卡诺哈布迪蒂斯精英热休克反应的测量诱导标准化方法
2020年7月3日
在这里，提出了标准化的协议，以评估在卡诺哈布迪蒂斯埃利根的热休克反应（HSR）的诱导使用RT-qPCR在分子水平，荧光报告器在细胞水平，并在有机体水平的光覆盖。
热休克反应是维持细胞质蛋白酶的基本细胞应激反应途径，可表现为海藻的分子、细胞和有机体水平。我们提出了一系列标准化协议和最佳实践，可对海雷根的热冲击响应进行可靠的诱导，以帮助提高热冲击响应领域的可重复性。我们表明，热耐受性，一种常用的有机体测定并不依赖于热冲击反应。
相反，我们建议使用热回收，一种依赖热休克反应的有机体测定。热休克反应随着产卵的开始而减弱。因此，发育时间是热休克响应实验中必须考虑的一个关键变量。
首先创建同步的蠕虫群体。使用铂丝采摘将大约 10 个格拉维德成年蠕虫转移到新鲜盘子中。确保取出任何可能与成人一起转移的鸡蛋或幼虫。
让蠕虫产卵一小时，然后将成人从盘子里取出。将同步蠕虫保持在 20 摄氏度，直到所需的发育阶段，同时考虑发育时间随每种菌株和蠕虫升高的温度而变化。当蠕虫准备好热冲击时，用石蜡膜包裹板，并使用带铅重量的试管架将其淹没在33摄氏度的循环水浴中一小时。
从水浴中回收盘子，用纸巾擦干。去除石蜡膜，让蠕虫在20摄氏度下恢复6至24小时，这将是GP合成的足够时间。要准备用于成像的幻灯片，请将显微镜幻灯片放在其他两张幻灯片之间，这些幻灯片上有一条实验室胶带。
在水中制作3%的加糖溶液，在微波炉中加热，直到加糖溶解。然后使用一毫升移液器将大约 150 微升的气糖放在幻灯片的中心。立即用空白幻灯片盖住幻灯片，将其垂直放置，以便将其放在实验室胶带上，然后小心地将其卸下。
要固定蠕虫，请将一小滴毫摩尔 levamisole（M9 缓冲液）添加到 agarose 垫的中心，并使用铂线挑将 10 个蠕虫转移到落液中。可选地，将利加米索传播到阿加罗斯垫的外，并在蠕虫瘫痪时将蠕虫与选择对齐。用盖滑盖住蠕虫，并尽快使用荧光显微镜对蠕虫进行成像。
要进行热覆盖测定，请同步蠕虫，并在20摄氏度时保持蠕虫，直到达到所需的发育阶段。然后热冲击他们六个小时。从水浴中取下盘子，让它们在 20 摄氏度下恢复 48 小时。
恢复后，计算在机械刺激后可以立即抓走的蠕虫数量，而不会产生抽搐运动或瘫痪。为了在细胞水平上可视化热休克反应诱导，分析了两种荧光报告器海精灵菌株。在没有热冲击的阴性对照样本中，hsp-16.2记者表现出正常的自动荧光，但hsp-70记者在肛门压照肌中具有组成荧光。
经过一个小时的热冲击后，当RNAi用于在测量记者感应之前击倒hsf-1时，两名记者都观察到了强的荧光。两种菌株的荧光严重减少，表明这些记者是hsf-1依赖型的。为了在分子水平上量化热休克反应的诱导，用rt键PCR测量了两种本地热冲击蛋白。
结果发现，一小时33摄氏度的热冲击导致两个热休克基因的相对表达增加2000倍以上。一项研究结果表明，在6小时热冲击下，在48小时恢复后，蠕虫的正常运动减少了20%。hsf-1 的敲击导致正常运动急剧下降，超过 95% 的蠕虫在被催促后表现出抽搐运动或瘫痪。
相比之下，hsf-1的敲击对热耐受性测定的结果没有显著影响，在热耐受性测定中，蠕虫暴露在连续35摄氏度的温度下，并在不同时间点测量蠕虫的活虫百分比。首次执行此技术时，请确保用石蜡膜包裹板两次，以防止水进入板并破坏实验。分子分析可以使用RNA-seq扩展到基因组分析中。
其他受热休克反应影响的有机体测定可以包括在内，如寿命。在海精灵中将分子、细胞和有机体热休克反应分析关联的独特能力已证明对理解该途径在发育和疾病中的作用具有无价价值。
概述
本文介绍了在分子、细胞和生物体层面评估秀丽隐杆蚯蚓热休克反应（HSR）的标准化协议。该研究强调了发育时间的重要性，并建议使用热恢复作为HSR的可靠评估方法。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 发育生物学
背景
- 热休克反应对于维持蛋白质稳态至关重要。
- 可以在多个生物学层面对HSR进行表征。
- 发育时间影响HSR的诱导。
- 热恢复比热耐受性是评估HSR的更可靠的评估方法。
研究目的
- 提供评估秀丽隐杆蚯蚓HSR的标准化协议。
- 提高热休克反应研究的可重复性。
- 阐明发育时间与HSR诱导之间的关系。
使用的方法
- RT-qPCR用于分子评估热休克蛋白。
- 荧光报告基因用于细胞水平分析。
- 热恢复评估用于生物体水平评估。
- 同步蠕虫种群以获得一致的实验条件。
主要结果
- 在33°C下的热休克显著增加热休克蛋白的表达。
- 热恢复依赖于HSR，而不同于热耐受性。
- 发育时间影响HSR诱导的有效性。
- hsf-1的敲低严重影响热休克后的运动。
结论
- 标准化协议提高了HSR评估的可靠性。
- 理解HSR对于发育和疾病的洞察至关重要。
- 未来的研究可以将这些方法扩展到基因组分析。
常见问题
Executive Industry Relevance
Standardized measurement of the heat shock response in C. elegans enables reproducible assessment of proteostasis mechanisms relevant to neurodegenerative disease and aging research. By integrating molecular, cellular, and organismal readouts, the method supports target validation and mechanistic de-risking in early discovery workflows. Developmental timing controls enhance predictive confidence when translating findings across model systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogate therapeutic hypotheses linking HSF-1 activity to proteostasis maintenance in disease models.
- Operational Value: Use RT-qPCR and fluorescent reporters to quantify target engagement and pathway modulation.
- Predictive Value: Establish dose-response relationships for compounds affecting heat shock protein expression.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepare synchronized worm populations for high-throughput screening of proteostasis modulators.
- Quantitative Output: Measure fold-induction of HSP-16.2 and HSP-70 via RT-qPCR for hit confirmation.
- Scalability: Apply thermal recovery assay to assess organismal fitness after compound exposure.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Correlate HSR induction with phenotypes in models of protein misfolding disorders.
- Translational Continuity: Use thermal recovery as a functional readout bridging cellular stress response to organismal healthspan.
- Risk-Adjusted Decisions: Exclude compounds showing HSF-1-independent effects via thermotolerance assays.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical progression, supporting hypothesis-driven screening and lead optimization through multi-level HSR assessment.
- Discovery Biology: Enable mechanistic interrogation of HSF-1-dependent pathways using genetic and pharmacological perturbations.
- Screening: Deliver reproducible, quantitative readouts for compound libraries targeting proteostasis networks.
- Analytics: Provide normalized expression ratios and recovery percentages for cross-condition comparison.
- Translational Research: Link molecular HSR activation to thermal recovery outcomes for predictive biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establish a standardized platform for repeated use across projects studying aging, neurodegeneration, and stress response.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduction of mechanistic ambiguity through HSF-1-dependent signal detection.
- Operational Value: Standardized protocols minimize variability across labs and experimental batches.
- Strategic Value: Improve go/no-go decisions by filtering compounds lacking true HSR engagement.
- Portfolio Impact: Enable risk-adjusted prioritization based on reproducible proteostasis modulation data.
Implementation Considerations
- Expertise in C. elegans culture, synchronization, and developmental staging.
- Access to qPCR instruments, fluorescence microscopes, and temperature-controlled water baths.
- Standardization of heat shock duration, temperature, and recovery timing across teams.
- Adaptation considerations for different strains and genetic backgrounds.
- Limitation: HSR attenuation during egg laying requires precise developmental staging.
