填充管内进行离心洗涤，并在培养培养的两毫升中重新灌装颗粒，在37摄氏度下孵育60分钟。在孵育结束时，将五倍10的金黄色葡萄球菌肠毒素B或SEB加载或卸载Raji细胞在培养基的500微升到单独的FACS管，其次是650微升的泛白细胞。

将共培养物向下旋转，并在150微升新鲜培养培养的颗粒中重新暂停，在37摄氏度下进行45分钟的孵育。然后，在100转/分时轻轻旋转细胞10秒，同时加入1.5毫升1.5%的甲醛。在室温下10分钟后，停止用1%BSA补充的1毫升PBS进行固定，通过离心收集细胞。

将颗粒重新在 100 微升 PBS 加 BSA 和 0.1% 皂素中，并将细胞样本添加到 96 孔 U 底板的两个单独孔中。在室温下15分钟后，将板离心，将颗粒重新在PBS加BSA和皂素的50微升中，含有氟磷结合抗体或感兴趣的化合物，在室温下在黑暗中孵育30分钟。在孵育结束时，在150微升PBS加BSA和皂素中清洗细胞三次，并在60微升PBS中重新暂停颗粒。

要通过流式细胞图对细胞进行成像，请打开分析软件，检查液位，然后单击"仪器"菜单中的"启动"。接下来，单击"加载"，并在提示时将示例加载到端口中。在"照明"选项卡下，将激发激光功率更改为适当的纳米长度。

然后，调整通道 4 和 11 的门，并调整通道 1 的面积。要评估浇注和激光功率调整，请将 View 菜单切换到相应的门，并调整门和激光功率，直到细胞和细胞对子可见。然后，在"文件采集"选项卡中，定义样本名称和要采集的图像数以及 CD3 染色的适当门，然后单击"获取"以开始采集。

要分析获取的细胞图像，请打开相应的分析软件。按照"补偿"下拉列表中的说明，生成补偿矩阵，然后将矩阵另存为复合日期 ctm。接下来，打开一个原始图像文件示例，并在窗口中应用竞争日期 ctm 以生成补偿图像和默认数据分析文件。

打开补偿图像文件后，将图像转换为颜色模式。调整查找表以在"图像库属性"工具栏中获得最佳可见颜色。打开"分析"菜单中的掩码管理器，然后通过为通道 5 选择 60% 阈值蒙版并填充蒙版以创建 T 单元格蒙版来定义 T 单元格。

接下来，为宽度为三个像素的通道 2 选择"谷"蒙版以创建谷蒙版，并组合 T 单元格和谷面膜以创建 T 单元格突触蒙版。要计算 T 单元格中的 CD3 表达式总数，请打开特征管理器并创建特征强度、T 单元格、通道 5。要计算 T 单元格中的 F-actin 总量，请创建特征强度、T 细胞、通道 6。

要评估免疫突触中的 CD3 量，请创建功能强度、T 细胞突触、通道五。要确定免疫突触中的F-actin的量，请创建功能强度、T细胞突触、通道六。最后，要定义F-actin和CD3富集，分别计算免疫突触中的F-actin或CD3的比例和所选蛋白质的总表达。

在这些图表中，概述了从低体积人类血液样本中取出的未纯泛白细胞中未纯的泛白细胞之间，用于量化免疫突触中蛋白质富集的关键浇注策略。这里显示了在没有SEB的情况下，其免疫突触内具有低水平CD3和F-actin的T细胞-APC结合的代表性图像，而这些T细胞-APC结合体在SEB存在的情况下表现出强大的CD3和F-actin浓缩。在没有超抗原的情况下，15%的T细胞在免疫突触时表现出CD3和F-actin的富集，而29%的富集在超抗原的存在下观察到。

事实上，在没有超抗原的情况下，细胞中总F-actin的不到20%在免疫突触中积累，超过30%在超抗原存在的情况下在突触中观察到。值得注意的是，CD3即使没有超级抗原，也会在免疫突触中积累，尽管这种积累也因添加超抗原而显著增加，这证明这种方法在T细胞-APC免疫突触中量化蛋白质积累是适合的。一旦掌握，这项技术可以在六到七小时内完成，如果执行得当。

在尝试此过程时，必须记住包括所有相关的控制措施，包括无超抗原的样品，因为如果使用无 SEB 的 APC，也会发生蛋白质富集。按照这个程序，可以执行其他方法，如超分辨率显微镜，以回答有关免疫突触的精细结构的其他问题。这项技术开发后，为细胞通信领域的研究人员探索人体免疫突触进行基础研究、临床试验和转化科学铺平了道路。

看完这段视频后，您应该对如何分析T细胞-APC连接区和人类T细胞外体中的免疫突触有一个很好的理解。不要忘记，使用初级人体材料可能是危险的，在执行此过程时，应始终采取预防措施，如戴手套或在生物安全二级条件下工作。