在胚胎小鼠心脏采用免疫荧光心肌发展分析

该程序的总体目标是评估发育中的胚胎小鼠心脏中的肌膜和心肌细胞成熟。这是通过首先在切割培养基中定位和冷冻胚胎心脏来实现的。接下来，以正确的方向对心脏进行冷冻切片。

然后心脏切片对目标蛋白质进行免疫荧光标记。最后，对心脏切片进行免疫染色的共聚焦显微镜检查。最终，二维和三维图像分析用于显示 MyFi 和其他心肌细胞结构的发育。

这种方法可以帮助回答心脏发育领域的关键问题，例如突变和心脏基因如何影响 MyFi 组装以及特定结构（如插销盘和客户）的出现。为了快速冷冻胚胎心脏，请使用最佳切割温度或 OCT 培养基在化学罩中填充 3.5 厘米的培养皿。凉。液氮中有两个甲基丁烷。

根据文本方案分离小鼠胚胎心脏后，将心脏放入 OCT 中并让它们平衡几秒钟，然后将它们转移到含有 OCT 的 7 毫米模具中。将心脏的内壁定向到模具的底部。将模具轻轻放入液氮冷却的二甲基丁烷中。

注意不要让两个甲基丁烷液体接触 OCT 或心脏冻结，直到 OCT 呈纯白色。然后将模具转移到装有干冰的冰桶中。将所有心脏冷冻后，将冷冻模具包裹在铝箔中，并在零下 80 摄氏度下储存，直到准备好冷冻切片。

为了固定胚胎心脏，使用 PBS 中的 4% PFA 填充 12 箔培养板的孔。根据文本方案解剖胚胎心脏后，将每个心脏放入 PFA 孔中并在 4 摄氏度下固定过夜要使用塑料移液管对心脏进行冷冻保护，请将每个心脏移至含有 1.5 毫升 15% 蔗糖的 PBS 溶液的 1.5 毫升微量离心管中，并在 4 摄氏度下轻轻搅拌，直到心脏沉入管底部。将每个心脏转移到 PBS 中的 30% 蔗糖中，并在 4 摄氏度下轻轻搅拌，直到心脏沉到管底。

如本视频前面所示，在 OCT 中冷冻胚胎。将低温模具放入低温恒温器室并等于零下 17 摄氏度后，倒置低温模具并使用温和的压力将心脏阻滞从模具中排出。将心脏前壁定向到模制组织块的顶部。

将一大滴 OCT 滴到卡盘上，然后将心形块安装到 OCT 滴剂上。保持方向，使心脏前壁离卡盘最远。让心脏冻结在卡盘上。

将卡盘和安装的心形块加载到低温恒温器物体支架上。调整，使刀片的角度相对于样品成 3 到 5 度。将 10 微米切片收集到已用带正电荷的涂层预处理的显微镜载玻片上。

让样品完全干燥，然后在零下 80 摄氏度下储存以进行免疫荧光。从切片中固定和/或去除 OCT 后，使用用 PBS 稀释的 1 x 封闭缓冲液轻轻摇晃封闭 45 分钟。如果使用小鼠产生的一抗，则加入驴或山羊抗小鼠 IgG H 加 L 单价 FAB 片段，在 PBS 0.1%吐温 20 中稀释 1 至 100 次，并在室温下轻轻摇动孵育 45 分钟。

加入一抗或在 1 x 封闭缓冲液中稀释的抗体，并在室温或 4 摄氏度下孵育 2 小时过夜。孵育后，使用一个 XPBS 洗涤切片 3 次，每次 10 分钟。在室温下，将 addor 偶联的二抗在封闭缓冲液中稀释 1 至 500 稀释到样品中，并在避光孵育 2 小时。

在室温下，使用一个 XPBS 在室温下避光洗涤切片 3 次，每次 10 分钟。在载玻片的每一端滴入两滴培养基，将载玻片安装在抗褪色培养基上，并使用盖玻片盖上。使用指甲油密封盖玻片。

将其存放在 4 摄氏度下，避光，直到准备好成像。使用 4 倍物镜和激光荧光，找到样品和感兴趣区域。捕获图像以用作地图。

以高放大倍率成像时。移除载玻片，对载玻片台进行最小调整。然后更换为 60 x 油浸物镜。

在物镜上滴一小滴油，然后将载玻片放回载玻片台上。接下来，再次找到样品，将激光功率曝光时间和像素合并设置为每个通道所需的水平。根据文本方案的指南确定最佳设置后，对实验中的所有组织切片使用样品设置。

使用强度直方图记录每个通道的最佳强度范围，该范围将用于分析。通过选择合适的激光通道，使用采集功能生成 Zack。然后选择 Z 堆栈的上限和下限。

选择"Zack 步长"，该大小是软件提供的光学切片厚度值的一半。单击运行以使用 Fiji 或类似的影像分析程序收集影像。使用自定义颜色模式选项打开 Zack 文件，通道拆分为单独的窗口。

从图像下拉菜单中，打开 adjust brightness contrast 工具，并在每个通道中设置最佳直方图强度范围。如前所述，将这些通道范围应用于正在分析的所有 Zack。然后从图像颜色下拉菜单中，将各个通道合并为单个合成图像。

使用图像的 Stacks Z 项目菜单，从合成图像创建拼合的 Z 堆栈。由于此图像将比 3D 图像亮得多，因此请调整对照样品的直方图强度范围以避免过度饱和，并将相同的设置应用于实验扁平化 Zack要生成 3D 图像，请首先选择图像堆栈 3D 项目菜单。选择旋转的 x 轴或 Y 轴。

将切片间距设置为与 Z 堆栈步长相同的微米数。选择所需的总旋转量，并将旋转角度增量设置为 1。然后从插件下拉菜单中打开图像 J 3D 查看器。

选择合成图像生成的显示作为体积，并将重采样因子设置为 1 或 2。这些图显示了在速冻、丙酮固定心脏、抗 S α 肌动蛋白抗体可重现标记的 Z 椎间盘以及具有高特异性和最小背景的插生椎间盘中对不同蛋白质进行 cos 染色的典型结果。抗粘附连接蛋白 β-catenin 的抗体结合心肌细胞和非心肌细胞的膜，并与 SFA 肌动蛋白共定位发生在 E 16.5 β 1 的假定间盘中胚胎心脏中的整合素免疫荧光特别具有挑战性，但这些研究中的 beta 1 整合素染色显示信号与 SFA 肌动蛋白标记的 Z 盘具有相同的周期性， 可能反映了在 E 16.5 处形成的新生客户。

在 E 12.5 时，SFA 肌动蛋白和原丝菌素染色模式在小梁心肌细胞中显示出规则的周期性，与外紧凑区的成熟肌原纤维一致，SFA 肌动蛋白更点状而不是线性，对层肌球蛋白信号是弥漫性的而不是线性的 NCA 粘附染色，E 12.5 心脏的小梁心肌细胞与强烈的 SFA 肌动蛋白染色区域共定位，可能代表间间盘。此处显示的是来自生命行为 RFP Ruby 转基因小鼠的 PFA 固定的 E 12.5 胚胎心脏，标记有 SFA 肌动蛋白和丝状肌动子。与快速冷冻心脏切片相比，SFA 肌动蛋白信号噪比降低。

三维图像重建显示，心肌细胞内的 MyFi 彼此大致平行，但单个心肌细胞相对于彼此的角度不同。观看本视频后，您应该对如何正确定位和冷冻胚胎心脏，以及进行免疫染色、共聚焦显微镜和图像分析以评估小鼠心脏发育过程中的 MyFi 和心肌细胞成熟有很好的了解。承认。