细胞周期变化的可视化和核测定心肌出生后

该程序的总体目标是可视化出生后心肌细胞中的细胞周期活动并确定它们的核性。这种方法可以帮助回答心脏再生领域的关键问题，例如心肌细胞是否真的分裂，或者它只是增加其倍性或变成多核？该技术的主要优点是细胞周期的 M 期可以在高时空分辨率下可视化，并且可以通过荧光识别心肌细胞核。

演示该程序的是我们实验室的技术人员 Patricia Freitag。如果使用非纯合育种对，首先通过荧光显微镜鉴定转基因心脏，以检查它们的 EGFP analin 和 H2B-mCherry 表达。EGFP 分析核信号可以通过聚焦其组织层在心房边缘最容易地检测到。

为了分离心肌细胞，将适当数量的心脏放入 1.5 毫升反应管中，该反应管含有 1 毫升来自新生儿心脏分离试剂盒的酶混合物，然后用剪刀将心脏切成小块。然后，将溶液转移到 15 毫升反应管中。将试管在 37 摄氏度下几乎水平放置 15 分钟，孵育结束时用 5 毫升移液器将组织混合 5 到 10 次。

在第三次消化结束时，用 7.5 mL 培养基 2 终止反应，并通过 70 μm 细胞过滤器过滤细胞悬液。用 3 毫升培养基 2 冲洗细胞过滤器，将洗涤液与收集的细胞混合，然后离心收集细胞。将沉淀重悬于 500 μL 培养基 1 中进行计数。

然后，在 96 孔平底板中的 120 微升培养基 1 中接种每孔 1 乘以 10 至 4 个细胞，并在细胞培养箱中过夜培养之前离心细胞。第二天，大多数心肌细胞应该都在跳动。在开始转染之前，用 RNAse 去污溶液擦拭工作台和所有转染材料，以去除任何 RNAse。

当所有材料都准备好后，向每个孔中加入 20 μL 新鲜制备的 siRNA 混合物，并将细胞放回培养箱中 48 小时。两天后，用 120 μL 培养基 1 替换每个孔中的上清液，并将细胞放回培养箱中至少再放置 24 小时。孵育结束时，用 PBS 洗涤细胞 1 次，然后在 4% 甲醛溶液中固定 20 分钟。

要通过共聚焦视频显微镜分析细胞，请将板转移到共聚焦显微镜载物台并启动成像软件。打开 A1plus 设置并选中通道 1、2、3 和 4 框。在下拉菜单中，将通道 1 设置为 DAPI，将通道 2 设置为 eGFP，将通道 3 设置为 RFP，将通道 4 设置为 Cy5。

单击通道电压，并使用滑动条将每个通道的电压设置为 80。使用滑动条将偏移量设置为零，然后单击 home 按钮将针孔设置到 home 位置。在下拉菜单中将扫描大小设置为 1024 x 1024 像素。

单击优化以打开 XYZ 大小设置窗口，并选中建议的步骤 Z 下的完美体素框，选择 20 倍物镜并调整激光强度，直到图片既不曝光不足也不曝光过度。设置完所有参数后，打开 acquire 菜单。选择扫描大图像，然后选择当前位置，位于左上角的区域下。

然后将 X 和 Y 中的字段数设置为 3 x 3，然后单击 scan。要定义心肌细胞核的数量，请单击 Measure（测量）、Manual Measurement（手动测量）和 Counts（计数）。选择具有 H2B-mCherry 信号的原子核，从而标记和计数它们。

然后，选择 α-肌动蛋白阳性细胞以确定心肌细胞的数量。要计数具有核 EGFP 分析蛋白信号的 G1、S、G2 期心肌细胞，请选择测量、手动测量和计数。用点击标记 EGFP 分析蛋白和 H2B-mCherry 表达的细胞核，并使用有丝分裂特异性 EGFP 分析蛋白信号（如收缩环和中体）手动计数心肌细胞。

然后，单击测量、手动测量和计数，然后单击具有有丝分裂特异性 EGFP 骨架蛋白信号、细胞质信号、收缩环和中体的心肌细胞。与阴性对照相比，miRNA 和 siRNA 转染的心肌细胞表现出对细胞周期活性的诱导。进行内重复的心肌细胞表现出纯核 EGFP 分析蛋白表达，而经历细胞分裂的心肌细胞在 M 期典型定位中表现出 EGFP 分析蛋白表达。

在 Langendorff 装置对心脏组织进行酶消化后，心房和心室可以独立机械分离和分析，从而可以可视化具有大量 H2B-mCherry 阳性双核心肌细胞的 H2B-mCherry 转基因心室心肌细胞。相比之下，大多数心房心肌细胞是单核的。酶消化不会导致 100% 单细胞群通过 α-肌动蛋白染色揭示交叉条纹模式，进一步促进了双核心肌细胞之间的区分，作为交叉条纹的连续模式和细胞双峰。

要分析厚切片中心肌细胞的双成核指数，有必要手动滚动堆栈，因为细胞核不一定位于一个 Z 平面内，小麦胚芽凝集素染色允许检测细胞borders. 3D成体转基因小鼠心脏固定切片的重建允许检测和自动计数钩子， 染色和 H2B-mCherry 阳性细胞核，以确定组织内生理条件下心肌细胞核的比例。一旦掌握，如果作得当，心脏分离可以在两到三个小时内完成。

在尝试此程序时，重要的是要记住在整个实验过程中持续工作以保持细胞的活力。按照此程序，可以筛选 microRNA 或其他小物质在出生后心肌细胞中的增殖诱导作用。