Name: 细胞周期变化的可视化和核测定心肌出生后 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 了解利用转基因小鼠可视化心肌细胞周期活动与核倍性的方法。该技术通过高时空分辨率荧光成像区分细胞分裂与多倍体变化，为心脏再生研究提供可靠工具。

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感谢 S. Grünberg（德国波恩）和 P. Freitag（德国波恩）提供的技术支持。

本方案中所有涉及动物的实验程序均符合波恩大学的伦理标准，并遵守欧洲议会关于用于科学目的动物保护的2010/63/EU指令指南。
1. 体外 出生后心肌细胞周期活性的可视化
<ol>
	<li>出生后心肌细胞分离
	<ol>
		<li>实验前准备
		<ol>
			<li>配制培养基（IMDM，1% 青霉素/链霉素，1% 非必需氨基酸，0.1% β-巯基乙醇）；培养基1：加入FCS至终浓度2%；培养基2：加入FCS至终浓度20%。</li>
			<li>用含0.1%明胶的PBS溶液包被96孔培养板（半生长面积：15 mm2）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>心脏解剖
		<ol>
			<li>准备一个含有15 mL PBS的培养皿并置于冰上。将两把镊子和小剪刀放入干式玻璃珠灭菌器中进行灭菌。</li>
			<li>通过断头法处死新生转基因小鼠（CAG-eGFP-anillin/Myh6-H2B-mCh）。打开胸腔，取出心脏（方法见Ehler et al., 2013, J Vis Exp.; (79):50154. doi:10.3791/50154），并将心脏转移至预冷的PBS中。继续处理下一只小鼠。</li>
			<li>若使用非纯合子交配对，需使用荧光显微镜鉴定转基因心脏。将心脏置于PBS中并在荧光显微镜下观察，使用适当的滤光片组检测eGFP-anillin表达（激发波长：488 nm；发射波长：509 nm）和H2B-mCh表达（激发波长：587 nm；发射波长：610 nm）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>心肌细胞分离
		<ol>
			<li>使用新生小鼠心脏组织解离试剂盒解离所选心脏。将酶混合液1在37 °C孵育5分钟。为获得1 mL终末酶混合液，将945 µL酶混合液1与55 µL酶混合液2混合。</li>
			<li>将最多4只P1–P3小鼠或最多2只P4–P6小鼠的心脏转移至含有1 mL酶混合液的1.5 mL离心管中，并用剪刀将心脏剪成小块。将溶液转移至15 mL离心管中。</li>
			<li>在37 °C孵育15分钟。为最大化组织与酶的接触，将15 mL离心管几乎水平放置于孵育箱中。使用5 mL移液器上下吹打5–10次进行混匀。重复此步骤三次。</li>
			<li>加入7.5 mL培养基2（20% FCS）以终止酶反应。用70 µm细胞筛过滤细胞悬液，并用3 mL培养基2冲洗细胞筛。</li>
			<li>将细胞悬液在300 × g离心15分钟，弃去上清液。将沉淀重悬于500 µL培养基1中；后续实验无需进行红细胞裂解。取10 µL细胞悬液加入细胞计数板，测定细胞数量。</li>
			<li>对于96孔板：每孔接种10,000个细胞于120 µL培养基1（2% FCS）中。将细胞放入孵育箱（37 °C，5% CO2）中，并立即进行转染。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用siRNA或miRNA转染新生心肌细胞
	<ol>
		<li>用RNase去污染溶液擦拭实验台以去除RNase。使用RNase去污染溶液清洁以下物品：10 µL、100 µL和200 µL移液器以及冰盒。将siRNA储备液（100 µM）在冰上解冻。</li>
		<li>在低血清培养基中配制2 µM的工作液（98 µL低血清培养基 + 2 µL 100 µM siRNA储备液）。工作液应在当天使用，不建议冻存。</li>
		<li>将2 µM工作液4 µL与6 µL低血清培养基加入0.5 mL离心管中（适用于一个96孔板；最终si/miRNA浓度在140 µL中约为57 nM）。根据需转染的孔数调整相应体积。</li>
		<li>配制转染试剂主混合液。每孔使用10 µL（0.6 µL转染试剂 + 9.4 µL低血清培养基），共96孔。</li>
		<li>将si/miRNA混合液加入转染试剂混合液中，在冰上孵育5分钟。每孔加入20 µL混合液。将细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育48小时，然后每孔更换为120 µL培养基1。24小时或更长时间后，进行固定和免疫荧光染色。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>固定与免疫荧光染色
	<ol>
		<li>移除培养基，用PBS洗涤细胞一次。加入4%甲醛溶液覆盖细胞，固定20分钟。吸除甲醛溶液，用PBS洗涤一次，然后加入PBS覆盖细胞用于储存，或直接进行免疫染色。</li>
		<li>在含0.2% Triton-X和5%驴血清的溶液中加入一抗（浓度按厂家说明书推荐），孵育至少2小时。若检测α-肌动蛋白（稀释比例1:400；单克隆抗α-肌动蛋白抗体），则在4 °C孵育过夜。</li>
		<li>移除一抗，用PBS洗涤三次。将二抗按1:400比例稀释于Hoechst溶液中，在室温避光孵育1小时。移除二抗，用PBS洗涤三次，加入PBS覆盖细胞，于4 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>共聚焦视频显微镜观察
	<ol>
		<li>使用共聚焦显微镜进行图像采集。打开成像软件。打开&#34;A1plus Settings&#34;，勾选Ch1、Ch2和Ch3。通过下拉菜单设置Ch1为DAPI，Ch2为eGFP，Ch3为Cy3，Ch4为Cy5。
		<ol>
			<li>对每个通道，点击HV并使用滑动条将其设为80。使用滑动条将Offset设为0，并点击&#34;Home&#34;按钮将针孔恢复至初始位置。通过下拉菜单将扫描尺寸设为1,024 × 1,024。</li>
			<li>点击“optimize”以打开&#34;XYZ Size Setup&#34;窗口。在&#34;Suggested Step (z)&#34;下勾选&#34;Perfect Voxel&#34;。逐步提高激光强度，直至图像既不过曝也不欠曝。 
			注：例如，Ch1（DAPI）：16%，Ch2（eGFP）：12%，Ch3（Cy3）：100%，Ch4（Cy5）：1%。将所有通道的Offset设为0。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用20倍物镜（200倍放大）拍摄图像。扫描由多个图像拼接组成的大视野图像（例如，3 × 3）。
		<ol>
			<li>在成像软件中进入&#34;Acquire&#34;，从下拉菜单中选择&#34;Scan large image&#34;。在&#34;Area,&#34;下拉菜单中选择&#34;current position is at top left corner&#34;，并将&#34;Number of fields in X and Y&#34;设为3 × 3。点击&#34;Scan&#34;。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>图像分析
	<ol>
		<li>通过计数H2B-mCh信号确定心肌细胞核数量，通过计数α-肌动蛋白信号确定心肌细胞数量。
		<ol>
			<li>点击&#34;Measure&#34;，从下拉菜单中选择&#34;Manual Measurement&#34;。在下一个下拉菜单中选择&#34;Counts&#34;。点击具有H2B-mCh信号的细胞核，进行标记和计数。对α-肌动蛋白阳性细胞进行相同操作，以获得心肌细胞总数。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>计数处于S/G2期且具有核内eGFP-anillin信号的心肌细胞（eGFP-anillin+/H2B-mCh+细胞核）。点击&#34;Measure&#34;，从下拉菜单中选择&#34;Manual Measurement&#34;。在下一个下拉菜单中选择&#34;Counts&#34;。点击具有eGFP-anillin信号和H2B-mCh信号的细胞核进行标记。</li>
		<li>计数具有有丝分裂特异性eGFP-anillin信号的心肌细胞（例如，图1F和G），如细胞质信号、收缩环和中间体。点击&#34;Measure&#34;，从下拉菜单中选择&#34;Manual Measurement&#34;。在下一个下拉菜单中选择&#34;Counts&#34;。点击具有有丝分裂特异性eGFP-anillin信号（例如，图1F和G）、细胞质信号、收缩环和中间体的心肌细胞进行标记。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 通过Langendorff分离法和厚组织切片测定成年心肌细胞中的核形成
<ol>
	<li>通过Langendorff离解法分离成年心肌细胞
	<ol>
		<li>心脏解剖前的准备工作
		<ol>
			<li>用胰岛素注射器（30号针头）抽取肝素（20单位/克体重）。抓住小鼠颈部的皮肤，提起并翻转小鼠使其腹部朝上，以便注射。</li>
			<li>进行腹腔注射。将肝素化的小鼠放回笼中，至少等待15分钟后开始心脏解剖。用5–10 mL灌注缓冲液冲洗并通气Langendorff装置（灌注缓冲液：135 mM NaCl，4 mM KCl，1 mM MgCl₂，1 mM NaH₂PO₄，20 mM HEPES，10 mM葡萄糖，pH 7.4，用NaOH调节）。2，2.5 mM HEPES、5 mM 葡萄糖和 25 mM BDM 的 ddH₂O 溶液2O，用 NaOH 调节 pH 至 7.4。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>心脏解剖
		<ol>
			<li>准备一个10 cm的培养皿，加入预冷（4 °C）的PBS，并置于冰上。用PBS填充并排气一支连接套管针（20号）的1 mL注射器。用橡皮泥将套管针固定在培养皿边缘，使针尖略低于PBS液面。</li>
			<li>通过颈椎脱位处死小鼠。用70%乙醇溶液擦拭腹部。用手术剪从腹部中线至胸骨处做一切口。移除膈肌，并用手术剪在两侧剪开胸腔。</li>
			<li>用20号针头抬起并固定胸骨，打开胸腔，用解剖镊轻轻夹住心脏。抬起心脏，剪断流出道血管，将心脏从肺部和血管系统中分离取出。 
			注意：为识别主动脉，应将心脏腹侧朝上放置。此位置可缩短两个心房之间的距离，从而使主动脉及其分支位于两心房之间，便于辨认。根据个体心脏结构的不同，若主动脉主干仍足够长，可去除部分分支。</li>
			<li>将心脏转移至含有预冷PBS的10 cm培养皿中（见步骤2.1.2.1）。通过将升主动脉套入已用往复式多功能工具磨钝的G20×1½注射用套管上进行插管，以避免组织损伤。用缝线将主动脉固定在套管上。轻轻推动注射器活塞，用PBS冲洗心脏以去除多余血液。此时应可见心脏轻微膨胀。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>朗根多夫心脏离解
		<ol>
			<li>迅速将插管的心脏连接至兰格多夫灌流装置的鲁尔锁接头。以每秒1滴的流速，在37 °C下用30 mL含氧灌流缓冲液对心脏灌注5分钟。可通过调节O2 使用减压阀调节兰格多夫装置中的流体压力（压力范围为0至200 mbar）。</li>
			<li>使用前立即配制消化缓冲液：在灌注缓冲液中加入6 U胶原酶B、10,000单位胰蛋白酶和50 µM CaCl₂2去除灌注缓冲液，加入30 mL温热（37 °C）且充氧的消化缓冲液，开始酶消化。 
			注意：胶原酶B的用量需根据不同批次的活性进行滴定。</li>
			<li>调节流速至1滴/秒，消化心脏10至13分钟。为避免污染，不要重复使用流出液。将心脏转移至含有5 mL消化缓冲液的10 cm培养皿中。用镊子手动解剖组织：用一对镊子夹住心脏，另一对镊子将其撕成小块。 
			注意：在此步骤中，可将心房分离并剪成小块（使用虹膜剪），然后在37 °C孵育箱中用750 µL消化缓冲液消化30分钟，以获得分离的心房细胞。为获取纯化的心房心肌细胞，使用1 mL移液器反复吹打数次。加入750 µL终止液以终止酶反应。</li>
			<li>通过加入5 mL终止液（含5% FBS和50 µM CaCl的灌注缓冲液）终止消化2使用血清移液管将细胞悬液通过100 µm细胞滤网过滤，并收集至50 mL离心管中。在室温下以80 × g离心过滤后的细胞悬液1分钟。</li>
			<li>弃去上清液，用10 mL终止液轻轻重悬细胞沉淀，使用10 mL血清移液管操作。将细胞悬液在室温下以80 × g离心1分钟。</li>
			<li>离心后，弃去上清液，将细胞重悬于1 mL培养基（IMDM，含20% FCS、0.1 mM非必需氨基酸、青霉素和链霉素各50 µg/mL、0.1 mM β-巯基乙醇）中进行培养。或者，继续进行步骤2.2。 &#34;免疫荧光染色&#34; 固定细胞。</li>
			<li>在24孔板中进行固定时，将分离的细胞以每孔10,000个接种于24孔板内经8 µg/mL层粘连蛋白包被的盖玻片上，每孔加入500 µL培养基，在37 °C、5% CO₂条件下培养2 至少 3 h。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>悬浮状态下经朗根多夫法分离的心肌细胞的免疫荧光染色
	<ol>
		<li>用1 mL 4%多聚甲醛（PFA）PBS溶液（pH 7.4）在室温下固定Langendorff分离的心肌细胞15分钟。室温下以800 × g离心2分钟，弃去固定液，用PBS洗涤细胞两次。</li>
		<li>将固定的 cardiomyocytes 重悬于 1 mL PBS 中，可立即进行免疫荧光染色，或以每孔 500 µL PBS 分装至 24 孔板中，于 4 °C 保存。取部分细胞悬液（约 100 - 200 µL）转移至微量离心管中。室温下以 800 × g 离心 2 分钟，弃上清液。</li>
		<li>用含0.2% Triton X-100和5%驴血清的PBS缓冲液将抗α-肌动蛋白in抗体按1:400稀释，每孔加入200 µL，室温孵育1小时，对细胞进行透化、封闭及一抗染色。</li>
		<li>在室温下以800 × g离心2分钟，弃上清液。用PBS洗涤细胞沉淀，在室温下以800 × g离心2分钟。弃上清液，加入200 µL Alexa-Fluor标记的二抗（抗小鼠IgG1），用含Hoechst染料（工作浓度：1 µg/mL）的溶液按1:400稀释，避光孵育1小时。</li>
		<li>在室温下以800 × g离心2分钟，弃去上清液。重复此步骤一次。避免样品暴露于光线下。将细胞重悬于200–500 µL PBS中，取100–300 µL细胞悬液转移至显微镜观察室的孔中。盖上盖板，将细胞于4 °C避光保存，直至成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Langendorff分离心肌细胞核性分析
	<ol>
		<li>使用25倍物镜（相当于250倍放大倍数）拍摄经α-肌动蛋白in染色的心肌细胞图像。仅在那些α-肌动蛋白in染色规则、呈现典型杆状形态因而被认为完整的细胞中，计数H2B-mCh+细胞核的数量。</li>
		<li>从三个不同心脏中计数至少100个心肌细胞。计算单核、双核和三核心肌细胞的百分比。 
		注意：通常双核细胞应占约80–90%，而三核细胞及含更多细胞核的细胞较为罕见（&#60; 1% 的 Langendorff 分离心肌细胞， &#60; 3%的厚切片中）。心房心肌细胞明显小于心室心肌细胞。通常，单核细胞占细胞总数的90%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成年心脏的分离、固定与冷冻保存以制备厚切片
	<ol>
		<li>组装灌注固定装置：将50 mL注射器连接至一个三通旋塞，该三通旋塞配有海德堡延长管和第二个三通旋塞。将注射器固定在支架上，使其能够依靠重力实现液体流过。用15 mL磷酸盐缓冲液（PBS）充满整个系统。</li>
		<li>按照步骤 2.1.2.1-2.1.2.4 操作， &#34;心脏制备&#34; 将G20x1½注射套管连接至充满无气泡PBS的灌注装置的鲁尔锁接头，用PBS进行灌注。向系统中加入10–15 mL含4%甲醛的PBS溶液，随后通过心脏灌注。将心脏置于4%甲醛溶液中浸泡固定过夜。</li>
		<li>用 PBS 替换 4% 甲醛溶液，在室温下于水平摇床（150 rpm）中用 PBS 洗涤心脏 8 小时。将 PBS 更换为 20% 蔗糖溶液，在 4 °C 下过夜脱水。</li>
		<li>将心脏置于小模具中的冷冻包埋介质中冷冻。
		<ol>
			<li>将装有2-甲基丁烷的烧杯置于盛有干冰的容器中。将心脏放入预先加入一半冷冻包埋剂的冷冻模具中，再完全覆盖冷冻包埋剂。小心地将模具放入低温烧杯中，避免冷冻包埋剂与2-甲基丁烷接触。将冷冻组织储存于-80 °C，直至使用。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>厚心肌切片的制备
	<ol>
		<li>使用以下冷冻切片机设置：样品温度为 -18 至 -20 °C，腔室温度为 -21 至 -23 °C，刀架 clearance 角度为 4°，并使用 Feather R35 切片刀片。</li>
		<li>从冻存容器中取出冷冻保存的器官，使用速冻台和冷冻包埋介质将其固定在样本托盘上。将心脏放置成以心尖为起始进行切片的方向。</li>
		<li>切去50 µm的切片，直至获得平整的切面并暴露出器官。使用冷冻切片机手动模式，以缓慢速度并配合刀片上的防卷板，切割50 µm厚的组织切片。将切片贴附于经生理盐水处理的显微镜载玻片上。室温下干燥30分钟，随后将载玻片储存于-80 °C或直接进行染色。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>厚心肌切片染色（细胞核和细胞膜）
	<ol>
		<li>在37 °C下，将心肌切片置于含有RNAse A（20 µg/mL）的洗涤缓冲液（0.5 M NaCl、0.1 M Tris pH 7.5和50 mM EDTA）的比色皿中处理1小时。随后在室温下，将切片在含0.2% Triton-X的洗涤缓冲液中孵育30分钟。最后在室温下，于水平摇床上用洗涤缓冲液将切片洗涤两次，每次5分钟。</li>
		<li>在4 °C下，用1 µM TO-PRO3碘化物（642/661）和荧光素偶联的小麦胚芽凝集素（WGA，1:100）溶于洗涤缓冲液中避光孵育过夜。将脑片置于比色皿中，用洗涤缓冲液在水平摇床上洗涤3次，每次5分钟。随后用含抗荧光淬灭剂的聚乙烯醇封片剂封片，并加盖盖玻片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>图像采集
	<ol>
		<li>理想情况下，使用配备40X/1.15 NA水浸物镜的倒置共聚焦激光扫描显微镜。通过肉眼寻找切片中呈纵向排列的心肌细胞区域；为此，荧光素-WGA通道（激发波长：488 nm）最为合适。 
		注意：此步骤至关重要，因为后续分析需要在z轴堆叠图像中可见心肌细胞的上下边界。由于成像深度限制在约30 nm，而切片厚度为50 µm，因此无法对这些细胞（细胞长度：约120 µm）进行横截面成像。</li>
		<li>在成像软件中调整设置。打开成像软件，进入A1plus设置界面，勾选Ch2、Ch3和Ch4。通过点击下拉菜单，将Ch2设置为EGFP，Ch3设置为Alx546，Ch4设置为Alx647。
		<ol>
			<li>对于每个通道，单击 HV，然后使用滑动条将其设置为 80。使用滑动条将偏移量（Offset）设置为 0。单击 &#34;首页&#34; 按钮以将针孔设置到初始位置。通过点击下拉菜单将扫描尺寸设置为 1,024 x 1,024，并点击优化以打开 &#34;XYZ 尺寸设置&#34; 窗口。检查 &#34;完美体素&#34; 盒下 &#34;建议步骤 (z)&#34;.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>点击 &#34;活体扫描&#34; 并点击各通道的滑动条来调整激光强度。检查 &#34;Z系列&#34; 盒子上的 &#34;ND采集&#34; 窗口并单击 &#34;由顶部按钮定义&#34; 盒子。通过调节显微镜焦距后点击相应按钮，定义z轴层扫的顶部和底部。将z轴步长设置为0.5 µm。 
		注意：z轴堆叠的深度受限于组织内的光学穿透能力和信噪比。</li>
		<li>前往 &#34;A1plus 设置&#34; 将线平均/积分（Line Average/Integral）设置为 2-4，方法是点击下拉菜单进行选择。精细调节激光强度；为实现焦平面成像，应尽可能缩小针孔。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成核分析
	<ol>
		<li>打开图像分析软件并加载感兴趣的z轴层叠图像。</li>
		<li>通过滚动 z 层序列中的不同层面，手动确定成核情况，以识别完全位于层序列内的细胞；当 WGA 染色在所有维度均可见时，即为符合条件的细胞。计数细胞核数量（多数为双核），并在软件中通过注释标记已分析的细胞。</li>
		<li>确定在单通道的三维重建中CM细胞核（H2B-mCh+）的数量和总细胞核（TO-PRO3+）的数量图 2D）。在成像软件中，单击 &#34;二元的&#34; 并选择 &#34;定义阈值 3D&#34; 从下拉菜单中选择。在通道下拉菜单中，选择 Alx546 以计数心肌细胞核数量，或选择 Alx647 以计数总细胞核数量。通过点击相应的箭头，设置程序至 &#34;平滑 4x&#34;，清洁 1x，填充孔洞开启。检查 &#34;大小&#34; 将方框设置为5 µm，并使用滑动条调节阈值，直至出现分离的物体。 
		注意：片段化处理后，结果窗口将显示量化事件的表格以及图像的彩色片段化结果。由于部分细胞核直接相互接触，软件可能无法正确分离双细胞核（doublets），因此需手动校正自动测量结果。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Soonpaa, M. H., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+cardiomyocyte+DNA+synthesis+in+normal+and+injured+adult+mouse+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Physiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts.</a> Am.J.Physiol. 272 (1 Pt 2), H220-H226 (1997).</li>
<li>Ang, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+conventional+approaches+to+identify+myocyte+nuclei+in+histologic+sections+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart.</a> Am.J.Physiol Cell Physiol. 298 (6), C1603-C1609 (2010).</li>
<li>Engel, F. B., Schebesta, M., Keating, M. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16889791">Anillin localization defect in cardiomyocyte binucleation.</a> J Mol Cell Cardiol. 41 (4), 601-612 (2006).</li>
<li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Cell+Generation+and+Turnover+in+the+Human+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart.</a> Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

关于心肌细胞在损伤后及组织稳态过程中是否能够重新进入细胞周期并进行分裂，目前仍存在争议。有关心肌细胞基础更新率的数值报道范围介于1%1至80%7之间。此外，在心脏发生病变后，也有研究报道在损伤边缘区域出现了细胞周期活性的激活以及新生心肌细胞的生成，其比例在0.0083%8到25–40%7之间。这些差异部分可归因于用于识别心肌细胞核的实验方法不同，而这一过程在组织学切片上以及细胞分裂过程中极具挑战性9。由于心肌细胞容易出现细胞周期的异常变化，因此区分真正的细胞分裂与内复制（endoreduplication）和无胞质分裂的有丝分裂（acytokinetic mitosis）至关重要，后两者会导致多倍体和多核细胞的形成。为了准确识别细胞分裂事件，必须可视化细胞分裂的关键标志结构，例如收缩环和中间体（midbodies），同时需测定双核心肌细胞所占的比例。我们已建立了一系列技术，可用于详细分析心肌细胞的细胞...

准确鉴定心肌细胞核及其细胞周期状态，对于确定心肌组织的更新与再生具有至关重要的意义。这一点在使用核标记物（如pHH3、Ki-67或胸苷类似物）来识别细胞周期活性时尤为关键。由于成年哺乳动物心肌细胞的增殖能力极低1，若错误地将非心肌细胞核识别为表达增殖标志物的心肌细胞核，可能会对增殖检测的结果产生重大影响。此外，心肌细胞容易出现细胞周期的异常变化，例如内复制（endoreduplication）和无胞质分裂的有丝分裂（acytokinetic mitosis），这些过程导致细胞形成多倍体或多核状态，而非真正的细胞分裂。因此，在某些情况下，对常见细胞周期标志物抗体染色结果的解读并不具有确定性。
在此，我们介绍一种通过明确识别细胞核来直接鉴定出生后及成年阶段小鼠心肌细胞及其核性的方法，适用于原代分离的心肌细胞和厚组织切片。为此，我们使用了一种转基因小鼠品系，该品系在 Myh6 启动子驱动下特异性地在心肌细胞中表达人组蛋白 H2B 与 mCherry 的融合蛋白（Myh6-H2B-mCh）2将该小鼠品系与一种转基因增殖指示小鼠品系进行杂交，后者在普遍性鸡β-肌动蛋白启动子和CMV增强子（CAG-eGFP-anillin）驱动下表达eGFP-anillin融合蛋白，从而可用于确定细胞周期状态。支架蛋白anillin特异性表达于细胞周期活跃的细胞中3，其在细胞周期中的差异性亚细胞定位使得能够以高分辨率对M期进行活细胞追踪细胞周期进程4因此，这种双转基因小鼠可用于区分增殖的心肌细胞与经历细胞周期变化的细胞。这一特性在筛选诱导增殖的物质时尤为有用。 体外.

<table><tbody><tr><td>10 cm 培养皿</td><td>Sarstedt</td><td>821472</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;micro;m细胞滤筛</td><td>Becton Dickinson GmbH/Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>2,3-丁二酮单肟 (BDM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>G20x1 &amp;frac12; 注射套管，Sterican</td><td>布劳恩，美尔松根</td><td>4657519</td><td></td></tr><tr><td>20号针头</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>301300</td><td></td></tr><tr><td>24孔板</td><td>Becton Dickinson GmbH/Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>2-甲基丁烷</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>3927.1</td><td></td></tr><tr><td>37% 甲醛溶液</td><td>AppliChem GmbH&amp;nbsp;</td><td>A0936,1000</td><td></td></tr><tr><td>三通旋塞阀</td><td>B. Braun Medical Inc.</td><td>16494C</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 注射器</td><td>B. Braun Medical Inc.</td><td>8728810F</td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>Otto Fischar GmbH</td><td>27669</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 标记的二抗</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>115-605-205</td><td></td></tr><tr><td>α-辅肌动蛋白 EA-53，小鼠 IgG</td><td>Sigma-Aldrich，施泰因海姆</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养微孔板，96 孔，半面积</td><td>Greiner bio-one</td><td>675986</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶B</td><td>罗氏</td><td>11088815001</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜 Eclipse Ti-E</td><td>尼康</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机 CM 3050S</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>驴血清</td><td>杰克逊免疫研究公司，萨福克，英国</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>PromoCell，海德堡</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甲醛溶液（4%）</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3697</td><td></td></tr><tr><td>猪皮明胶，A型</td><td>Sigma-Aldrich，施泰因海姆</td><td>G2500</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>VWR</td><td>631-0146</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>海德堡延伸管</td><td>IMPROMEDIFORM GmbH</td><td>MF 1833</td><td></td></tr><tr><td>肝素钠</td><td>Ratiopharm</td><td>5394.02.00</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>HistoBond 显微镜载玻片</td><td>Marienfeld</td><td>0810000</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342（1&amp;nbsp;mg/mL</td><td>Sigma Aldrich，多夫基兴</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素注射器</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>300334</td><td></td></tr><tr><td>艾斯科夫&amp;rsquo;s 改良杜尔贝科&amp;rsquo;s Medium（IMDM）</td><td>Gibco/Life Technologies，达姆施塔特</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>康宁</td><td>354221</td><td></td></tr><tr><td>激光扫描显微镜Eclipse Ti</td><td>尼康仪器，D&amp;uuml;杜塞尔多夫</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen/Life Technologies，达姆施塔特</td><td>13778075</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IgG Cy5（驴源）</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>715-175-151</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Sarstedt</td><td>72690</td><td></td></tr><tr><td>微型振荡器</td><td>VWR</td><td>12620-940</td><td></td></tr><tr><td>mirVana miRNA 模拟物，hsa-miR199a-3p</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>4464066</td><td></td></tr><tr><td>活检模具</td><td>Sakura Finetek/ VWR</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>M-slide 8孔ibiTreat</td><td>ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>默克密理博</td><td>567530</td><td></td></tr><tr><td>阴性对照（随机RNA）</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>AM4611</td><td></td></tr><tr><td>新生小鼠心脏解离试剂盒</td><td>美天旎生物技术，贝尔吉施格拉德巴赫</td><td>130-098-373</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64位</td><td>尼康仪器，D&amp;uuml;杜塞尔多夫</td><td></td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸，NEAA</td><td>Gibco/Life Technologies，达姆施塔特</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM 低血清培养基</td><td>Gibco</td><td>51985-026</td><td></td></tr><tr><td>P21-siRNA</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>4390771</td><td></td></tr><tr><td>P27-siRNA</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>4390771</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco/Life Technologies，达姆施塔特</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma-Aldrich，施泰因海姆</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>含 DABCO 的聚乙烯醇封片剂&amp;reg;抗荧光淬灭</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10981</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Qiagen</td><td>1007885</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Invitrogen/Life Technologies，达姆施塔特</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>样品容器</td><td>Vitlab</td><td>80731</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管</td><td>格雷纳</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>软件 NIS Elements</td><td>尼康</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. 化合物</td><td>Sakura Finetek/ VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>ToPro3 碘化物 (642/661)</td><td>分子探针/ThermoFisher Scientific</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X</td><td>Fluka</td><td>93418</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka</td><td>93418</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>荧光素标记的麦胚凝集素（WGA）</td><td>Vector Laboratories</td><td>VEC-FL-1021-5</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-肌动蛋白交联蛋白抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Sigma-Aldrich，施泰因海姆</td><td>M3148</td><td></td></tr></tbody></table>

出生后心肌细胞细胞周期变异的可视化及核形成确定

Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes

心肌细胞容易出现细胞周期的变异，例如内复制（在没有核分裂和胞质分裂的情况下持续进行DNA合成）和无胞质分裂的有丝分裂（发生核分裂但不发生胞质分裂）。这类非典型的细胞周期变异导致形成多倍体和多核细胞，而非产生新的细胞。因此，为了准确评估心脏细胞的更新与再生能力，正确识别心肌细胞的细胞核、每个细胞的核数量及其细胞周期状态至关重要。这一点在使用核标记物（如胸苷类似物、Ki-67、PCNA 或 pHH3）来判断细胞周期活性时尤为关键。本文介绍了识别心肌细胞及其核特征，并确定其细胞周期活性的方法。我们采用两种已发表的转基因系统：Myh6-H2B-mCh 转基因小鼠品系，用于明确鉴定心肌细胞的细胞核；CAG-eGFP-anillin 转基因小鼠品系，用于区分真正的细胞分裂与细胞周期变异。将这两种系统结合使用，可显著促进对心脏再生与可塑性的研究。

为了分析siRNA/miRNA对出生后心肌细胞周期活性的影响 体外，于出生后第3天（P3）分离双转基因Myh6-H2B-mCh/CAG-eGFP-anillin小鼠的心肌细胞，并转染可诱导细胞周期活性的miR1995、siRNA p27 和 siRNA Fzr1。与阴性对照相比（图1A），miR199- 的图片（图1B) 和 siRNA p27- (图1C) 转染的心肌细胞表现出细胞周期活性的激活。在eGFP-anillin小鼠模型中，可使用针对Fzr1的siRNA作为转染对照，因为抑制Fzr1会导致转染细胞核内eGFP-anillin融合蛋白的积累，而Fzr1的缺失会抑制APC活性Fzr1Fzr1 是后期促进复合物 E3 连接酶的辅助因子，可靶向 anillin 进行蛋白酶体降解。 图1D 显示转染siRNA Fzr1后3天的心肌细胞共聚焦显微镜整体...

为了区分心肌细胞的细胞分裂与细胞周期变化，我们提供了使用两种转基因小鼠品系的实验方案：Myh6-H2B-mCh 转基因小鼠，用于明确鉴定心肌细胞的细胞核；以及 CAG-eGFP-anillin 转基因小鼠，用于区分细胞分裂与细胞周期的变化。

心肌细胞容易出现细胞周期的变异，例如内复制（在没有核分裂的情况下持续进行DNA合成，以及……）

本实验的总体目标是可视化出生后心肌细胞的细胞周期活性，并确定其核型特征。该方法有助于回答心脏再生领域中的关键问题，例如：心肌细胞是否真正发生分裂，还是仅仅增加了其倍性或转变为多核状态？该技术的主要优势在于，能够以高时空分辨率观察细胞周期的M期，并可通过荧光信号识别心肌细胞的细胞核。演示该实验操作的是本实验室的技术员 Patricia Freitag。若使用非纯合子的配对繁殖小鼠，需首先通过荧光显微镜鉴定转基因小鼠的心脏，检测其 EGFP analin 和 H2B-mCherry 的表达情况。EGFP analin 的细胞核信号在心房边缘处最为明显，通过聚焦组织的不同层次即可观察到。为了分离心肌细胞，将适当数量的心脏放入含有1毫升新生小鼠心脏解离试剂盒酶混合液的1.5毫升离心管中，并用剪刀将心脏剪成小块。随后，将溶液转移至15毫升离心管中。将离心管置于接近水平的位置，在37摄氏度下孵育15分钟，孵育结束时用5毫升移液器吹打组织5到10次以混匀。第三次消化结束后，加入7.5毫升培养基二终止反应，并通过70微米细胞滤网过滤细胞悬液。用3毫升培养基二冲洗细胞滤网，将洗涤液与收集的细胞合并，离心收集细胞。将细胞沉淀重悬于500微升培养基一中进行计数。然后，将每孔 1 × 10⁴ 个细胞接种于 96 孔平底板中，每孔加入 120 µL 培养基 1，接种后离心细胞，再放入细胞培养箱中过夜培养。次日，大多数心肌细胞应已开始搏动。开始转染前，使用 RNase 去污染溶液擦拭实验台面及所有转染用品，以清除任何 RNase。所有材料准备就绪后，向每个孔中加入20微升新鲜制备的siRNA混合物，并将细胞放回培养箱中孵育48小时。两天后，将每个孔中的上清液更换为120微升培养基一，并将细胞放回培养箱中继续孵育至少24小时。孵育结束后，用PBS洗涤细胞一次，随后在4%甲醛溶液中固定20分钟。为了通过共聚焦视频显微镜分析细胞，将培养板转移至共聚焦显微镜载物台上，并启动成像软件。打开 A1plus 设置，选中通道一、通道二、通道三和通道四的复选框。在下拉菜单中，将通道一设置为 DAPI，通道二设置为 eGFP，通道三设置为 RFP，通道四设置为 Cy5。单击通道电压，使用滑动条将每个通道的电压设置为 80。使用滑动条将偏移量设置为零，然后单击“归位”按钮，将针孔设置为初始位置。在下拉菜单中将扫描尺寸设置为 1024 × 1024 像素。单击“优化”以打开 XYZ 尺寸设置窗口，并在建议的 Z 步长下勾选“完美的体素框”。选择 20 倍物镜，并调节激光强度，直至图像既不欠曝也不过曝。当所有参数设置完成后，打开“采集”菜单，选择“扫描大图”，然后在“区域”下选择“当前位置为左上角”。然后将X和Y方向的视野数均设置为3×3，点击扫描。为确定心肌细胞核的数量，点击测量、手动测量和计数。选择具有H2B-mCherry信号的细胞核，对其进行标记并计数。然后，选择α-肌动蛋白in阳性细胞以确定心肌细胞的数量。为计数处于G1期、S期和G2期且具有核EGFP-analin信号的心肌细胞，选择“测量”、“手动测量”和“计数”功能。通过点击标记表达EGFP-analin和H2B-mCherry的细胞核，并手动计数具有有丝分裂特异性EGFP-analin信号（如收缩环和中间体）的心肌细胞。然后，点击“测量”、“手动测量”和“计数”，并标记具有有丝分裂特异性 EGFP analin 信号、胞质信号、收缩环以及中体的 cardiomyocytes。与阴性对照相比，转染 miRNA 和 siRNA 的 cardiomyocytes 显示出细胞周期活性的激活。进行内复制的 cardiomyocytes 表现出 exclusively 核内 EGFP analin 表达，而 undergoing 细胞分裂的 cardiomyocytes 则在 M 期典型定位中显示 EGFP analin 表达。在Langendorff灌注装置中对心脏组织进行酶消化后，可将心房和心室进行机械分离并独立分析，从而能够观察到H2B-mCherry转基因心室心肌细胞，其中含有大量H2B-mCherry阳性双核心肌细胞。相比之下，大多数心房心肌细胞为单核。酶消化后并未获得100%的单细胞群体，但通过α-肌动蛋白染色可显示出横纹结构模式，这进一步有助于区分双核心肌细胞（呈现连续的横纹结构）与细胞双联体。为了分析厚切片中心肌细胞的双核指数，有必要手动浏览图像堆栈，因为细胞核不一定位于同一Z平面内，而麦胚凝集素染色有助于识别细胞边界。通过对成年转基因小鼠心脏固定切片进行三维重建，可检测并自动计数肌纤维钩状结构、染色阳性以及H2B-mCherry阳性的细胞核，从而确定在生理条件下心肌细胞核在组织中的比例。一旦掌握操作技巧，心脏组织解离过程若操作得当，可在两至三小时内完成。在进行该实验操作时，必须持续操作以保持细胞在整个实验过程中的活性。通过本实验流程，可对 microRNA 或其他小分子物质在出生后心肌细胞中促进增殖的作用进行筛选。

visualization-cell-cycle-variations-determination-nucleation

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

细胞周期变化的可视化和核测定心肌出生后

我们已建立了一种在特定条件下利用小分子直接从多能性人胚胎干细胞诱导心肌母细胞的方案，该方法能够大量获得用于心血管修复的人心脏前体细胞和功能性心肌细胞。...

高效诱导多能人胚胎干细胞生成人心脏前体细胞和心肌细胞的小分子方法

通过密度沉降法分离心脏细胞核，并使用抗中心粒周围物质1（PCM-1）抗体对细胞核进行免疫标记，以通过流式细胞术识别和分选心肌细胞核。...

从死后组织中分离心肌细胞核

多能干细胞，包括胚胎干细胞或诱导性多能干细胞（iPS细胞），是获取人类分化细胞（包括心肌细胞）的重要来源。本文将重点介绍iPS细胞向心脏细胞的诱导分化，展示如何通过基于拟胚体的方案获得功能性人类心肌细胞。...

人类心肌细胞的生成：从无饲养层人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞制备方案

本文详细描述了通过选择性调控Wnt信号通路，将人多能干细胞高效分化为心肌细胞的方法，并随后通过流式细胞术分析参考标志物，以评估细胞群体的均一性和身份特征。...

高效率诱导人多能干细胞分化为心肌细胞及通过流式细胞术进行表征

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小鼠胚胎心脏中心肌细胞发育的免疫荧光分析

心肌细胞更新率的定量具有挑战性。本文所述方案通过实现对新生心肌细胞核生成及细胞核倍性的准确且灵敏的定量，为解决这一难题做出了重要贡献。...

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我们介绍一种用于对完整胚胎期和出生后心脏内部标记有荧光蛋白的细胞进行三维成像的实验方案。通过结合组织透明化方法与整体染色技术，可清晰、准确地成像胚胎期或出生后心脏内部的单个荧光蛋白标记细胞。...

单细胞分辨率下透明化胚胎及出生后心脏的成像

传统方法在启动基于悬浮聚集体的人多能干细胞（hPSCs）心肌分化时，常因聚集体的大小和形状不均一而导致培养结果存在异质性。本文介绍一种利用微孔阵列生成尺寸可控的hPSC聚集体，并在促进心肌分化的条件下进行培养的可靠心肌分化方法。...

微孔中聚集体尺寸优化用于人多能干细胞的悬浮法心肌分化

本论文描述了一种利用逆转录病毒介导的Gata4、Hand2、Mef2c和Tbx5递送方法，逐步生成并定量多种重编程心脏亚型的实验方案。...

通过转录因子介导的重编程评估小鼠胚胎成纤维细胞来源的心肌细胞亚型

本研究的目的是建立一种可重复地从成年心脏中分离心肌细胞并测量其DNA含量和核化程度的方法。...

从固定心脏中分离心肌细胞用于免疫细胞化学和倍性分析

人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）为临床前心脏毒性筛选提供了一种替代动物实验的方案。hiPSC-CMs在临床前毒性筛选中广泛应用的一个局限性在于其未成熟、类似胎儿表型的特性。本文介绍了一套高效且快速促进hiPSC-CMs成熟的实验方案。...

高通量心脏毒性筛选：利用成熟的人诱导多能干细胞来源心肌细胞单层

了解利用转基因小鼠可视化心肌细胞周期活动与核倍性的方法。该技术通过高时空分辨率荧光成像区分细胞分裂与多倍体变化，为心脏再生研究提供可靠工具。

出生后心肌细胞细胞周期变异的可视化及核形成确定

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