利用成像流式细胞术对人类系统中免疫突触进行定性和定量分析

该方法有助于解答人类免疫学领域的关键问题，例如白细胞在分子和细胞水平上如何进行相互通讯。该技术的主要优势在于，可在相对较短的时间内对外周血未经纯化的原代人类T细胞进行离体分析。本次实验操作将由本实验室的技术员 Henning Kirchgessner 演示。

首先，在50毫升锥形管中将1毫升新鲜采集的人外周血与30毫升ACK裂解缓冲液混合。室温孵育8分钟后，用PBS加满锥形管，进行离心洗涤，并将沉淀重悬于2毫升培养基中，在37摄氏度下孵育60分钟。孵育结束后，在各FACS管中分别加入5 × 10⁵个金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）负载或未负载的Raji细胞，溶于500微升培养基中，随后加入650微升泛白细胞悬液。

将共培养物离心，将沉淀重悬于150微升新鲜培养基中，在37摄氏度下孵育45分钟。然后，在加入1.5毫升1.5%多聚甲醛的同时，以100 rpm轻轻涡旋细胞10秒。室温下反应10分钟后，加入1毫升含1% BSA的PBS终止固定，并通过离心收集细胞。

将沉淀重悬于 100 微升含 BSA 和 0.1% 皂苷的 PBS 中，并将细胞样品加入 96 孔 U 型底板的两个独立孔中。室温孵育 15 分钟后，离心平板，并将沉淀重悬于 50 微升含 BSA 和皂苷的 PBS 中，加入荧光标记的抗体或目标化合物，避光室温孵育 30 分钟。孵育结束后，用 150 微升含 BSA 和皂苷的 PBS 洗涤细胞三次，并将沉淀重悬于 60 微升 PBS 中。

为了通过流式细胞术对细胞进行成像，首先打开分析软件，检查液体液位，然后在仪器菜单中点击启动（Startup）。接着点击加载（Load），并在提示时将样品加载到进样口。在照明（Illumination）选项卡下，将激发激光功率调整至适当的纳米波长长度。

然后，调整第四通道和第十一通道的门控，并调整第一通道的区域。为评估门控和激光功率的设置，将“视图”菜单切换至相应的门控，调节门控和激光功率，直至细胞及细胞对清晰可见。接着，在“文件采集”选项卡中，定义样本名称、需采集的图像数量以及适用于CD3染色的门控，然后点击“采集”以开始采集。

为了分析获取的细胞图像，请打开相应的分析软件。根据补偿下拉菜单中的说明，生成补偿矩阵，并将该矩阵保存为 comp date ctm。接着，打开一个原始图像文件，在窗口中应用 comp date ctm 以生成已补偿的图像以及默认的数据分析文件。

打开经过补偿的图像文件后，将图像转换为彩色模式。在图像库属性工具栏中调整查找表，以获得最佳的可见颜色。在分析菜单中打开掩膜管理器，通过为第五通道选择60%阈值掩膜并填充该掩膜，定义T细胞，从而生成T细胞掩膜。

接下来，为第二通道选择宽度为三像素的谷值掩膜（Valley mask），以生成谷值掩膜，并将T细胞掩膜与谷值掩膜合并，创建T细胞突触掩膜。为计算T细胞中总的CD3表达量，打开特征管理器（Feature Manager），创建特征：强度、T细胞、第五通道。为计算T细胞中F-actin的总量，创建特征：强度、T细胞、第六通道。

为了评估免疫突触中CD3的含量，创建特征：强度、T细胞突触、通道五。为了确定免疫突触中F-actin的含量，创建特征：强度、T细胞突触、通道六。最后，为了定义F-actin和CD3的富集程度，分别计算免疫突触中F-actin或CD3的比值与所选蛋白总表达量的比值。

在这些图表中，展示了利用小体积人血样本中未经纯化的全白细胞，分析替代性抗原呈递细胞（APCs）与T细胞之间免疫突触内蛋白质富集情况的关键设门策略概览。此处显示的是在无SEB存在时，T细胞-APC共轭复合物在免疫突触内CD3和F-actin水平较低的代表性图像；而在SEB存在时，这些T细胞-APC共轭复合物显示出明显的CD3和F-actin富集。在无超抗原存在时，15%的T细胞在免疫突触处表现出CD3和F-actin的共富集，而在超抗原存在时，该比例达到29%。

事实上，在缺乏超抗原的情况下，细胞中少于20%的总F-actin在免疫突触处聚集，而在存在超抗原时，该比例超过30%。值得注意的是，即使在缺乏超抗原的情况下，CD3也能在免疫突触处聚集，尽管添加超抗原后其聚集程度显著增加，这表明该方法适用于定量分析T细胞-抗原呈递细胞免疫突触处的蛋白质聚集情况。一旦掌握，若操作得当，该技术可在六至七小时内完成。

在进行该实验操作时，重要的是要记得包含所有相关的对照，包括不含超级抗原的样本，因为即使使用不含SEB的抗原呈递细胞（APCs），也会发生蛋白质富集现象。完成该操作后，可进一步采用其他方法，如超分辨率显微镜技术，以探究免疫突触精细结构的相关问题。该技术建立后，为细胞通讯领域的研究人员探索人类免疫突触的机制奠定了基础，推动了基础研究、临床试验以及转化医学的发展。

观看本视频后，您应能够充分理解如何在人源T细胞离体条件下分析T细胞-抗原呈递细胞连接区及免疫突触。请务必注意，操作原代人源材料可能存在生物危害，因此在进行本实验操作时，应始终采取相应预防措施，例如佩戴手套或在生物安全二级条件下操作。