新一代测序为可操作的突变在固体和液体瘤检测

这种下一代测序靶向扩增子检测试剂盒的总体目标是检测患者肿瘤中的致病性突变，用于治疗，包括诊断、预后和对靶向治疗的反应。这种方法回答了关键问题，例如患者的基因突变是否可以从靶向或替代疗法中受益。该技术的主要优点是，使用一次检测即可在任何肿瘤组织中检测到跨许多基因的可作突变，包括常见和罕见的突变。

由于技术和技术非常复杂，步骤非常难学，因此直观地演示这种方法至关重要。这是推进肿瘤内科的决定性时刻。随着下一代测序在临床上的采用，我们将为患者提供更多更好的癌症治疗方法。

我们的 CPD 技术专家 Barentt Li、Patrick Candrea、Karthik Ganapathy 和 Joe Grubb 将演示此程序。我还将在此过程中帮助展示分析中更复杂的部分。根据文本方案提取基因组 DNA 后，按照制造商的方案，在荧光计上运行两微升提取的 DNA，以获得样品的工作浓度。

要创建扩增子文库，请在称为 Hyb 板的半裙边 96 孔板中，加入必要体积的低 EDTA TE、5 微升面板的寡核苷酸管，向每个相应的孔中加入 100 至 250 ng 基因组 DNA。这是最重要的一步，因为这里的任何混淆都会产生严重的后果。加入测序试剂 1 的寡核苷酸杂交后，根据文本方案旋转，将 Hyb 板在预热的杂交培养箱中于 95 摄氏度孵育 1 分钟。

将培养箱缓慢冷却至 40 摄氏度后，从培养箱中取出板，并将每个样品的全部体积从 Hyb 板转移到先前制备的相应预洗滤板单元 （FPU） 的中心。盖上 FPU，在 2， 250 倍 G 和 20 摄氏度下离心 3 分钟。然后，加入 45 微升 SW1，再次离心。

用 SW1 第二次洗涤和用 UB1 洗涤后，向每个样品孔中加入 45 微升延伸连接混合物 3，并上下管道 3 次以混合。使用粘合铝箔密封板，并将整个 FPU 组件在预热的 37 摄氏度培养箱中孵育 45 分钟。要对 PCR 扩增进行索引，将引物排列在索引扩增板或 IAP 夹具中，并将正在使用的索引分装到板的相应孔中，然后加入 22 微升 PCR 预混液 2E12，并上下管道 3 次。

接下来，根据文本方案旋转 45 分钟延伸连接反应后，向 FPU 的每个样品孔中加入 25 微升 50 毫摩尔氢氧化钠，并上下管道至少六次，确保移液器吸头与膜接触。然后，将板略微倾斜，将多通道移液器设置为 20 微升，上下移液 FPU 板中的氢氧化钠至少六次。将洗脱液从 FPU 传输到 IAP 的相应列。

轻轻上下移液，使 DNA 与 PCR 预混液彻底混合，然后运行文本方案中概述的 PCR 程序。验证文库产量并根据文本方案使用磁性纯化珠孵育样品后，向每个洗涤珠孔中加入 30 μL EBT。上下移液几次，以确保珠子从试管侧面脱落。

板与磁力板一起孵育并且不摇动，将板放在磁力架上，将 20 微升上清液转移到称为文库归一化板 （LNP） 的全新板中。在制备归一化混合物后，通过间歇倒置和溶液涡旋，向每个 LNP 样品中加入 45 微升。然后，使用透明胶膜密封板，并以 1， 800 RPM 摇动 30 分钟。

洗涤磁珠后，从磁力架中取出 LNP，为了洗脱样品，向每个孔中加入 30 微升新鲜的 0.1 正常氢氧化钠。然后，以 1， 800 RMP 的浓度摇动 LNP 5 分钟。将 LNP 放回磁力架上，清除上清液后，将 30 微升洗脱液转移到储存板中先前制备的文库标准化储存缓冲液 1 中。

弯曲板，然后将每个待测序的样品加入 5 μL 到标记的 Pooled Amplicon Library 或 PAL 1.5 ml 试管中。根据所使用的测序化学方法，将 4 至 10 μL PAL 添加到 590 至 596 μL 缓冲液 HT1 中。清洁并加载流通池。

加载试剂。然后，按照屏幕上的提示开始测序运行。测序运行完成后，执行 Bioinfomatics Pipeline。

分析运行统计数据，以确保测序的文库已通过实验室确定的质量控制指标。最后，在 Genomic Data Viewer 中，通过查看 BAM 文件手动查看每个变体。这是最重要的运行统计数据的摘要，不包括平均覆盖率，用于确定文库制备样品是否已经通过此处看到的案例一，生物信息学检测到四种可报告的 AML 相关突变 QC.As。

FLT3 中的错义突变、IDH2 中的错义突变和 NPM1 中的移码突变。在约 25% 的成年 AML 患者中观察到 FLT3 突变。如在该 AML 患者中所见，FLT3 激酶结构域点突变的预后意义对预后的影响尚不清楚。

异柠檬酸脱氢酶 2 或 IDH2 编码一种在 AML 中常见突变的表观遗传修饰。核磷蛋白 （NPM1） 基因突变是 AML 中最常见的获得性突变之一。下表列出了病例 2 的所有外显子变体。

检测到 2 个疾病相关突变。ERBB2 外显子 20 的框内插入，以及 TP53 中的错义突变。HER2/neu 或 ERBB2 编码酪氨酸激酶受体。

在 2% 至 4% 的肺腺癌中观察到激活的 HER2/neu 外显子 20 插入，并且是肺癌中观察到的大多数 HER2/neu 突变的原因。TP53 变化在癌症中也很常见。有必要密切关注提取的 DNA 的质量和数量。

这对于 FFPE 样品尤其重要。我们尝试经常高度降解且 DNA 产量可变。在临床检测的验证过程中，在将 DNA 推进文库制备之前，应为每个样品建立 DNA 质量和数量的指标。

除了文库制备之外，通过确定测序运行的临界值、质量控制统计数据、文库制备统计数据、扩增子的勇气深度和最小可报告的等位基因频率，验证 Bioinfomatic Spy Plan 也至关重要。掌握后，可以在一个工作日内完成文库制备。但是，整个检测工作流程需要更多的时间进行 DNA 提取、测序、数据处理和变异审查。

该程序旨在仅查看某些关键热点中的基因组 DNA 突变。可以进行其他使用 RNA 的分子量来回答其他问题，例如基因的差异表达、关联风险肿瘤和结构重排。重大进展即将到来。

采用自动化和结合独特的分子条形码将使实验室能够缩短周转时间，使用更少的样品起始量，并以非常低的等位基因频率检测变异。几十年来，检测癌症标本中的疾病相关突变一直是标准护理。NGS 是一种偏差较小的方法，可同时对与许多癌症相关的多个基因进行测序，从而识别多个突变并为患者提供更好的治疗。

感谢您的观看，祝您的实验好运。