测量氧化应激性秀丽隐杆线虫在96孔微量滴定板
May 9th, 2015
秀丽隐杆线虫是一种有吸引力的模式生物，可用于研究参与氧化应激抵抗的信号转导途径。在这里，我们提供了一种方案，可以在 96 孔板中使用几种氧化剂来测量秀丽隐杆线虫动物在液相中的抗氧化应激性。
该程序的总体目标是测量氧化应激、ceno Titis 优雅、液体中的线虫抵抗力。这是通过首先将 ROS 诱导剂（如百草枯）溶解在 M 9 Buffer 和 Ali 中，引用溶液和 96 孔微量滴定板来实现的。第二步是将 5 到 8 个同步的晚期 L 4 线虫转移到每个孔中，每个条件至少 12 个孔。
接下来，使用解剖显微镜，每小时测定一次活着和死去的动物的数量，直到大多数动物死亡。最后一步是在进行氧化应激抗性测定前至少 6 天计算在每种情况下的每个时间点存活的动物百分比。准备改良的 young grins only bact PEPIN 或 MYOB 干混料，使 MYOB 培养基在摇动下充分混合。
要制备 1 升 MYOB 培养基，请将 6 克 MYOB 干混液与 17 克琼脂混合，然后用 H2O 高压灭菌器在 122 摄氏度下冲泡 45 分钟。将 MYOB 培养基倒入板中，并使用无菌技术让板在室温下干燥两天。用大肠杆菌、OP 50 细菌接种 100 毫升 LB 肉汤培养基，并在第二天在 37 摄氏度下生长过夜。
用大肠杆菌 OP 50 细菌接种 MYOB 板可让细菌在室温下生长 48 小时。在通过 RNA 干扰完成基因下调的情况下，通过准备 M-Y-O-B-R-N-A-I 饲板开始该程序。高压灭菌后，MYOB 培养基使其冷却至约 55 摄氏度。
然后将异丙基 β D、一种硫代过氧化物或 IPTG 和氨苄青霉素添加到 MYOB 培养基中。倒入板子，让它们在室温下干燥两天 streak E coli HT one 15。琼脂平板上含有氨苄青霉素和四环素的细菌。
一个菌株已用表达对照空载体或 ev 的质粒转化。另一种菌株已用表达靶向 FOLLIN 的双链 RNA 的质粒转化。Mr.NA 第二天在 37 摄氏度的温度下过夜生长。
挑选菌落并接种含有氨苄青霉素的 LB 培养基。在 37 摄氏度下培养培养物过夜。参见含有大肠杆菌 HT one 15 EV 细菌或 HT one 15 Collin one RNAi 细菌的 MYOB RNAi 板，使用前将板在室温下放置 48 小时。
根据检测过程中所需的蠕虫数量准备几个板，让蠕虫在 20 摄氏度下产卵 6 小时。接下来，使用铂丝虫镐去除母体。在显微镜下检查板以评估产卵的数量。
让卵孵化，蠕虫在 20 摄氏度下生长 48 小时。48 小时后，动物应处于 L 四晚或青年阶段。请注意，48 小时孵育仅适用于生长方式与野生型动物相似的突变体。
如果要测试新的突变体，首先监测其发育速度很重要。在这个演示中，将使用百草枯诱导氧化应激。按照随附的实验方案文本中的说明制备新鲜的 100 毫摩尔百草枯溶液。
百草枯是一种危险且剧毒的化合物，必须按照适当的指南进行处理。将 40 微升百草枯溶液移液到 96 的每个孔中。孔板使用至少 12 个孔作为使用铂丝虫镐测试的每种条件的重复。
将 5 至 8 L 4 只幼虫动物转移到每个孔中，说明每种条件的开始时间和结束时间，将 96 孔板置于 20 摄氏度，开始时间一小时后，使用解剖显微镜对死活动物进行评分，在开始计数前轻轻摇动板。即使在发现高强度光后也不移动的蠕虫会被评分为死亡。在高倍率下观察蠕虫形状的尾巴和头部运动，以区分死虫和活虫。
每小时对存活率进行评分，直到大多数蠕虫死亡，并重复此测定至少三次独立时间以确定每个时间点的存活率。首先，通过将转移到每个条件的动物总数相加来计算每个条件的动物总数。好吧，忽略那些被伤害或杀死的动物。
每个时间点的 Transfer next。计算每个条件的动物死亡总数。计算本研究中的死亡百分比和生存百分比。
100 毫摩尔。百草枯用于测定野生 C 型 elegance 与具有抗氧化应激、耐热和缺氧能力的 follin one 突变体的抵抗力。治疗 4 小时后，48.3% 的野生型存活率，而突变动物的存活率为 77.8%。
在用对照、空载体或 follin 喂养的野生型动物之间的比较中获得了类似的结果。一种 RNAi 细菌下调 follin 一种使用 RNAi 的细菌增加了对 100 毫摩尔百草枯的耐药性，这表明使用 RNAi 下调基因功能模拟功能丧失突变一旦掌握，就可以轻松执行该技术来确定改变对氧化应激的抵抗力的基因，并看到优雅。最后，进行这些筛查并看到优雅在治疗与氧化应激相关的人类疾病方面具有巨大的价值和潜力。
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概述
该协议概述了一种使用液相测定法评估秀丽隐杆蚯蚓氧化应激抗性的方法。通过在96孔板中使用各种氧化剂，研究人员可以评估线虫在氧化应激条件下的存活率。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
- 模型生物
背景
- 秀丽隐杆蚯蚓是研究信号传导途径的宝贵模型。
- 了解氧化应激抗性对于洞察细胞存活机制至关重要。
- 氧化应激与各种生物过程和疾病相关。
- 本研究利用液相测定法有效测量抗性。
研究目的
- 测量秀丽隐杆蚯蚓的氧化应激抗性。
- 使用不同的ROS诱导剂进行全面分析。
- 为未来的氧化应激研究建立可靠的协议。
使用的方法
- 在M9缓冲液中溶解ROS诱导剂。
- 将溶液分装到96孔微孔板中。
- 将同步的晚期L4隐杆蚯蚓转移到每个孔中。
- 每小时评估存活率，直到大部分动物死亡。
主要结果
- 在各个时间点计算线虫的存活率。
- 不同条件下显示出不同水平的氧化应激抗性。
- 该协议允许同时比较多个条件。
- 结果有助于理解线虫氧化应激的机制。
结论
- 该协议可有效测量秀丽隐杆蚯蚓的氧化应激抗性。
- 研究结果可能为未来关于氧化应激和细胞韧性的研究提供信息。
- 进一步的研究可以在此方法基础上探索相关的生物学问题。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables high-throughput assessment of oxidative stress resistance in a whole-organism model, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking for oxidative stress-related disorders. By quantifying survival kinetics in a 96-well format, it provides reproducible phenotypic readouts that can inform lead identification and pathway interrogation in discovery pipelines. The approach bridges genetic screening with translational relevance for neurodegenerative, cardiovascular, and metabolic disease programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of genetic modifiers of oxidative stress pathways using loss-of-function and RNAi approaches.
- Operational Value: Supports rapid phenotypic screening of gene function in a conserved model system with human-relevant stress response mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative survival data over time, enabling dose-response and temporal resolution of oxidative stress phenotypes.
- Operational Value: Compatible with 96-well microtiter plates, allowing scalable compound or genetic library screening with minimal reagent consumption.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses a disease-relevant system to model conserved oxidative stress response mechanisms implicated in human pathology.
- Operational Value: Provides a preclinical bridge from target hit validation to mechanistic follow-up in whole-animal contexts.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within early discovery workflows, particularly after initial hit identification and before lead optimization, where phenotypic validation in a whole-organism system de-risks targets linked to oxidative stress mechanisms.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of gene function in oxidative stress resistance, supporting target confidence through phenotypic validation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative survival metrics that support assay standardization and hit confirmation in genetic or chemical screens.
- Analytics: Outputs time-dependent survival percentages that allow comparative analysis across conditions and genetic backgrounds.
- Translational Research: Connects genetic findings to conserved pathways with relevance to human oxidative stress disorders, enabling mechanistic follow-up.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, low-cost platform for repeated use across multiple projects targeting oxidative stress biology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing reliance on cell-only models and capturing systemic stress responses.
- Operational Value: Delivers fast, inexpensive results (within one day) using standardized liquid culture and scoring procedures.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision efficiency by providing early phenotypic evidence of target modulation in a whole-animal system.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on demonstrated effects in a conserved oxidative stress resistance model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in C. elegans handling, synchronization, and phenotypic scoring under dissection microscopy.
- Depends on access to 96-well microtiter plates, liquid handling tools, and controlled incubators at 20°C.
- Necessitates standardized worm transfer and survival scoring criteria to ensure inter-experiment reproducibility.
- Requires validation across genetic backgrounds and stressor concentrations to establish assay robustness.
- Limited to acute oxidative stress models; chronic or developmental stress responses may require alternative designs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:57
Preparation of Media for C. elegans Growth
2:15
Preparation for Gene Downregulation Using RNAi
3:50
Preparation of Age-synchronized L4 Population
4:45
Performing the Oxidative Stress Resistance Assay
6:43
Results: flcn-1(ok975) Mutants are More Resistant than Wild-type C. elegans to Oxidative Stress
7:38
Conclusion
