用于检测实体瘤和液体肿瘤中可靶向突变的下一代测序

本项新一代测序靶向扩增子检测技术的总体目标是检测患者肿瘤中的致病性突变，以用于治疗目的，包括诊断、预后判断以及对靶向治疗的反应评估。该方法可回答一些关键问题，例如患者是否携带可从靶向治疗或替代疗法中获益的基因突变。该技术的主要优势在于，仅需一次检测即可在任何肿瘤组织中同时识别多个基因中常见和罕见的、具有临床可操作性的突变。

由于这些技术和方法极为复杂，且步骤难以掌握，因此必须通过可视化方式来演示该方法。这标志着医学肿瘤学发展的一个关键转折点。随着下一代测序技术在临床中的应用，我们将为患者提供更丰富且更有效的癌症治疗方案。

我们的继续专业发展（CPD）技术专家 Barentt Li、Patrick Candrea、Karthik Ganapathy 和 Joe Grubb 将演示该实验流程。我也会协助完成该过程，以展示检测中较为复杂的部分。根据文本中的操作步骤提取基因组 DNA 后，按照试剂盒制造商的说明书，取两微升提取的 DNA 在荧光计上检测，以获得样品的工作浓度。

为构建扩增子文库，在一个名为杂交板（Hyb Plate）的半裙边96孔板中，加入适量体积的低EDTA TE缓冲液，再向每孔加入5微升引物组的Oligo管溶液，随后向各对应孔中加入100至250纳克的基因组DNA。这是整个流程中最关键的一步，此处任何操作失误都将导致严重后果。加入用于测序的Oligo杂交试剂1后，按照文本方案进行离心，然后将杂交板置于预热至95摄氏度的杂交孵育器中孵育1分钟。

将孵育箱缓慢冷却至40摄氏度后，从孵育箱中取出培养板，将杂交板中每个样品的全部体积转移至先前准备好的、已预洗的对应滤板单元（FPU）中央。盖上FPU，于2,250 ×g、20摄氏度离心3分钟。随后加入45 µL的SW1溶液，再次离心。

用SW1洗涤一次后，再用UB1洗涤一次，向每个样本孔中加入45微升连接延伸混合液3（Extension Ligation Mix 3），上下移液三次以混匀。使用粘性铝箔密封反应板，并将整个FPU组件置于预热至37°C的培养箱中孵育45分钟。为进行PCR扩增加接头，在索引扩增板（Index Amplification Plate，IAP支架）中排列引物，并将所用的索引（indexes）分装至板中相应的孔内，然后向每孔加入22微升PCR预混液2E12，上下移液三次混匀。

根据文本方案，将45分钟的延伸连接反应离心后，向FPU的每个样品孔中加入25微升50毫摩尔的氢氧化钠，并上下吹打至少六次，确保移液枪头接触膜。然后将板子略微倾斜，使用多通道移液器设定为20微升，对FPU板中的氢氧化钠上下吹打至少六次。将FPU中的洗脱液转移至IAP的对应柱中。

在运行文本方案中所述的PCR程序之前，轻轻吹打混匀，以充分将DNA与PCR预混液混合。在确认文库产量后，根据文本方案将样品与磁性纯化 beads 孵育，然后向每孔洗涤后的 beads 中加入30 µL EBT。上下吹打数次，确保beads从管壁脱离。

将平板先进行振荡孵育，随后静置孵育后，置于磁力架上，取20微升上清液转移至一张全新的平板中，该平板称为文库标准化板（Library Normalization Plate，LNP）。在制备好标准化混合液后，通过间歇性颠倒并涡旋震荡溶液，向LNP的每个样品中加入45微升。然后使用透明粘性封板膜密封平板，并在1,800 RPM条件下振荡30分钟。

洗涤磁珠后，将LNP从磁力架上取下，为洗脱样本，向每孔加入30微升新鲜的0.1 N氢氧化钠溶液。然后，以1,800转/分钟振荡LNP5分钟。将LNP放回磁力架，待上清澄清后，将30微升洗脱液转移至预先准备好的储存板中的文库标准化储存缓冲液1中。

将平板弯折，然后向已标记的汇集扩增子文库（Pooled Amplicon Library，简称 PAL）1.5 毫升离心管中加入待测序的每份样品各 5 µL。根据所使用的测序化学体系，将 4 至 10 µL 的 PAL 加入 590 至 596 µL 的 HT1 缓冲液中。清洗并加载流动池。

加入试剂，然后根据屏幕提示启动测序运行。测序运行完成后，执行生物信息学分析流程。

分析运行统计数据，以确保测序文库已通过实验室确定的质量控制指标。最后，在基因组数据浏览器中通过查看 BAM 文件手动审查每个变异位点。以下是用于判断文库制备样本是否通过质控的最关键运行统计数据摘要，不包括平均覆盖深度。如本例病例一中所示，生物信息学分析检测到四个可报告的与急性髓系白血病（AML）相关的突变。

FLT3基因中的一个错义突变，IDH2基因中的一个错义突变，以及NPM1基因中的一个移码突变。FLT3基因突变在约25%的急性髓系白血病（AML）成人患者中被观察到。如该AML患者所示，FLT3激酶结构域点突变对预后的影响尚不明确。

异柠檬酸脱氢酶2（IDH2）编码一种表观遗传修饰因子，在急性髓系白血病（AML）中常发生突变。核仁磷酸蛋白（NPM1）基因的突变是AML中最常见的获得性突变之一。此表格列出了病例二的所有外显子变异。

检测到两个与疾病相关的突变。ERBB2 基因第 20 外显子发生框内插入突变，以及 TP53 基因发生错义突变。HER2/neu（即 ERBB2）编码一种酪氨酸激酶受体。

HER2/neu基因第20外显子插入突变在肺腺癌中出现的比例为2%至4%，构成了肺癌中大多数HER2/neu突变类型。TP53基因改变在癌症中也十分常见。必须密切关注提取DNA的质量和数量。

这对于FFPE样本尤为重要。我们经常遇到DNA产量因样本高度降解而存在较大变异的情况。在临床检测方法的验证过程中，应在将DNA推进至文库构建之前，为每个样本建立DNA质量和数量的评估指标。

除了文库制备之外，通过确定测序运行的阈值、质量控制统计参数、文库制备统计参数、扩增子的测序深度以及最低可报告等位基因频率，来验证生物信息学分析方案至关重要。一旦掌握，文库制备可在一个工作日内完成。然而，整个检测流程还需要更多时间用于DNA提取、测序、数据处理和变异分析。

该实验方案旨在仅针对某些关键热点区域的基因组DNA突变进行分析。还可开展基于RNA的其他检测，以回答其他问题，例如基因的差异表达、相关肿瘤风险以及结构重排等。该领域的主要进展正在不断涌现。

自动化技术的应用以及独特分子条形码的引入，将使实验室能够缩短周转时间、减少样本投入量，并在极低等位基因频率下检测出变异。在癌症样本中检测与疾病相关的突变已有数十年来作为常规诊疗标准。下一代测序（NGS）是一种偏倚更小的并行测序方法，可同时对多种癌症相关基因进行测序，有助于发现多种突变，从而为患者提供更优的治疗方案。

感谢观看，祝您的实验顺利。