Name: 在胚胎小鼠心脏采用免疫荧光心肌发展分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: 了解免疫荧光技术在小鼠胚胎心脏心肌发育研究中的应用。该方法通过冷冻切片和共聚焦显微镜成像，可评估肌原纤维成熟过程，为先天性心脏缺陷研究提供高分辨率结构分析工具。

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作者感谢 Hilary Clay 博士、Stephen Wilson 博士、Anna Payne-Tobin 博士和 James Smyth 博士提供的有益讨论。显微成像工作在加利福尼亚大学旧金山分校心血管研究所影像核心设施完成。本研究由美国国立卫生研究院资助项目 K08 HL105657（LDW）和 NIH HL65590（SRC）支持。

注意：所有实验操作均经加州大学旧金山分校（UCSF）机构动物照护与使用委员会批准。
1. 胚胎小鼠心脏的冷冻保存与固定。
1.1）胚胎心脏的速冻
<ol>
	<li>用最佳切割温度（Optimal Cutting Temperature, OCT）包埋剂填充一个3.5 cm的培养皿和7 mm的冷冻模具（见材料表）。在化学通风橱中，将2-甲基丁烷置于液氮中冷却。</li>
	<li>将30 ml磷酸盐缓冲液（PBS）加入10 cm培养皿中，将10 ml PBS加入3.5 cm培养皿中，并将所有培养皿置于冰上。每只怀孕小鼠准备一个10 cm培养皿和多个3.5 cm培养皿。</li>
	<li>按照先前所述方法分离胚胎15，解剖过程在冰上预冷的PBS中进行。</li>
	<li>使用CO2麻醉结合颈椎脱位法对怀孕雌鼠实施安乐死。
	<ol>
		<li>在腹部做切口，沿子宫内侧弯曲处切断血管，取出子宫，并将其转移至含有冰上预冷PBS的10 cm培养皿中。</li>
		<li>在每只胚胎之间剪开子宫，将各胚胎分别转移至含有冰上预冷PBS的3.5 cm培养皿中。按文献15所述方法分离每个胚胎。</li>
		<li>使用精细镊子打开心包腔，于主动脉、下腔静脉和肺静脉处剪断，将心脏从肺组织和血管系统中分离，并转移至含有OCT的3.5 cm培养皿中。</li>
		<li>让心脏在OCT中平衡数秒，然后将其转移至装有OCT的7 mm模具中。将心脏的前壁朝下放置于模具底部。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将模具轻轻放入液氮冷却的2-甲基丁烷中。注意避免2-甲基丁烷液体接触OCT或心脏。冷冻至OCT呈完全不透明的白色后，将模具转移至装有干冰的冰桶中。接着处理下一个胚胎。</li>
	<li>用铝箔包裹冷冻模具，于-80 °C保存，直至进行冷冻切片。</li>
</ol>
1.2）替代方法：多聚甲醛（PFA）固定、冷冻保护及OCT包埋胚胎心脏
<ol>
	<li>在12孔细胞培养板的各孔中加入含4%多聚甲醛（PFA）的1× PBS溶液。</li>
	<li>按照1.1.3节所述方法分离胚胎心脏，将每颗心脏放入含有4% PFA的孔中，于4 °C过夜固定。</li>
	<li>冷冻保护：使用塑料移液器将每颗心脏转移至含有1.5 ml PBS配制的15%蔗糖溶液的1.5 ml微量离心管中，于4 °C轻轻振荡，直至心脏沉至管底（数小时至过夜）。再将每颗心脏转移至含有1.5 ml PBS配制的30%蔗糖溶液的1.5 ml微量离心管中，于4 °C再次轻轻振荡，直至心脏沉至管底（数小时至过夜）。</li>
	<li>使用塑料移液器将完成冷冻保护的心脏转移至OCT包埋剂中，静置数分钟以去除多余的蔗糖溶液，随后将心脏转移至含有OCT的7 mm模具中，并使心脏的前壁朝向模具底部。</li>
	<li>通过将模具置于液氮冷却的2-甲基丁烷或干冰中，使心脏在OCT中快速冷冻。</li>
	<li>用铝箔包裹冷冻模具，于-80 °C保存，直至进行冷冻切片。</li>
</ol>
2. 冷冻切片
<ol>
	<li>将冷冻切片机温度设置为 -17 °C。</li>
	<li>将冷冻模具放入冷冻切片机腔室，并在该温度下平衡 15–20 分钟。</li>
	<li>将冷冻模具倒置，轻轻施压使心脏组织块从模具中脱出。调整方向，使心脏的前壁朝向组织块的顶部。</li>
	<li>在样品头（chuck）上滴加一大滴OCT包埋剂，将心脏组织块置于OCT液滴上，使其冻结固定在样品头上。保持组织块方向，使心脏前壁距离样品头最远。</li>
	<li>将装有组织块的样品头安装到冷冻切片机的样品架上。调整角度，使刀片与样品之间的夹角为 3–5°。</li>
	<li>将厚度为 10 µm 的切片收集到预先涂有正电荷涂层的载玻片上（见材料表）。待切片完全干燥后，于 -80 °C 保存。</li>
</ol>
3. 免疫荧光
<ol>
	<li>对于速冻切片，在通风橱中室温下用丙酮固定并透化组织 10 分钟。</li>
	<li>对于速冻切片和 PFA 固定切片，在 PBS-0.1% Triton X-100 中孵育 20 分钟，以去除 OCT 包埋剂，并对 PFA 固定切片进行透化处理。</li>
	<li>用 PBS 稀释的 1× 封闭缓冲液封闭 45 分钟。</li>
	<li>若使用小鼠来源的一抗，于室温下用驴或山羊抗小鼠 IgG (H+L) 单价 Fab 片段按 1:100 比例稀释于 PBS-0.1% Tween 20 中孵育 45 分钟（见讨论部分）。</li>
	<li>将切片与用 1× 封闭缓冲液稀释的一抗或多种一抗在室温下孵育 2 小时，或在 4 °C 过夜（具体稀释比例见材料/设备表）。</li>
	<li>在 1× PBS 中于室温下洗涤切片三次，每次 10 分钟。</li>
	<li>在避光条件下，用封闭缓冲液按 1:500 比例稀释 Alexa Fluor 标记的二抗，室温孵育 2 小时。</li>
	<li>在避光条件下，于室温下用 1× PBS 洗涤切片三次，每次 10 分钟。</li>
	<li>可选步骤：在避光条件下，用 PBS 按 1:2,000 比例稀释 Hoechst 染料，室温孵育以标记细胞核，随后用 PBS 漂洗。</li>
	<li>用 1% PFA 在室温下对已标记的切片进行后固定，持续 1 分钟。</li>
	<li>将防荧光淬灭封片剂滴加两滴于载玻片两端，覆盖盖玻片进行封片（若细胞核尚未标记，可选用含 DAPI 的封片剂）。用指甲油密封盖玻片，避光保存于 4 °C，待成像时取出。</li>
</ol>
4. 共聚焦成像与图像分析
<ol>
	<li>打开相应的激光波长、相机和共聚焦显微镜，包括载物台移动器和 z 轴电机。启动成像软件程序。分别使用 405、488 和 561 激光波长对 Hoechst、Alexa 488 和 Alexa 568 染色的切片进行成像。 
	注意：硬件和软件规格详见材料表。</li>
	<li>将对照玻片（对于倒置显微镜，盖玻片朝下）安装到载物台上。</li>
	<li>使用 4X 物镜（参见材料表），找到样本及感兴趣的区域。拍摄图像，作为高倍成像时的定位参考图。</li>
	<li>取下玻片，尽量减少对载物台的调整。更换为 60 倍油浸物镜（参见材料表），在物镜上滴加少量镜油，然后将玻片（盖玻片朝下）重新放回载物台。</li>
	<li>再次找到样本。为每个通道设置所需的激光功率、曝光时间和二分之一像素合并（binning）参数。 
	注意：我们通常使用 0.8 的激光功率、100 毫秒的相机曝光时间以及 2 的像素合并值（硬件和软件规格详见材料表）；每个实验的最佳设置需通过实验确定。
	<ol>
		<li>确定最佳设置后，在同一实验中的所有组织切片均应使用相同的设置。使用强度直方图记录每个通道的最佳强度范围（该信息将用于后续分析）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用采集功能生成 z 轴层扫图像（z stack）：选择适当的激光通道，然后设定 z stack 的上下限。选择 z stack 步长，其值应为软件提供的光学切片厚度的一半。点击“运行”以采集图像。</li>
	<li>使用 Fiji16 或类似程序进行图像分析。在 Fiji 中，以自定义颜色模式打开 z stack 文件，并将各通道拆分为独立窗口。从图像下拉菜单中打开“调整亮度/对比度”工具；在每个通道中设置步骤 4.5.1 确定的最佳直方图强度范围。将这些通道范围应用于所有待分析的 z stack 图像。</li>
	<li>使用图像-&#62;颜色下拉菜单将各个通道合并为单一的复合图像。</li>
	<li>使用图像-&#62;堆栈-&#62;z 投影菜单，从复合图像生成一个投影后的平面 z stack 图像。该图像将明显比三维图像更亮；调整对照样本的直方图强度范围以避免过饱和，并将相同设置应用于实验组的平面 z stack 图像。</li>
	<li>要生成三维图像，首先使用图像-&#62;堆栈-&#62;3D 投影菜单17。选择 x 轴或 y 轴作为旋转轴。将切片间距设置为与 z stack 步长相同的微米数值。选择所需的总旋转角度，并将旋转角度增量设为 1。然后从插件下拉菜单中打开 Image J 3D Viewer。选择步骤 4.8 中生成的复合图像，以“体积”模式显示，并将重采样因子设为 1 或 2。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

每种抗体的最佳组织固定方法和稀释比例必须通过实验经验确定。在我们的实验中，对于多种心肌细胞抗原（包括 s-α-肌动蛋白结合蛋白、β-连环蛋白、β1-整合素、原肌球蛋白、踝蛋白（未展示）和 N-钙黏蛋白），快速冷冻法优于多聚甲醛（PFA）固定；相比之下，PFA 固定对黏着斑激酶（未展示）的检测效果更佳。PFA 形成的蛋白质交联可能遮蔽抗原表位，限制抗体结合；此类情况可能需要进行抗原修复，相关方法可参见其他文献20。可通过降低 PFA 浓度或缩短固定时间以减少表位遮蔽，每种抗体及不同发育阶段的最佳条件均需通过实验经验确定。在鉴定新抗体或心脏突变体时，应使用适当的阴性对照，包括以免疫前血清作为一抗对照，以及“无一抗”对照。使用基因敲除小鼠是理想的阴性对照，但许多本研究涉及的基因产物因早期致死性而无法获得相应敲除小鼠。
使用足够的体积将实验组和对照组切片完全浸没在相同的免疫荧光封闭液、抗体溶液和洗涤液中至关重要，同时在孵育过程中需轻轻摇动切片，以确保组织切片与溶液充分均匀接触。该方法可最大限度地减少同一批实验中不同切片及切片间染色的技术变异。当抗体溶液的用量受限于成本时，可使用Pap笔在组织切片周围划线以限制溶液扩散，并在长时间孵育期间将切片置于湿化孵育盒中。若使用的是小鼠单克隆一抗（因此需使用抗小鼠二抗），则需要进行第二次封闭步骤（步骤3.4），以封闭内源性小鼠免疫球蛋白，降低非特异性背景信号。
适当的显微镜技术和图像处理技术对于获得生物学上准确的信息至关重要21。强度直方图表示每种颜色在每个强度水平（对于16位图像为0–65535个级别）上的像素分布情况。通过设置围绕直方图峰值的强度显示范围，可以调整背景、亮度和对比度；为了在不同条件下进行有效的比较，必须在对照组和实验组之间使用相同的设置。
该方案提供了一种可靠的方法，用于分析小鼠胚胎心脏中心肌细胞的成熟与发育过程。尽管免疫荧光标记心肌细胞特异性蛋白常用于发育过程中心肌细胞的识别，但很少有研究采用能够对肌原纤维结构以及闰盘和成本膜的形成进行高分辨率分析的技术。12-14,22,23该技术可用于 体内 评估导致发育性心脏缺陷的突变，以识别心肌细胞成熟过程中的变化，从而揭示结构性异常的机制。

在发育过程中，心肌细胞迁移至中线并形成线性心脏管后不久，心脏收缩即开始1,2。肌节是心肌细胞内的基本收缩单位；这一高度有序的细胞骨架结构包含由肌节α-肌动蛋白（s-α-actinin）锚定在Z盘上的肌动蛋白丝，以及锚定在M线上的肌球蛋白丝（图1）。随着心肌细胞的成熟，肌节串联组装形成贯穿整个细胞的肌原纤维。肌原纤维通过闰盘锚定于心肌细胞的两端，闰盘是一种细胞间连接结构，包含过渡区连接结构（含部分Z盘成分如s-α-actinin）3、黏附连接蛋白（如N-钙黏蛋白和β-连环蛋白）、缝隙连接蛋白以及桥粒（图1）4。在细胞纵向膜上，周边肌原纤维的Z盘还通过肌膜骨架（costameres）与细胞膜相连；这些特化的局灶性黏附结构在肌原纤维、质膜与细胞外基质之间形成锚定点，为心肌细胞提供额外的结构支持（图1）4。心脏发育早期，心肌细胞排列成指状突起，称为心室小梁，伸入心室腔内，并含有相对成熟的肌原纤维5。随着心脏进一步发育，心外膜下区域的心肌细胞增殖形成致密心肌层，构成心室壁，但其肌节和肌原纤维的组装较心室小梁心肌层延迟5,6。
肌节和肌原纤维组装的模型主要来源于对培养的心肌细胞进行的免疫荧光研究7-10，这些研究方法简单直接，但缺乏三维环境、血流以及与其他在体心脏细胞的相互作用。in vivo。在小鼠胚胎心脏中利用免疫荧光进行高分辨率结构研究在技术上具有挑战性，且很少有研究探讨小鼠心脏发育过程中闰盘和肌膜骨架连接区（costameres）的形成。黏附连接蛋白β-catenin在胚胎第17.5天（E17.5）已可定位于闰盘11，N-钙黏蛋白在E18.5时定位于可能代表闰盘的线性结构12，而另一些研究则显示其在出生后第0天才出现该定位13，肌膜骨架连接区在E18.5已被检测到14，但这些蛋白在更早期的发育阶段表现出弥散且连续的细胞膜分布特征11-13。
本文介绍了一种简单且可重复的小鼠胚胎心脏切片免疫染色与荧光显微镜检测方法，可用于详细分析肌原纤维和心肌细胞的发育过程，包括最早在E12.5时期出现的闰盘结构以及E16.5时期初生的肌膜骨架连接复合体（costameres）。该方案可用于研究基因突变对肌节形成以及肌原纤维和心肌细胞成熟过程的影响。

<table><tbody><tr><td>一次性底座冷冻模具，7×7 mm</td><td>Richard-Allen Scientific</td><td>58949</td><td>此规格 Fisher Scientific 无货</td></tr><tr><td>一次性底座冷冻模具，15×15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-050-159</td><td>亦可从 Richard-Allen Scientific 购得，目录号 58950</td></tr><tr><td>Tissue-Tek 最佳切割温度（OCT）包埋介质 4583</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>2-甲基丁烷</td><td>Sigma</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Fisher Scientific</td><td>T353-500</td><td>使用新鲜配制的 4% 溶液（溶于 1× PBS，pH 7.2–7.4）。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>使用 15% 和 30% 的蔗糖溶液（溶于 1× PBS）。</td></tr><tr><td>一次性移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>S30467-1</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>&quot;Plus&quot; 表示载玻片表面带有正电荷涂层，对维持组织在载玻片上的附着至关重要。</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Sigma</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Western 封闭剂</td><td>Roche</td><td>11921673001</td><td>用于免疫荧光实验中的封闭缓冲液，适用于使用不同物种来源的二抗时。用 PBS 稀释至 1×。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>驴抗小鼠 IgG (H+L) 单价 Fab 片段</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-007-003</td><td>也可使用山羊抗小鼠 IgG (H+L)。用于封闭内源性免疫球蛋白。</td></tr><tr><td>抗 s-&amp;#945;-肌动蛋白抗体</td><td>Sigma</td><td>A7811</td><td>小鼠单克隆抗体，克隆号 EA53。用于速冻/丙酮固定的切片时稀释比例为 1:400，用于多聚甲醛（PFA）固定的切片时稀释比例为 1:300。在小鼠组织上孵育前，需使用抗小鼠 IgG (H+L) 单价 Fab 片段封闭内源性小鼠免疫球蛋白。</td></tr><tr><td>抗-&amp;#946;-连环蛋白抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>9587s</td><td>兔多克隆抗体。需采用速冻/丙酮固定。稀释比例为 1:400。</td></tr><tr><td>抗-&amp;#946;1 整合素抗体</td><td>R&amp;D</td><td>AF2405</td><td>山羊多克隆抗体。稀释比例为 1:200。速冻/丙酮固定的组织染色效果优于 PFA 固定的组织。</td></tr><tr><td>抗原肌球蛋白抗体</td><td>发育研究杂交瘤库，爱荷华大学</td><td>CH1</td><td>小鼠单克隆抗体。需采用速冻/丙酮固定。稀释比例为 1:200。在小鼠组织上孵育前，需使用抗小鼠 IgG (H+L) 单价 Fab 片段封闭内源性小鼠免疫球蛋白。</td></tr><tr><td>抗 N-钙黏蛋白抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-7939</td><td>兔多克隆抗体。稀释比例为 1:200。速冻/丙酮固定的组织染色效果优于 PFA 固定的组织。</td></tr><tr><td>抗踝蛋白抗体</td><td>Sigma</td><td>T3287</td><td>小鼠单克隆抗体，克隆号 8d4。需采用速冻/丙酮固定。稀释比例为 1:200。在小鼠组织上孵育前，需使用抗小鼠 IgG (H+L) 单价 Fab 片段封闭内源性小鼠免疫球蛋白。</td></tr><tr><td>抗磷酸化酪氨酸 397 位点的黏着斑激酶抗体</td><td>Invitrogen</td><td>700255</td><td>兔单克隆抗体。需采用多聚甲醛（PFA）固定。稀释比例为 1:500。</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 驴抗小鼠 IgG (H+L) 抗体</td><td>Life Technologies</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 驴抗兔 IgG 抗体</td><td>Life Technologies</td><td>A10042</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG (H+L) 抗体</td><td>Life Technologies</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 山羊抗兔 IgG (H+L) 抗体</td><td>Life Technologies</td><td>A-11011</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 染料</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td>细胞核染色剂</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5M</td><td></td></tr><tr><td>MLC 400B 单片式激光组合器激光箱</td><td>Keysight（原 Agilent）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clara Interline CCD 相机</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti 倒置显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CSU-X1 转盘共聚焦扫描单元</td><td>Yokogawa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CFI Plan Apochromat 4X 干式物镜</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>数值孔径（NA）0.2，工作距离（WD）15.7 mm</td><td></td></tr><tr><td>CFI Plan Apochromat VC 60x 油浸物镜（MRD01602）</td><td>Nikon&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>NA 1.4，WD 0.13 mm</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements 成像软件</td><td>Nikon</td><td>http://nikon.com/products/instruments/lineup/bioscience/img_soft/index.htm</td><td></td></tr><tr><td>图像分析软件</td><td>Fiji</td><td>http://fiji.sc/Fiji</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠胚胎心脏中心肌细胞发育的免疫荧光分析

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

在心脏发育过程中，心肌特异性的结构和功能单位（包括肌节、收缩性肌原纤维、闰盘和肌膜骨架）的形成需要多种组分在时间和空间上的协调组装。这些组分组装过程的紊乱会导致先天性心脏缺陷。免疫荧光染色技术常用于培养的心肌细胞中检测肌原纤维的成熟情况，但这种体外（ex vivo）方法受限于心肌细胞在培养条件下难以完全分化、缺乏正常的体内（in vivo）机械刺激以及内皮细胞信号的缺失。将免疫荧光技术应用于发育中小鼠心脏的研究具有重要意义，但技术上更具挑战性，且现有方法往往缺乏足够的灵敏度和分辨率，难以在心脏发育早期清晰显示肌节结构。本文中，我们描述了一种稳定且可重复的方法，用于在小鼠胚胎心脏中对多种蛋白进行共免疫染色，或结合荧光蛋白与免疫荧光染色进行共可视化，并利用该方法分析发育中的肌原纤维、闰盘和肌膜骨架。该方法还可进一步用于评估由导致先天性心脏缺陷的基因突变所引起的心肌细胞结构改变。

图2 6 展示在速冻且丙酮固定的 心脏 组织中对不同蛋白进行共染色的典型结果。抗 s-α-肌动蛋白抗体可高度特异性地标记 Z 盘和闰盘，背景信号极低（图2A, 3A, 4A, 5A, 6A，以及 6C); 图6 证明抗小鼠IgG（H+L）单价Fab片段可有效阻断抗小鼠二抗与内源性小鼠IgG的结合。针对黏附连接蛋白β-catenin的抗体在E16.5时与心肌细胞和非心肌细胞的细胞膜结合，并在推测的闰盘处与s-α-肌动蛋白发生共定位。图 2C 和 D），这与成年心脏中β-catenin染色模式的预期一致18胚胎心脏中β1整合素的免疫荧光染色尤其具有挑战性，常难以识别黏着斑14，但这些研究中的β1整合素染色显示出与s-α-辅肌动蛋白标记的Z盘具有相同周期性的信号，可能反映了在E16.5时期正在形成的新生肌膜骨架连接结构图3D).
在 E12.5 时期，s-α-肌动蛋白in 和原肌球蛋白（肌节细丝蛋白）的免疫荧光显示，小梁心肌细胞中呈现出具有规则周期性的染色模式，符合这些细胞中成熟肌原纤维的特征（图 4A 和 图 5A 显示 s-α-肌动蛋白in；图 4B 显示原肌球蛋白）。在 E12.5 心脏的小梁心肌细胞中，N-钙黏蛋白的染色倾向于与 s-α-肌动蛋白in 强染色区域共定位（图 5B–D 及 图 6A–C），可能代表闰盘结构。与小梁心肌细胞不同，致密层中的 s-α-肌动蛋白in 染色呈点状而非线状，原肌球蛋白染色则呈弥散分布而非线性分布（图 4A 和 图 4B）。因此，肌节的组装在致密层心肌中可能较之小梁心肌发生得更晚。此外，致密层中 s-α-肌动蛋白in 和原肌球蛋白染色模式的差异表明，s-α-肌动蛋白in 可较早地聚集为点状结构并形成不成熟的 Z 盘，而原肌球蛋白整合到细丝结构中可能是肌原纤维组装过程中较晚发生的事件。
图7，视频1和视频2展示了经PFA固定的E12.5胚胎心脏的典型结果。在这些示例中，用于成像的是携带LifeAct-RFPruby转基因的胚胎；LifeAct-RFPruby转基因19 标记丝状肌动蛋白，但需要PFA固定。用s-α-肌动蛋白标记Z盘时，在大多数区域易于观察，但与速冻心脏切片相比，信噪比较低。图7A）；该信号在PFA固定的组织中是s-α-肌动蛋白in免疫荧光的典型表现，其中表位可能被蛋白质交联所遮蔽。 图7B 显示肌动蛋白丝与肌节中免疫标记的s-α-辅肌动蛋白的共定位（箭头所示），以及小梁心肌细胞邻近的内膜细胞中的肌动蛋白丝（箭头所示）。三维图像重建揭示了更多细节：单个心肌细胞更易于分辨，同一心肌细胞内的肌原纤维大致相互平行，但不同心肌细胞之间则以不同角度排列。图7C和D, 视频 1，以及 视频 2心内膜细胞与心肌细胞之间的紧密毗邻关系在三维视图中也得到了更清晰的呈现。
<img alt="显示Z盘、M线、肌膜骨架、细胞膜和闰盘的肌节结构示意图" src="/files/ftp_upload/52644/52644fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 心肌细胞的肌节、闰盘和肌膜骨架。 Z盘锚定肌动蛋白丝，而M线锚定肌球蛋白纤维，后者与肌动蛋白丝重叠。肌节由一个Z盘–M线–Z盘单元构成。多个肌节串联形成肌原纤维。肌原纤维的侧端插入心肌细胞的横向边界，连接于一种特化的细胞间连接结构，称为闰盘。周边的肌原纤维通过肌膜骨架与心肌细胞的纵向细胞膜相连，肌膜骨架在心肌细胞间的细胞外基质中形成局灶性黏附。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示心肌细胞s-α-肌动蛋白和β-连环蛋白定位分析的共聚焦显微镜图像。" src="/files/ftp_upload/52644/52644fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 胚胎第16.5天 s-α-肌动蛋白和β-连环蛋白的免疫荧光染色。心脏被取出后迅速冷冻，进行冰冻切片，丙酮固定，并使用（A）针对s-α-肌动蛋白的小鼠单克隆抗体克隆EA53进行免疫染色，该抗体标记心肌细胞Z盘和闰盘结构；以及（B）针对黏附连接蛋白β-连环蛋白的兔多克隆抗体。（C）合并图像显示s-α-肌动蛋白与β-连环蛋白的染色情况。（D）来自C图感兴趣区域的放大图像；星号标记了s-α-肌动蛋白与β-连环蛋白共定位的疑似闰盘结构。图像采集自左心室外侧壁或致密心肌区域，A-C图左上角为心外膜层。s-α-肌动蛋白/488 nm和β-连环蛋白/561 nm激光通道的强度直方图显示范围为460–1600（总范围0–65535）。比例尺：10 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="心脏肌组织结构中β1整合素和s-α-辅肌动蛋白的免疫荧光显微镜图像。" src="/files/ftp_upload/52644/52644fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 胚胎第16.5天s-α-辅肌动蛋白与β1整合素的免疫荧光染色。 取出心脏后迅速冷冻，进行冰冻切片，丙酮固定，并使用(A) 针对s-α-辅肌动蛋白的小鼠单克隆克隆EA53抗体和(B) 针对黏着斑蛋白β1整合素的山羊多克隆抗体进行免疫染色。(C) 合并图像显示β1整合素存在于心肌细胞及非心肌细胞中。注意心肌细胞中存在弥散性和点状的β1整合素信号。(D) 来自图C中感兴趣区域的放大图像。可见具有周期性的点状β1整合素染色（箭头），其周期性与邻近Z盘中s-α-辅肌动蛋白染色相似；这些结构可能代表肌膜骨架连接复合体（costameres）。图像取自左心室致密心肌层。s-α-辅肌动蛋白/488 nm激光通道的强度直方图显示范围为460–1200（总范围0–65535），β1整合素/561 nm激光通道为460–600。比例尺：10 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示肌纤维中α-辅肌动蛋白和原肌球蛋白分布的共聚焦显微镜图像，绿色为α-辅肌动蛋白，红色为原肌球蛋白。" src="/files/ftp_upload/52644/52644fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 胚胎第12.5天s-α-辅肌动蛋白和原肌球蛋白的免疫荧光染色：小梁心肌与致密心肌中的肌原纤维排列结构。 来自同窝胚胎的心脏被取出后迅速冷冻、进行冰冻切片、丙酮固定，并使用(A)抗s-α-辅肌动蛋白的小鼠单克隆抗体（克隆EA53）以及(B)抗肌原纤维细丝蛋白原肌球蛋白的小鼠单克隆抗体（发育研究杂交瘤库CH1）进行免疫染色。图中箭头指示小梁心肌，箭头头指示致密心肌。注意在小梁心肌中s-α-辅肌动蛋白呈规律周期性的线性染色，而在致密心肌层中则呈现多种染色模式，包括点状和线性染色(A)。此外，原肌球蛋白在小梁心肌中也表现为规律周期性的线性染色，但在致密心肌中染色更为弥散。s-α-辅肌动蛋白通道的强度直方图显示范围为460–1,400（总范围0–65535），原肌球蛋白通道为460–1,000。比例尺：10 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示s-α-肌动蛋白、NCad和Hoechst染色的心肌细胞荧光显微图像；蛋白质定位。" src="/files/ftp_upload/52644/52644fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
图5. 胚胎第12.5天s-α-肌动蛋白和N-钙黏蛋白免疫荧光染色：小梁心肌细胞中的肌原纤维和闰盘。 取出心脏后迅速冷冻，进行冰冻切片，丙酮固定，并使用(A) 针对s-α-肌动蛋白的小鼠单克隆克隆EA53抗体和(B) 针对黏着斑蛋白N-钙黏蛋白的兔多克隆抗体进行免疫染色。以z轴层扫方式采集0.2 µm的光学切片，并将z轴层扫图像进行投影 flattened 处理以生成最终图像。(C) 合并后的投影图像显示小梁心肌细胞中同时存在N-钙黏蛋白和s-α-肌动蛋白染色信号，以及经Hoechst染料标记的细胞核。(D) 来自C图的放大区域；星号标记了s-α-肌动蛋白与N-钙黏蛋白共定位的闰盘结构。Hoechst/405 nm激光通道的强度直方图显示范围为470–1,200（总范围为0–65535），s-α-肌动蛋白/488 nm和N-钙黏蛋白/561 nm激光通道的显示范围均为470–2,000。比例尺：10 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="细胞黏附蛋白 N-钙黏蛋白和 α-辅肌动蛋白的荧光显微镜多色成像。" src="/files/ftp_upload/52644/52644fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 6"> 
图 6. 抗小鼠 IgG (H+L) 单价 Fab 片段可有效阻断抗小鼠二抗对内源性小鼠 IgG 的结合。取 E12.5 胚胎心脏，迅速冷冻，进行冷冻切片，丙酮固定并免疫染色。（A-C）切片先用 1× 封闭缓冲液封闭，再加入抗小鼠 IgG 单价 Fab 片段，随后孵育针对 s-α-辅肌动蛋白的小鼠单克隆抗体（克隆号 EA53）以及针对 N-钙黏蛋白的兔多克隆一抗，洗涤后，再加入 Alexa Fluor 488 标记的抗小鼠二抗和 Alexa Fluor 586 标记的抗兔二抗。（A）合并图像，强度直方图显示范围为 480–2500（总范围为 0–65535）。星号标注的区域显示 N-钙黏蛋白信号局限于小梁心肌细胞的横向末端，可能代表新生的闰盘结构。（B）仅 N-钙黏蛋白通道图像，强度直方图显示范围为 480–2,500。（C）仅 s-α-辅肌动蛋白通道图像，强度直方图显示范围为 480–2,500。（D-G）切片仅用 1× 封闭缓冲液封闭（未使用抗小鼠 IgG 单价 Fab 片段进行封闭），仅孵育针对 N-钙黏蛋白的兔多克隆一抗（未使用小鼠单克隆一抗），洗涤后，再加入 Alexa Fluor 488 标记的抗小鼠二抗和 Alexa Fluor 586 标记的抗兔二抗。（D）合并图像，强度直方图显示范围为 480–2500。（E）仅 N-钙黏蛋白通道图像，强度直方图显示范围为 480–2500。（F）仅 s-α-辅肌动蛋白通道图像，强度直方图显示范围为 480–2,500。（G）仅 s-α-辅肌动蛋白通道图像，采用高灵敏度强度直方图显示范围 480–530，显示在未使用抗小鼠 IgG 单价 Fab 片段封闭步骤时，可检测到内源性小鼠 IgG 的背景信号。（H-K）切片先用 1× 封闭缓冲液封闭，再加入抗小鼠 IgG 单价 Fab 片段，仅孵育针对 N-钙黏蛋白的兔多克隆一抗（未使用小鼠单克隆一抗），洗涤后，再加入 Alexa Fluor 488 标记的抗小鼠二抗和 Alexa Fluor 586 标记的抗兔二抗。（H）合并图像，强度直方图显示范围为 480–2,500。（I）仅 N-钙黏蛋白通道图像，强度直方图显示范围为 480–2,500。（J）仅 s-α-辅肌动蛋白通道图像，强度直方图显示范围为 480–2,500。（K）仅 s-α-辅肌动蛋白通道图像，采用高灵敏度强度直方图显示范围 480–530，表明在使用抗小鼠 IgG 单价 Fab 片段封闭步骤时，未检测到内源性小鼠 IgG 的背景信号。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="肌动蛋白和s-α-辅肌动蛋白的荧光显微镜图像；蛋白质结构分析；示意图。" src="/files/ftp_upload/52644/52644fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图7"> 
图7. 胚胎第12.5天小梁心肌细胞中s-α-辅肌动蛋白与肌动蛋白的分布。 使用LifeAct-RFPruby转基因小鼠品系标记丝状肌动蛋白19，同时使用针对s-α-辅肌动蛋白的小鼠单克隆抗体克隆EA53对Z盘和闰盘进行标记。胚胎组织经PFA固定。以0.2 µm为步长采集z轴层扫图像。（A） 投影z层图像显示，在PFA固定的组织中，s-α-辅肌动蛋白染色比速冻丙酮固定切片（图2–5）更为弥散。（B） 投影z层图像同时显示丝状肌动蛋白和s-α-辅肌动蛋白。丝状肌动蛋白荧光信号定位于肌原纤维内Z盘之间的区域（箭头所示）。在紧邻小梁心肌细胞的内膜细胞中也可见丝状肌动蛋白荧光信号（箭头所示）。（C） 小梁心肌细胞的三维视图，从z层顶部观察。（D） 小梁心肌细胞的三维视图，从z层底部观察。A和B中488 nm激光通道与561 nm激光通道的强度直方图显示范围为470–900（总范围0–65535）；C和D中两个通道的显示范围为460–800。比例尺：10 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/Movie1.mov">视频</a> 1. 胚胎第12.5天小梁心肌细胞中s-α-肌动蛋白和肌动蛋白结构的360°旋转三维视图。 使用 Fiji 图像分析程序中的 Image J 3D Viewer 插件对来自图6的图像堆栈进行三维重建。488 nm 和 561 nm 激光通道的强度直方图显示范围均为 470–800（总范围为 0–65535）。
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/Movie2.mov">视频</a> 2. 胚胎第12.5天小梁心肌细胞中s-α-肌动蛋白和肌动蛋白组织的选定三维视图。 图6的图像堆栈使用Fiji图像分析程序中的Image J 3D Viewer插件进行三维重建。围绕x、y和z轴的小幅度旋转显示心肌细胞内肌原纤维相对排列整齐，但大多数心肌细胞之间的排列较差。小幅度旋转还显示缺乏s-α-肌动蛋白的内膜细胞与心肌细胞紧密相邻。488 nm和561 nm激光通道的强度直方图显示范围均为470–800（总范围为0–65535）。

导致先天性心脏缺陷的突变需要在发育过程中对心脏结构进行体内研究，但在小鼠胚胎心脏中开展高分辨率的结构研究在技术上具有挑战性。本文介绍了一种可靠的免疫荧光与图像分析方法，用于评估发育中小鼠心脏中心肌细胞特异性结构。

在心脏发育过程中，心肌特异性的结构和功能单位（包括肌节、收缩性肌原纤维、闰盘……）的形成

本实验的总体目标是评估发育中胚胎小鼠心脏的肌纤维和心肌细胞成熟度。首先将胚胎心脏在包埋介质中定向并冷冻，随后以正确的方向进行冷冻切片，从而实现这一目标。然后对心脏切片进行目的蛋白的免疫荧光标记。最后，对免疫染色的心脏切片进行共聚焦显微镜观察。最终，通过二维和三维图像分析来展示肌成纤维细胞（MyFi）及其他心肌细胞结构的发育过程。该方法有助于回答心脏发育领域中的关键问题，例如突变和心脏基因如何影响肌纤维的组装以及特定结构（如闰盘和肌联蛋白）的形成。为了快速冷冻胚胎心脏，需在化学通风橱中使用最佳切割温度（OCT）包埋剂填充一个3.5厘米的培养皿。将异戊烷在液氮中冷却。根据文本方案分离小鼠胚胎心脏后，将心脏置于OCT包埋剂中，静置数秒使其平衡，然后转移至含有OCT包埋剂的7毫米模具中。将心脏的内壁朝向模具底部。轻轻将模具放入经液氮预冷的异戊烷中。 注意避免使异戊烷液体与 OCT 包埋剂或心脏组织接触，直至 OCT 呈现完全不透明的白色。随后将模具转移至装有干冰的冰桶中。待所有心脏组织完全冻结后，用铝箔包裹冷冻模具，并于 -80 °C 保存，直至进行冷冻切片。 为了固定胚胎心脏，使用含4%多聚甲醛（PFA）的磷酸盐缓冲液（PBS）填充12孔培养板的各孔。根据文本方案解剖获取胚胎心脏后，将每颗心脏放入一个含有PFA的孔中，并在4°C条件下过夜固定。为进行冷冻保护，使用塑料移液器将每颗心脏转移至含有1.5毫升15%蔗糖（Sucrose）PBS溶液的1.5毫升微量离心管中，在4°C条件下轻轻振荡，直至心脏沉至管底。随后将每颗心脏转移至含30%蔗糖PBS溶液的管中，同样在4°C条件下轻轻振荡，直至心脏完全沉降至管底。按照本视频前面演示的方法，将胚胎在OCT中冷冻。将冷冻模具放入冷冻切片机腔室并平衡至-17摄氏度后，将模具倒置，轻轻施压，使心脏组织块从模具中脱出。将心脏的前壁朝上，调整组织块的方向。在样品台（chuck）上放置一大滴OCT，并将心脏组织块置于OCT液滴上。保持心脏朝向，使心脏的前壁距离样品台最远。让心脏在样品台上冷冻固定。将夹头和固定好的心脏组织块装入冷冻切片机的样本架上。调整角度，使刀片与样本之间的夹角为三到五度。将厚度为10 µm的切片收集到经正电荷涂层预处理过的显微镜载玻片上。在进行免疫荧光实验前，将样品彻底干燥后于负80摄氏度保存。固定或从切片中去除OCT后，使用1×封闭缓冲液（溶于PBS）在温和振荡条件下封闭45分钟。若使用小鼠来源的一抗，加入驴或山羊抗小鼠IgG H+L单价Fab片段，按1:100比例稀释于含0.1%吐温20的PBS中，在室温下温和振荡孵育45分钟。加入用一倍封闭缓冲液稀释的一抗或多种一抗，在室温下孵育两小时，或在4摄氏度下过夜孵育。孵育结束后，用一倍PBS缓冲液洗涤切片三次，每次10分钟。室温下，向样本中加入用封闭缓冲液按1:500比例稀释的偶联二抗，避光孵育两小时。室温下，用一倍磷酸盐缓冲液（XPBS）避光洗涤切片，每次10分钟，共洗涤三次。在载玻片上滴加两滴抗荧光淬灭封片剂于两端，用盖玻片封片，再用指甲油封固盖玻片。将样品置于 4 °C 避光保存，直至准备成像。使用 4 倍物镜和激光荧光找到样本及目标区域。采集图像用作定位图。高倍成像时，尽量减少对载物台的调整，取下载玻片，然后换用60倍油镜物镜。在物镜上滴加一滴浸油，然后将玻片放回载物台。接着重新找到样本，为每个通道设置所需的激光功率、曝光时间和二分之一像素合并（binning）参数。根据文本方案中的指导确定最佳设置后，在整个实验的所有组织切片中均使用相同的样本设置。使用强度直方图记录每个通道的最佳强度范围，该范围将用于后续分析。通过选择适当的激光通道，利用采集功能生成Zack。然后选择Z轴层叠的上限和下限。选择Zack步进尺寸，其值为软件提供的光学切片厚度的一半。点击运行，使用Fiji或类似的图像分析程序采集图像。使用自定义颜色模式选项打开Zack文件，并将各通道拆分为独立的窗口。从图像下拉菜单中打开调整亮度对比度工具，并为每个通道设置最佳的直方图强度范围。根据先前确定的参数，将这些通道范围应用于所有待分析的Zacks图像。然后从图像颜色下拉菜单中，将各个通道合并为单一的复合图像。使用图像堆栈的Z投影菜单，从复合图像创建一个扁平化的Z堆栈。由于该图像将明显比3D图像更亮，因此需调整对照样本的直方图强度范围以避免过饱和，并将相同的设置应用于实验组的扁平化Z堆栈。要生成3D图像，首先选择图像堆栈的3D投影菜单，然后选择X轴或Y轴作为旋转轴。将切片间距设置为与Z轴步进尺寸相同的微米数。选择所需的总旋转角度，并将旋转角度增量设置为1。然后从插件下拉菜单中打开ImageJ 3D查看器。选择生成的复合图像以体积形式显示，并将重采样因子设置为1或2。这些图像展示了在速冻及丙酮固定的鼠心组织中对不同蛋白进行共聚焦染色的典型结果：抗Sα-肌动蛋白抗体可高度特异性地标记Z线以及闰盘结构，背景信号极低。抗黏附连接蛋白β-连环蛋白的抗体可结合心肌细胞及非心肌细胞的细胞膜，且在E16.5时期，在推测为闰盘的区域与SFA肌动蛋白发生共定位。胚胎心脏中β1整合素的免疫荧光染色尤其具有挑战性，但在本研究中，β1整合素染色显示出与SFA肌动蛋白标记的Z线相似的周期性信号，可能反映了在E16.5时期正在形成的新生肌节结构。在 E 12.5 时期，心室小梁心肌细胞中 SFA 肌动蛋白和原肌球蛋白的染色模式显示出规则的周期性，与外层致密区成熟肌原纤维的特征一致；而在外层致密区，SFA 肌动蛋白的染色呈点状多于线状，原肌球蛋白信号则呈弥散状而非线状。E 12.5 胚胎心脏中 NCA 的黏附性染色与心室小梁心肌细胞的分布区域与 SFA 肌动蛋白强烈染色的区域共定位，可能代表闰盘结构。图中显示的是来自 Life Act-RFP Ruby 转基因小鼠的 PFA 固定 E 12.5 胚胎心脏，经 SFA 肌动蛋白和丝状肌动蛋白标记的图像。与速冻心脏切片相比，其 SFA 肌动蛋白的信噪比有所降低。三维图像重建显示，心肌细胞内的肌原纤维大致相互平行，但不同心肌细胞之间的取向角度各异。观看本视频后，您应能够充分理解如何正确地对胚胎心脏进行定向和冷冻切片，以及如何开展免疫染色、共聚焦显微镜观察和图像分析，以评估小鼠心脏发育过程中肌原纤维和心肌细胞的成熟情况。Admit。

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