Name: 卡诺哈布迪蒂斯精英热休克反应的测量诱导标准化方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: 了解秀丽隐杆线虫热休克反应的标准化测量方法，涵盖分子、细胞和个体水平。本方案采用热恢复实验和RT-qPCR技术，帮助研究人员提高实验可重复性并深入理解蛋白质稳态机制。

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本工作得到了 Frank Leslie 捐赠的支持。部分菌株由 CGC 提供，CGC 由美国国立卫生研究院研究基础设施项目（P40 OD010440）资助。

1. C. elegans 的培养与同步化
<ol>
	<li>在接种了 OP50 大肠杆菌（Escherichia coli）的线虫生长培养基（NGM）平板上，于 20 °C 培养线虫，大约每周转移 2 次成虫至新鲜平板10。应注意避免线虫食物耗尽，因为这可能影响其生理状态11。
	<ol>
		<li>NGM 平板的制备。
		<ol>
			<li>在烧瓶中混合 3 g NaCl、2.5 g 胰蛋白胨（Bacto-peptone）、20&#160;g 琼脂，并加入去离子水（DI H2O）至总体积 1 L。</li>
			<li>将混合物高压灭菌以达到消毒目的。</li>
			<li>让混合物冷却至约 50 °C。</li>
			<li>加入 25 mL 1 M KH2PO4（pH = 6）、1 mL 1 M CaCl2、1 mL 1 M MgSO4 和 1 mL 胆固醇（5 mg/mL 溶于 100% 乙醇）。</li>
			<li>采用无菌操作技术，将混合物倒入 6 cm 培养皿中，可制备约 100 个平板。若先将混合物转移至 300 mL 无菌烧杯中，倒板操作会更方便。</li>
			<li>在室温（RT）下静置 1 天，待其完全凝固后，再接种细菌或于 4 °C 保存。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将 OP50 菌接种至 NGM 平板。
		<ol>
			<li>在 LB 培养基中，于 30 °C 或 37 °C 培养过夜至饱和的 OP50 菌液。</li>
			<li>取约 300 µL 菌液滴加至 6 cm NGM 平板中央。</li>
			<li>根据需要在室温（RT）下干燥 1–3 天，使菌膜牢固附着于平板表面。此后平板即可使用或于 4 °C 保存。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过分离新产的卵（下文所述）&#160;或&#160;通过用次氯酸钠裂解成虫收集卵，实现线虫的同步化培养。
	<ol>
		<li>使用铂金丝挑取约 10 只怀卵成虫转移至新鲜平板。若成虫处于成年期第一天，卵产出的同步化效果最佳。</li>
		<li>约 1 小时后，将成虫从平板上移除。根据实验条件和品系不同，每平板通常可获得 40–60 枚卵。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. HSR 报告基因的荧光成像
<ol>
	<li>同步线虫（第1.2节），并在20 °C下培养至所需发育阶段。对于AM446（hsp-70p::gfp）和CL2070（hsp-16.2p::gfp）荧光报告菌株，应在产卵同步化后64小时获得尚未达到生殖成熟期的年轻成虫。 
	注意：发育时间因菌株及培养温度而异。两种热休克反应（HSR）报告菌株相较于N2菌株均表现出轻微的发育延迟。重要的是，HSR诱导强度在生殖成熟开始后大约下降2-4倍（见讨论部分）。</li>
	<li>通过将培养板用石蜡膜包裹，并倒置于33 °C循环水浴中浸泡1小时来进行热激处理。应将一条窄石蜡膜围绕培养板缠绕两圈以密封边缘。切勿覆盖培养板底部，以免影响热传导。使用试管架和铅块将培养板倒置浸入水浴中。如需设置阴性对照组（无热激处理），请务必同时保留对照样本。 
	注意：若石蜡膜密封不严，水会渗入培养板内，此类培养板不得用于数据采集。</li>
	<li>从水浴中取出培养板，用纸巾擦干表面水分，移除石蜡膜，并将线虫在20 °C下恢复培养6–24小时。此恢复期可确保GFP充分合成与正确折叠，为成像做好准备。</li>
	<li>准备用于成像的载玻片。每次使用均应新鲜制备载玻片。
	<ol>
		<li>将3%琼脂糖溶于水中，微波加热至琼脂糖完全溶解。</li>
		<li>将待用的显微镜载玻片置于另外两片载玻片之间，另两片载玻片上贴有实验室胶带作为间隔物，以形成琼脂糖垫的厚度控制。</li>
		<li>使用1,000 µL移液器，在载玻片中央滴加一滴加热后的3%琼脂糖溶液（约150 µL）。</li>
		<li>立即将另一张空白载玻片垂直盖在原载玻片上，使上层载玻片架在两侧带有胶带的载玻片上，从而将琼脂糖液滴均匀铺展成厚度一致的琼脂糖垫。</li>
		<li>小心移除上层载玻片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用200 µL移液器在琼脂糖垫中央加入少量1 mM左旋咪唑（levamisole）M9缓冲液（约5 µL），以固定线虫。随后用铂金丝挑取10条线虫转移至左旋咪唑液滴中，加盖盖玻片。若使用正置显微镜，则无需封片。可选操作：当线虫因左旋咪唑作用而麻痹后，可用铂金丝将线虫推至琼脂糖垫边缘并排列整齐；或使用实验室擦拭纸吸除多余左旋咪唑以实现排列。 
	注意：应尽快成像，因长时间孵育于左旋咪唑中可能影响荧光信号。</li>
	<li>使用荧光显微镜对线虫进行成像。具体成像参数因显微镜型号及软件而异。 
	注意：为直接比较图像荧光强度，应在同一次成像过程中使用完全相同的显微镜设置。避免图像过饱和。</li>
</ol>
3. 使用 RT-qPCR 检测 HSR 基因表达
<ol>
	<li>同步线虫（第1.2节），并在20 °C下培养至所需发育阶段。对于N2品系线虫，尚未达到生殖成熟期的年轻成虫可在产卵同步化后60小时获得。 
	注意：发育时间因品系及培养温度而异。重要的是，热休克反应（HSR）的诱导强度在生殖成熟开始后大约下降2-4倍（见讨论部分）。</li>
	<li>按照步骤2.2所述进行热激处理线虫。</li>
	<li>将培养板从水浴中取出，移除石蜡膜，并立即收集线虫。可通过用1 mL M9缓冲液轻轻冲洗培养板，将液体收集至微量离心管中，随后在400 × g条件下离心1分钟，弃去M9缓冲液来收集线虫。</li>
	<li>使用有机提取法裂解线虫并纯化RNA。
	<ol>
		<li>加入250 µL RNA提取试剂（参见材料表）。</li>
		<li>手动涡旋振荡管子30秒。</li>
		<li>使用微量离心管附件，在4 °C下涡旋振荡20分钟（参见材料表）。</li>
		<li>加入50 µL氯仿。</li>
		<li>涡旋振荡30秒。</li>
		<li>在室温下孵育样品3分钟。</li>
		<li>在4 °C下以≥14,000 × g离心15分钟。</li>
		<li>将水相层（即上层，约125 µL）转移至新的微量离心管中。 
		注意：避免接触有机相层及界面处的物质。</li>
		<li>加入50 µL氯仿。</li>
		<li>涡旋振荡30秒。</li>
		<li>在室温下孵育样品3分钟。</li>
		<li>在4 °C下以≥14,000 × g离心5分钟。</li>
		<li>将水相层（约100 µL）转移至新的微量离心管中。 
		注意：避免接触有机相层及界面处的物质。</li>
		<li>加入等体积（即100 µL）异丙醇沉淀RNA。</li>
		<li>在-20 °C下孵育至少30分钟，最好过夜。 
		注意：实验可在此暂停，RNA可在-20 °C下保存。</li>
		<li>在4 °C下以≥14,000 × g离心≥30分钟，使RNA沉淀成团。</li>
		<li>尽可能吸除上清液，切勿扰动沉淀。 
		注意：沉淀量较小，可能不可见；且沉淀可能未牢固附着于管壁，操作时需小心避免将其冲起。</li>
		<li>用250 µL以RNase-free H2O配制的预冷70%乙醇洗涤沉淀。</li>
		<li>在4 °C下以≥14,000 × g离心≥5分钟。</li>
		<li>尽可能吸除上清液，切勿扰动沉淀。</li>
		<li>短暂离心（室温）以去除残留的70%乙醇。</li>
		<li>将管盖打开，于室温下静置足够时间使沉淀干燥，通常至少20分钟。可用无绒布或铝箔覆盖管口，以防污染。</li>
		<li>用20 µL RNase-free H2O重悬沉淀。</li>
		<li>使用微量分光光度计（2 µL）测定RNA浓度。 
		注意：实验可在此暂停，RNA可临时保存于-20 °C或更低温度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过DNase I孵育去除残留DNA。建议使用市售试剂盒（参见材料表），并遵循制造商说明书操作。
	<ol>
		<li>使用该试剂盒，在37 °C水浴中配制20 µL反应体系，包含500 ng RNA和1 µL DNase I，孵育30分钟。</li>
		<li>向每个样品中加入2.5 µL DNase失活试剂（试剂盒提供），室温孵育5分钟，期间偶尔轻弹或涡旋混合。</li>
		<li>在14,000 × g下离心2分钟。</li>
		<li>避免扰动白色沉淀，将15 µL上清液转移至新的微量管中用于cDNA合成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行cDNA合成。建议使用市售试剂盒（参见材料表），并遵循制造商说明书操作。
	<ol>
		<li>使用该试剂盒，配制20 µL反应体系，包含上一步获得的DNase I处理后的RNA 15 µL和逆转录酶1 µL。</li>
		<li>采用以下程序进行cDNA合成：25 °C孵育5分钟，46 °C孵育20分钟，95 °C孵育1分钟，4 °C保存。</li>
		<li>直接向样品中加入80 µL RNase-free H2O稀释cDNA。</li>
		<li>短暂涡旋混匀后离心，-20 °C保存备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行qPCR。建议使用市售试剂盒（参见材料表），并遵循制造商说明书操作。
	<ol>
		<li>使用该试剂盒，在96孔板的一个孔中配制25 µL反应体系，包含2 µL cDNA以及各200 nM&#160;的&#160;正向与反向引物&#160;。</li>
		<li>用于检测热休克基因hsp-70和hsp-16.2以及18S rRNA（作为归一化对照）的引物序列列于材料表中。可根据需要使用多个归一化对照。</li>
		<li>在检测18S时，将cDNA样品稀释50倍，以确保检测处于线性范围。合适的qPCR条件因所用试剂盒和引物而异（参见代表性结果）。</li>
		<li>使用实时荧光定量PCR检测系统（参见材料表）进行qPCR，循环条件为：95 °C变性5秒，58 °C退火30秒，72 °C延伸30秒，共40个循环。 
		注意：最佳退火温度可能因引物和实验条件而异。</li>
		<li>采用ΔΔCt法或标准曲线法进行定量12。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 用于在生物体水平上测量热休克反应的热恢复实验
<ol>
	<li>同步线虫（第1.2节），并在20 °C下维持至所需发育阶段。对于N2品系线虫，在产卵同步化后60小时可获得尚未达到生殖成熟期的年轻成虫。 
	注意：发育时间因品系及培养温度而异。重要的是，热休克反应（HSR）的诱导强度在生殖成熟开始后大约下降2-4倍（见讨论部分）。</li>
	<li>按照步骤2.2所述对线虫进行热休克处理，持续6小时。</li>
	<li>将培养板从水浴中取出，移除石蜡膜，并在20 °C下恢复培养48小时，使线虫恢复。</li>
	<li>计数在机械刺激后能够立即爬行离开、且无抽搐运动或麻痹现象的线虫数量。 
	注意：6小时孵育适用于研究降低热恢复能力的条件，但若需检测增强热恢复能力的条件，可能需要更长的处理时间。</li>
</ol>

<ol><li>Guisbert, E., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+and+function+of+the+heat+shock+response%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Quality+Control+in+Neurodegenerative+Diseases%22%5BJournal%5D)">The regulation and function of the heat shock response.</a> Protein Quality Control in Neurodegenerative Diseases. , 1-18 (2013).</li>
<li>Li, J., Chauve, L., Phelps, G., Brielmann, R. M., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E2F+coregulates+an+essential+HSF+developmental+program+that+is+distinct+from+the+heat-shock+response%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">E2F coregulates an essential HSF developmental program that is distinct from the heat-shock response.</a> Genes and Development. 30 (18), 2062-2075 (2016).</li>
<li>Hsu, A. L., Murphy, C. T., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+aging+and+age-related+disease+by+DAF-16+and+heat-shock+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor.</a> Science. 300 (5622), 1142-1145 (2003).</li>
<li>Morley, J. F., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+longevity+in+Caenorhabditis+elegans+by+heat+shock+factor+and+molecular+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones.</a> Molecular Biology of the Cell. 15 (2), 657-664 (2004).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在文献中，检测热休克反应（HSR）所使用的温度、时间及设备存在广泛差异，这引入了不必要的限制条件，并导致不同实验室之间的结果难以比较。例如，诱导HSR所采用的温度范围从32–37 °C不等，时间则从15分钟到数小时不等15。然而，已有报道指出，在37 °C条件下，所有发育阶段的线虫在3小时时即出现致死效应，而1日龄成虫在1.5小时时即出现致死15。此外，我们发现将线虫暴露于35 °C会导致非HSF-1依赖性的致死效应，表明该条件不适合用于HSR的分析。相比之下，33 °C下处理1小时的热激条件足以 robust 地诱导热休克基因的强烈表达，同时又足够温和，不会影响线虫的存活能力。事实上，即使在33 °C下暴露长达6小时，也仅有20%的线虫表现出异常运动。因此，我们建议将33 °C处理1小时作为RT-qPCR和荧光报告基因检测的标准化条件。
最近的实验表明，在进行热休克反应（HSR）实验时，对线虫的发育阶段进行准确分期尤为重要。最近有研究显示，在C. elegans中，当雌雄同体个体开始产卵时，HSR的可诱导性会下降（即崩溃）超过&#62;50%5。正确分期线虫至关重要，因为携带突变的品系在发育时间上常存在差异。如果使用温度敏感型突变体，且未按其生殖年龄进行同步化处理，则也会影响实验结果。因此，建议对每个品系都仔细测定产卵起始时间，以确定HSR崩溃发生的时间点。自L4蜕皮后至生殖成熟开始前的时间窗口非常短暂，因此必须格外注意，避免HSR的崩溃无意中导致实验结果的变异性。
除了发育时间外，令人意外的是，温度的微小变化（即使仅1 °C）也会对热激反应（HSR）产生显著影响。例如，秀丽隐杆线虫（C. elegans）中的温度感知神经元对低至±0.05 °C的温度变化具有敏感性16。因此，必须使用能够精确测量温度的温度计。为此，我们建议最佳实践是采用经过校准的测温设备，其精度应足以在±0.1 °C范围内准确测量温度。此外，应使用具备数据记录功能的温度计，以监测随时间变化的温度波动。许多培养箱在不同区域以及不同时间点的温度波动幅度超过1 °C，这可能对HSR实验产生重大影响。作为最佳实践，我们建议使用具有足够隔热性能和良好空气循环的培养箱，以最大限度减少温度波动。在进行热激实验时，我们推荐采用循环水浴作为最佳实践方案。在水浴中，琼脂平板达到目标温度所需时间约为6–7分钟，而在干燥培养箱中则需要长得多的时间15,17。然而，若无循环水浴设备，我们的实验结果表明，在干燥培养箱中按照我们的条件同样可实现有效的HSR诱导。如果使用干燥培养箱，应尽量减少在胁迫期间打开培养箱的次数。
已明确热激基因的诱导依赖于热激反应（HSR）的主要调控因子HSF-1。本文提供了证据表明，两种较为间接的检测方法——荧光报告基因和热恢复实验——同样依赖于HSF-1。值得注意的是，我们发现一种常用的个体水平检测方法——耐热性实验，在使用hsf-1 RNAi的条件下并不依赖HSF-1（图4）。此前已有研究利用hsf-1突变体或阻断HSR的ttx-3突变体得出了类似结果18,19,20。综合这些结果表明，耐热性实验不应被用于HSR相关研究。此外，这也提示最佳实践应是对任何用于测量HSR的检测方法均验证其是否依赖HSF-1。
综上所述，我们提出了一系列标准化的实验方案和最佳实践，用于在 C. elegans 中对热休克反应（HSR）的诱导进行可靠且可重复的测量。我们希望这些方法能够降低 HSR 实验中的变异性，提高实验的可重复性。通过促进不同实验室之间 HSR 研究的直接比较，将有助于加快该领域的研究进展。此外，标准化还将有利于与 HSR 密切相关的衰老及神经退行性疾病的研究。

热休克反应（HSR）是一种由胞质蛋白错误折叠引发的普遍性细胞应激反应，该错误折叠可由温度升高及其他蛋白毒性应激因素引起。HSR 的激活在 秀丽隐杆线虫 导致热休克基因（如）的转录上调 hsp-70 和 hsp-16.2 许多热休克蛋白（HSPs）作为分子伴侣发挥作用，通过直接与错误折叠或受损的蛋白质相互作用，恢复蛋白质折叠稳态，即蛋白质稳态。热休克反应（HSR）的主要调控因子是转录因子热休克因子1（HSF-1），其激活受到多种机制的精密调控。1.
HSF-1 的作用不仅限于应激反应。HSF-1 对正常的生长和发育至关重要，因为&#160;缺失 hsf-1 会导致幼虫发育停滞2。HSF-1 在衰老过程以及以蛋白质聚集体累积和蛋白稳态失衡为特征的年龄相关性神经退行性疾病中也具有重要作用。敲低 hsf-1 会引起蛋白质聚集体的积累并缩短寿命，而过表达 hsf-1 则可减少蛋白质聚集并延长寿命3,4。因此，HSF-1 在分子水平上的调控对机体生理功能和疾病具有广泛的影响。
C. elegans 是研究热休克反应（HSR）的强有力模式生物，因为可以在分子、细胞和个体水平上检测HSR4,5,6。该模型的优势已得到充分展现，例如在C. elegans中发现了HSR通路调控中的关键进展，包括不同组织间HSR调控的特异性差异7,8。此外，C. elegans被广泛用于衰老研究，同时也是模拟与蛋白质稳态失衡相关疾病的新兴研究体系。
尽管对 C. elegans 进行热激实验可以快速且可重复，但在开始之前仍需考虑几个问题。例如，应使用何种温度来诱导热激反应（HSR），以及线虫应暴露多长时间？使用干式培养箱还是水浴更合适？应选用哪个发育阶段的线虫？遗憾的是，不同实验室在研究热激反应时所采用的方法差异很大，这在选择最佳实验方案时造成了困惑，也使得跨研究结果之间的比较变得困难。
我们介绍了利用RT-qPCR、荧光报告基因和热恢复能力检测热休克反应（HSR）的稳健且标准化的实验方案。尽管这三种方法具有互补性，但各自具有独特的优缺点。例如，RT-qPCR是对HSR最直接且定量的检测方法，该检测可轻松扩展以涵盖多种不同的热休克诱导基因。然而，RT-qPCR成本最高，技术难度较大，并需要使用专用设备。相比之下，荧光报告基因的优势在于能够检测HSR诱导在组织特异性上的差异。但其准确量化较为困难，仅能检测高于特定阈值的诱导水平，且需要使用荧光显微镜。此外，本文所描述的报告基因品系在发育上较标准N2品系有所延迟。尽管目前已存在携带单拷贝转基因的新型报告基因品系，但本文未对其进行测试9。第三种检测方法——热恢复实验，其优势在于可在个体水平上提供具有生理相关性的读出结果。然而，该方法的敏感性最低，且最为间接。最后，我们讨论了这些检测方法中常见的一些变异，并提出了一套最佳实践建议，以促进该领域的研究进展。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;18S&lt;/em&gt;-正向引物</td><td></td><td></td><td>TTGCGTCAACTGTGGTCGTG</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;18S&lt;/em&gt;-反向引物</td><td></td><td></td><td>CCAACAAAAAGAACCGAAGT&lt;br/&gt; CCTG</td></tr><tr><td>AM446 rmIs223[phsp70::gfp; pRF4(rol-6(su1006))]</td><td>Moimoto实验室</td><td>&lt;a href=&quot;http://groups.molbiosci.northwestern.edu/morimoto/&quot; target=&quot;_blank">http://groups.molbiosci.northwestern.edu/morimoto/&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C12C8.1&lt;/em&gt;-正向引物</td><td></td><td></td><td>GTACTACGTACTCATGTGTCG&lt;br/&gt; GTATTT</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C12C8.1&lt;/em&gt;-反向引物</td><td></td><td></td><td>ACGGGCTTTCCTTGTTTTCC</td></tr><tr><td>CFX Connect 实时荧光定量PCR检测系统</td><td>Bio Rad</td><td>1855200</td><td></td></tr><tr><td>CL2070 dvIs70 [hsp-16.2p::GFP + rol-6(su1006)]</td><td>&lt;em&gt;Caenorhabditis&lt;/em&gt; 遗传学中心（CGC）</td><td>&lt;a href=&quot;https://cgc.umn.edu/&quot; target=&quot;_blank">https://cgc.umn.edu/&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>带LCD显示屏的EasyLog热敏电阻探头数据记录仪</td><td>Lascar</td><td>EL-USB-TP-LCD</td><td></td></tr><tr><td>Greenough体视显微镜S9i系列</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硬壳96孔PCR板</td><td>Bio Rad</td><td>HSS9601</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;hsp-16.2&lt;/em&gt;-正向引物</td><td></td><td></td><td>ACTTTACCACTATTTCCGTCC&lt;br/&gt; AGC</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;hsp-16.2&lt;/em&gt;-反向引物</td><td></td><td></td><td>CCTTGAACCGCTTCTTTCTTTG</td></tr><tr><td>iScript cDNA合成试剂盒</td><td>Bio Rad</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>iTaq通用Sybr Green超级混合液</td><td>Bio Rad</td><td>1725121</td><td></td></tr><tr><td>激光扫描共聚焦显微镜</td><td>Nikon</td><td>Eclipse 90i</td><td></td></tr><tr><td>MultiGene OptiMax梯度PCR仪</td><td>Labnet</td><td>TC9610</td><td></td></tr><tr><td>N2 (野生型)</td><td>&lt;em&gt;Caenorhabditis&lt;/em&gt; 遗传学中心（CGC）</td><td>&lt;a href=&quot;https://cgc.umn.edu/&quot; target=&quot;_blank">https://cgc.umn.edu/&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop Lite分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-LITE</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M卷膜</td><td>Bemis</td><td>5259-04LC</td><td></td></tr><tr><td>RapidOut DNA去除试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>K2981</td><td></td></tr><tr><td>循环加热水浴锅</td><td>Lauda Brinkmann</td><td>RE-206</td><td></td></tr><tr><td>Traceable铂金超高精度数字温度计</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-081-103</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol试剂</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td>RNA提取试剂</td></tr><tr><td>TurboMix附件</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0564</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2涡旋振荡器</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr></tbody></table>

测量热休克反应诱导的标准方法 秀丽隐杆线虫

Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans

热激反应（HSR）是一种由细胞质蛋白质错误折叠引发的细胞应激反应，其功能是恢复蛋白质折叠稳态，即蛋白质稳态。 秀丽隐杆线虫 在HSR研究中占据独特而重要的地位，因为HSR可在分子、细胞和个体水平上进行评估。因此，分子水平的变化可在细胞水平上被观察，其对生理功能的影响则可在个体水平上进行定量分析。尽管检测HSR的实验方法较为直接，但文献中在时间、温度和实验方法上的差异使得不同研究之间的结果难以比较。此外，这些问题也阻碍了研究人员将HSR分析纳入其研究工作。本文提供了一系列标准化实验方案&#160;采用RT-qPCR、荧光报告系统及生物体热恢复实验，展示了一种稳定且可重复测量热休克反应（HSR）诱导的方法。此外，我们发现一种广泛使用的耐热性实验并不依赖于已被充分证实的HSR主调控因子HSF-1，因此不应将其用于HSR相关研究。最后，本文讨论了文献中这些实验方法存在的变异，并提出了最佳实践建议，以促进该领域内实验结果的标准化，从而推动神经退行性疾病、衰老及热休克反应研究的发展。

采用本论文所述方案，通过荧光报告基因、逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）以及热恢复实验检测了热休克反应（HSR）的诱导。在每种情况下，均使用第1.2节中的步骤获得同步化且尚未达到生殖成熟阶段的年轻成虫线虫。
为在细胞水平上观察热休克反应（HSR）的诱导情况，按照实验方案第2节分析了AM446（hsp-70p::gfp）和CL2070（hsp-16.2p::gfp）两种荧光报告基因品系。在未进行热休克处理的阴性对照样本中，hsp-16.2报告基因仅显示正常的自发荧光，而hsp-70报告基因如先前报道所述，在肛门括约肌中存在组成型荧光表达4（图1A）。在33 °C下热休克处理1小时后，两种报告基因均表现出强烈的荧光信号；然而，不同报告基因的表达模式存在明显差异（图1B）。hsp-70报告基因在肠道和受精囊中荧光最强，而hsp-16.2报告基因在咽部荧光最强。此外，如先前所述，hsp-16.2报告基因在个体间的诱导程度表现出较高的变异性，而hsp-70报告基因则无此现象13。
一种常用的第2节实验变体是在干式培养箱中进行热激，而不是在循环水浴中进行。因此，也对这两种方法进行了比较测试。结果发现，在本实验条件下，两种方案均能有效诱导两种荧光报告基因的表达，但推荐使用循环水浴作为最佳实践（见讨论部分）（图1B）。
为了检测报告基因对转录因子 HSF-1 的依赖性，采用饲喂法 RNAi 进行基因敲低 hsf-1 在检测报告基因诱导前发现，两种菌株在HSF-1敲低后荧光强度均显著降低，表明这些报告基因依赖于HSF-1，与文献报道一致4 (图2）。然而，也观察到在两种报告基因中，咽部荧光均持续存在 hsf-1 基因敲低，这与此前报道一致，即咽部肌肉通过饲喂方式进行RNA干扰具有抗性14.
为了在分子水平上定量分析整个线虫的热激反应（HSR），使用本方案的第3部分通过RT-qPCR检测了两种内源性热休克蛋白（HSP）。样品均设置三个重复，为每对引物生成标准曲线，并对每个样品进行熔解曲线分析以进行质量控制。结果显示，在33 °C下热激1小时，两种热休克基因hsp-70和hsp-16.2的相对表达量增加了2,000倍以上（图3）。这些结果表明，这两个内源性基因均适用于检测HSR的诱导，且在33 °C下热激1小时足以引发显著的反应。然而，在解读热激诱导的绝对程度时应谨慎，因为在未进行热激的情况下，mRNA水平极低。
为了分析生物体对热激的生理反应，采用方案第4部分测试了生物体热恢复实验。结果发现，将线虫暴露于6小时的热激处理中会导致 33 °C 导致在48小时恢复后，正常运动的蠕虫减少了20%（图 4A). 通过喂食RNAi敲低HSF-1转录因子，检测该检测方法对HSF-1转录因子的依赖性 hsf-1 在对线虫施加胁迫之前。研究发现，基因敲低 hsf-1 导致正常运动能力显著下降，伴随 &gt;95%的线虫在用铂金丝触碰后表现出抽搐运动或麻痹。
我们将该热恢复实验与一种广泛使用的替代性个体水平实验（通常称为耐热性实验）进行了比较。在耐热性实验中，线虫被置于干燥培养箱中持续暴露于35 °C的温度下，并在不同时间点测定存活线虫的百分比。使用该实验方法发现，持续暴露于35 °C的对照组线虫在约8小时后全部死亡（图4B）。然而，当通过RNAi敲低检测该实验对HSF-1的依赖性时，发现抑制hsf-1并未导致耐热性下降。此前利用HSF-1突变体也观察到类似结果（见讨论部分）。因此，不建议使用耐热性实验来检测热休克反应（HSR），而应优先采用热恢复法在个体水平上研究HSR。
<img alt="秀丽隐杆线虫中热休克蛋白的表达；GFP荧光，显微镜观察；热应激分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61030/61030fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：利用荧光报告系统检测热休克反应的诱导。 (A) 基础的和（B热诱导表达 hsp-70p::gfp 和 hsp-16.2p::gfp 热休克1小时后的报告基因菌株 33 °C 在水浴或培养箱中。线虫在OP50细菌上培养64小时，进行热激处理，然后在 20 °C 成像前处理8小时。作为对照，(中未进行热激处理的线虫A) 在（B）以匹配热激蠕虫的范围和饱和度。展示的是两次实验重复的代表性图像。比例尺 = 250 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61030/61030fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="RNAi对GFP表达的影响、荧光显微镜、基因调控、C. elegans示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61030/61030fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：利用荧光报告基因检测的热休克反应（HSR）诱导依赖于HSF-1。 携带hsp-70p::gfp和hsp-16.2p::gfp报告基因的线虫品系在对照（L4440空载体）或hsf-1 RNAi平板上培养64小时，随后在33 °C水浴中进行1小时热激处理，再于20 °C恢复8小时后进行成像。图中显示了两个实验重复的代表性图像。比例尺 = 250 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61030/61030fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示在应激条件下热休克蛋白 hsp-70 和 hsp-16.2 的相对 mRNA 水平的柱状图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61030/61030fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：通过RT-qPCR检测HSR诱导。 N2线虫在HT115细菌上培养60小时后，于33 °C水浴中热激1小时。图中显示了hsp-70 (C12C8.1)和hsp-16.2的相对mRNA水平，数据已归一化至未热激对照组。图中数值为四次生物学重复的平均值，误差线表示±标准误（SEM）。采用非配对Student t检验计算统计学显著性。**p &lt; 0.01。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61030/61030fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="热恢复柱状图与热耐受性折线图；hsf-1 RNAi 与对照组；运动率/存活率百分比。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61030/61030fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：热恢复依赖于HSF-1，而热耐受则不依赖于HSF-1。 N2 线虫在对照（L4440）或 hsf-1 RNAi 平板培养 60 小时，然后转移至以下任一条件： （A） A 33 °C 水浴6小时后恢复 20 °C 在评分正常运动（热恢复）前培养 48 h 或 (B) A 35 °C 干燥培养箱中孵育，每2小时取出一次直至死亡（耐热性）。每次实验在两天内独立重复，每次n ≥ 30个个体。显示平均值。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61030/61030fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本文提供了标准化的实验方案，用于在分子水平上通过RT-qPCR检测秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）热休克反应（HSR）的诱导，在细胞水平上利用荧光报告系统进行检测，以及在个体水平上通过热恢复能力进行评估。

热休克反应（HSR）是一种由细胞质蛋白质错误折叠引发的细胞应激反应，其功能是恢复蛋白质折叠稳态，……

热激反应是一种重要的细胞应激反应通路，可维持秀丽隐杆线虫细胞质内的蛋白质稳态，并可在分子、细胞和个体水平上对其进行表征。本文介绍了一系列标准化的实验方案和最佳实践，可在线虫中 robust 地诱导热激反应，以促进该领域研究的可重复性。我们证明，常用于个体水平检测的耐热性实验并不依赖于热激反应。相反，我们建议使用依赖于热休克反应的个体水平检测方法——热恢复实验。热休克反应会随着产卵开始而减弱。因此，在热休克反应实验中，发育时间是一个必须考虑的关键变量。首先建立一个同步化的线虫群体。使用铂金丝挑取约10条带有卵的成虫转移至新鲜培养板中。确保去除随成虫一同转移的任何卵或幼虫。让线虫产卵一小时，然后将成虫从培养皿中移除。将同步化的线虫在20摄氏度条件下培养至所需发育阶段，需注意发育时间因品系不同以及培养温度差异而有所变化。当线虫准备进行热激处理时，用石蜡膜包裹培养皿，并使用带有铅块的试管架将其完全浸入33摄氏度的循环水浴中，持续一小时。从水浴中取出培养板，用纸巾擦干。移除石蜡膜，将线虫在20摄氏度下恢复6至24小时，此时间足以完成GFP的合成。为准备成像用的载玻片，将待用的载玻片置于另外两个载玻片之间，这两个载玻片上需贴有实验室胶带条。在水中配制3%的琼脂糖溶液，放入微波炉加热至琼脂糖完全溶解。然后使用1 mL移液器吸取约150 µL琼脂糖溶液，置于载玻片中央。立即用一片空白载玻片覆盖，将其垂直放置，使其接触实验室胶带并平稳覆盖，然后小心取下。为了固定线虫，先在琼脂糖垫的中央加入一滴1毫摩尔的左旋咪唑（levamisole）M9缓冲液，然后用铂金丝挑取10条线虫转移至液滴中。可选步骤：将左旋咪唑向琼脂糖垫外缘推开，并在线虫瘫痪后用铂金丝将其排列整齐。盖上盖玻片，并立即使用荧光显微镜进行成像。进行热恢复实验时，先同步线虫，并在20摄氏度下培养至所需发育阶段。随后进行6小时的热激处理。将培养板从水浴中取出，在20摄氏度下恢复培养48小时。恢复后，计数那些在机械刺激后能够立即爬行离开、且无抽搐或麻痹现象的线虫数量。为了在细胞水平上观察热激反应的诱导情况，分析了两种带有荧光报告基因的秀丽隐杆线虫品系。在未进行热激的阴性对照样品中，hsp-16.2 报告基因表现出正常的自发荧光，而 hsp-70 报告基因在肛门舒张肌中呈现组成型荧光。热激一小时后，当使用RNAi在检测报告基因诱导之前敲低hsf-1时，两个报告基因均观察到强烈的荧光信号。两种菌株的荧光均显著减弱，表明这些报告基因的表达依赖于hsf-1。为了在分子水平上定量热激反应的诱导情况，采用rt key PCR检测了两种内源性热激蛋白。研究发现，33摄氏度、持续一小时的热激可使两个热激基因的相对表达量增加2,000倍以上。热恢复实验表明，经历六小时热激后，在48小时恢复期结束时，正常运动的线虫比例下降了20%。hsf-1基因敲低导致线虫正常运动能力显著下降，超过95%的线虫在受到刺激后表现出抽搐性运动或瘫痪。相比之下，hsf-1 的敲低对热耐受性实验的结果没有显著影响，在该实验中，线虫被暴露于持续的 35 摄氏度温度下，并在不同时间点测量存活线虫的百分比。首次进行该技术操作时，务必用石蜡膜将培养板包裹两层，以防止水分进入培养板而破坏实验。分子检测可进一步扩展为利用 RNA-seq 进行基因组分析。其他受热激反应影响的生物体水平检测也可包括在内，例如寿命测定。在秀丽隐杆线虫中，能够关联分子、细胞和生物体水平的热激反应检测，已被证明对于理解该通路在发育和疾病中的作用具有重要价值。

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