Name: 新一代测序为可操作的突变在固体和液体瘤检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: 了解新一代测序靶向扩增子检测技术，用于检测血液恶性肿瘤和实体瘤中的可靶向突变。该方法通过生物信息学分析识别FLT3、IDH2和NPM1等基因突变，为癌症精准治疗提供诊断和预后信息。

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作者谨此感谢 Daniel Wild 在稿件审阅及制作过程中的帮助。

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作者无任何利益冲突需要披露。

由于本文所述的两项NGS检测已进入临床应用，最重要的实际考虑因素是质量控制。具体而言，必须密切注意提取DNA的质量和数量。这一点对于常常高度降解且DNA得率不一的FFPE样本尤为重要。为最大化FFPE样本的DNA得率，已开发出一种异丙醇沉淀法，因为基于柱子的提取方法有时会导致DNA剪切，并受限于洗脱体积较小。因此，当样本的浓度过低或降解程度过高而无法进行检测时，最可能的原因是组织大小、类型或固定方式，而非提取过程本身。对于血液/骨髓样本，若出现提取失败，通常是由于样本血液稀释（i.e.，采集样本中白细胞或肿瘤细胞数量不足）或化疗导致的细胞清除所致。
在验证过程中，应建立DNA质量和数量可接受的阈值。该检测通常推荐输入100 - 250 ng的DNA；然而，如果DNA质量良好，则较低的输入量也可能获得成功。此外，如果DNA质量较差（即，当可扩增DNA的含量低于100 - 250 ng时，增加输入量可提高测序结果的质量（因为可扩增DNA的量将达到推荐的输入量）。在将DNA用于文库构建之前，应对每个样本应用DNA质量和数量的评估指标。对于处于此类情况的样本 &#34;灰色区域&#34; （参见 图2) 应由实验室负责人或其指定人员酌情决定是否进行。目前预测DNA在测序过程中是否表现不佳的最佳方法是进行基于qPCR的检测，以实现对输入DNA的定量和质量评估。该方法通过扩增不同大小的DNA片段，评估样本中不同片段尺寸的生物可利用性，例如， 100 bp、150 bp、200 bp 和 300 bp）以及比较产量。
目前，文库制备涉及大量手动操作步骤，其中多个关键环节的任何失误都可能导致文库制备失败或质量低下。在测序前，微流控凝胶分析是唯一可用于检测文库制备问题的质量控制步骤。因此，在若干关键步骤中格外谨慎，有助于提高反应成功的概率。必须确保为每个样本使用正确的样本和寡核苷酸池。确认并准确记录每个样本均包含96种独特的双索引PCR引物对中的一种组合，可降低样本混淆的风险。此外，必须确保滤板（FPU）正确排液；若排液不充分，可能导致文库制备中的延伸连接步骤表现次优，从而产生低质量的测序数据。在文库质控后，关键步骤是确保LNB1磁珠完全重悬，并在将其加入样本前充分混匀LNB1/LNA1溶液，因为该混合液的浓度用于确定文库的摩尔浓度。最后，若磁珠洗脱步骤导致洗脱的文库量不足，将降低簇密度，可能导致文库无法达到足够的平均覆盖度；反之，文库过量则会导致测序读长质量下降。因此，在基于磁珠的标准化步骤中保持一致性，对于确保文库在测序仪上的最佳混合与簇生成至关重要。
除了文库制备外，验证能够从原始的去多重化 fastq 文件中准确检出突变的生物信息学分析流程也至关重要。选择自定义解决方案可能耗时较长，因为需要从大量开源和商业化的比对工具、变异检出软件及高通量测序（NGS）软件包中进行筛选。还需设计定制算法，以提取关键的性能统计指标，识别大多数开源工具难以发现的独特且反复出现的突变，并确定每个位点的拷贝数状态。在生物信息学分析流程的验证过程中，确定可报告变异的阈值至关重要，这些阈值应满足或超过质控过滤后每个位点的最低测序深度要求例如，至少250条读长）以及最低等位基因频率（例如，4%）。由于这是一种基于多重扩增子的检测方法，确定最低平均测序深度（例如，文库需要达到的测序深度（1,000×），以确保最低表达的扩增子也能达到最低测序读长要求。此外，由于该检测具有多重扩增特性，会导致脱靶效应，这些“伪影”在产品发布前必须被充分发现并经过严格验证。另一个重要的局限性在于，样本中肿瘤含量需超过10%，才能达到经过验证的最低等位基因频率。
检测到低频（1%）的FLT3插入突变表明，在此过程中人工复核仍然十分必要。即使设定5%的等位基因频率作为截断值，仍可能遗漏一些重要突变，因此人工复核对于确认这些变异至关重要。对于FLT3-ITD突变，需对所有急性髓系白血病（AML）患者的第14外显子进行目视检查，以确保不会遗漏低水平或大片段的插入/重复突变。此外，常见的位于引物序列附近的HER2第20外显子插入突变也需要人工干预。尽管生物信息学分析流程已较为完善，但由于上述多数统计指标均设有严格的截断阈值，某些变异仍可能被忽略，这是此类分析方法固有的局限性。未来需要更优的生物信息学工具，以及更佳的文库构建和/或测序技术，以在更低的截断值下获得更高质量的数据，从而减少假象和假阳性结果。
由于肿瘤比例确定困难以及基因组某些区域的扩增偏倚，等位基因频率的检测与解读可能具有挑战性。此外，可检测到超过50%的等位基因频率，如病例2中所观察到的情况。这被解释为杂合性缺失（LOH）事件，可能原因包括正常等位基因的丢失导致突变reads的表观增加、突变等位基因的获得（例如，2个突变拷贝和1个正常拷贝）或其他机制。这些机制可通过使用阵列比较基因组杂交（aCGH19）和/或SNP基因分型芯片20加以阐明。
目前的靶向富集方法依赖于耗时一整天的低效杂交捕获或多重PCR技术，导致单个样本需要更高的测序深度以及更多的非靶向测序读长。在不久的将来，下一代测序（NGS）分子肿瘤学的进一步应用将包括更简便的文库制备方法，这些方法应可完全自动化，并能够处理输入DNA量极低（即，低于1 ng）以及DNA高度降解的样本。为应对这些挑战，大多数方法可能基于PCR技术，无论是多步PCR方法还是大规模并行的单重PCR方法。此外，对单个扩增子进行分子条形码标记已被证明可显著降低测序背景噪声，使得对肿瘤细胞比例更低的样本进行检测成为可能，从而实现更低等位基因频率的检测，并推动循环肿瘤细胞的捕获研究。
在癌症标本中检测与疾病相关的突变已有数十年的标准诊疗实践。传统上，基因检测通常是逐个进行的，每次仅检测一个基因或外显子，一旦发现突变即终止后续检测。下一代测序技术（NGS）的出现使得能够并行检测多种癌症相关基因，从而以更少偏倚的方式识别出多个与肿瘤发生相关的突变。NGS在癌症体细胞突变检测中的临床应用价值日益凸显。事实上，基于NGS的肿瘤样本分析代表了一种新的范式，挑战了传统的单基因检测方法，但其临床价值非常明确。当今的临床实验室面临着令人振奋的机遇，即将严谨的方法学验证和检测结果解读与这一强大技术的应用紧密结合。

近年来，随着越来越多的科学文献强调识别可靶向的遗传改变以及预测性/预后性分子标志物的重要性，临床肿瘤学样本的下一代测序（NGS）已变得更加普及。在上皮性1,2和血液系统3恶性肿瘤中，多基因 panel 分析和全外显子组测序研究已充分证实了肿瘤异质性和克隆进化这一概念，即随着疾病进展和复发，肿瘤不断演化。此外，与聚合酶链式反应（PCR）或桑格测序等竞争性技术不同，NGS 能够在单次检测中识别所有临床相关癌症基因中的大多数基因组变异4。
个性化诊断中心最初推出了两个临床NGS检测面板，分别为定制的血液系统疾病检测面板（Heme-NGS Panel）和现成的用于FFPE样本的癌症检测面板（Solid-NGS Panel）（见图1）。这些面板覆盖了所选基因中具有临床相关性或高度关注的区域；并非所有基因或外显子均被完全覆盖。通过探针杂交后延伸和连接反应生成扩增子。靶向区域随后使用带有通用双索引引物的PCR进一步扩增，可将多达96个样本混合后进行测序。
<img alt="图1" src="/files/ftp_upload/52758/52758fig1.jpg" /> 
图1：检测面板所涵盖基因列表。 文库构建采用两种方法之一：定制的血液病基因检测面板（Heme-NGS Panel），包含33个基因；或现成的扩增子癌症检测面板（Solid-NGS），包含47个基因。并非所有基因或外显子均被完全覆盖，因为某些扩增子可能仅覆盖特定热点区域。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52758/52758fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
血红素NGS panel的内容来源于多个渠道，但核心是急性髓系白血病（AML）中发生突变的16个基因，这些基因此前已被描述为具有较高的临床应用价值5。实体瘤NGS panel为商业化产品，其靶向区域基于癌症中常见突变基因，这些基因信息来自癌症体细胞突变目录（Catalogue of Somatic Mutations in Cancer, COSMIC）数据库的报告6。
临床NGS的整体工作流程包含多个关键步骤。在临床医生下达检测申请后，病理学家会根据肿瘤比例和样本体积的分析结果，判断样本是否符合检测要求。在我们机构，由于测序技术本身存在背景测序错误率（即“噪声”），以及靶向检测方法的效率限制，我们要求肿瘤细胞比例至少达到10%。若组织样本符合检测标准，则提取基因组DNA，并对其进行多项质量控制（QC）检测。若DNA通过QC，则构建扩增子文库并进行测序。所产生的数据通过机构内部的生物信息学流程进行分析。生物信息学分析完成后，对检出的变异进行人工审阅，并评估其致病性，随后将其纳入临床报告。下文将介绍两个经过该严格流程检测的病例，最终均导致了临床管理方案的改变。
病例1 - 急性髓系白血病
患者A的骨髓活检结果诊断为无成熟型急性髓系白血病（AML）。对骨髓标本进行了细胞遗传学研究，结果显示为正常的女性核型。外周血中存在95%的原始细胞，因此送检外周血标本，用于Heme-NGS Panel的个体化诊断检测。
急性髓系白血病（AML）是一种起源于髓系白细胞的血液系统恶性肿瘤。在 AML 中，基因突变的检测对于预后判断和治疗决策日益重要，其中反复出现的基因突变已被认为在疾病发生和预后评估中具有重要意义7。NPM1 和 CEBPA 基因突变与较好的预后风险相关，而 FLT3 基因的内部串联重复（ITDs）则与较差的临床结局相关8。越来越多的证据支持这些及其他基因突变在 AML 发病机制中的致病作用9。
病例2 - 肺腺癌
患者B的左侧锁骨上肿块活检显示为肺腺癌。将来自福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）淋巴结肿块的活检组织以卷状或环状形式送检进行基因组检测（实体瘤NGS panel），肿瘤含量超过50%，旨在确定是否存在可用于靶向治疗干预的突变。
肺癌是美国癌症相关死亡的首要原因，可分为两大类型：非小细胞肺癌（NSCLC）和小细胞肺癌（SCLC）。根据病变的组织学特征，非小细胞肺癌可进一步分为腺癌和鳞状细胞癌。肺腺癌是肺癌中最常见的亚型，在吸烟者和非吸烟者中均可发生，也是非吸烟者中最常见的肺癌类型。10肺腺癌的分子研究表明，多个癌基因均存在突变11最常见的在吸烟者中发现的驱动突变是突变在 KRAS 和 BRAF最常见的非吸烟者突变是突变在 EGFR，以及涉及基因的重排 ALK, RET 和 ROS1. 肺部肿瘤中已发现基因存在框内第20外显子插入 ERBB2 (HER2/神经）。最常见的异常是 HER2/neu 在乳腺癌中，该位点存在扩增，且已有相应的靶向治疗药物（曲妥珠单抗：一种针对该位点的人源化单克隆抗体） HER2/neu）。该 HER2/neu 在2%–4%的肺腺癌中观察到的20号外显子插入突变12 对HER2/neu和mTOR抑制剂（分别为neratinib和temsirolimus）联合治疗显示出部分缓解13.

<table><tbody><tr><td>基因组 DNA ScreenTape</td><td>Agilent Technology</td><td>5067-5365</td><td></td></tr><tr><td>基因组 DNA 试剂</td><td>Agilent Technology</td><td>5067-5366</td><td></td></tr><tr><td>高灵敏度 D1000 ScreenTape</td><td>Agilent Technology</td><td>5067-5584</td><td></td></tr><tr><td>高灵敏度 D1000 试剂</td><td>Agilent Technology</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>TapeStation 2200</td><td>Agilent Technology</td><td>G2965A</td><td></td></tr><tr><td>TapeStation 分析软件</td><td>Agilent Technology</td><td>A.01.04 或更高版本</td><td></td></tr><tr><td>96 孔管储存架</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15/50 ml 管架</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 孔板架</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>单通道移液器，0.5&amp;ndash;2.5 &amp;mu;l</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>单通道移液器，1&amp;ndash;10 &amp;mu;l</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>单通道移液器，2&amp;ndash;20 &amp;mu;l</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>单通道移液器，10&amp;ndash;100 &amp;mu;l</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>单通道移液器，20&amp;ndash;200 &amp;mu;l</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>单通道移液器，100&amp;ndash;1,000 &amp;mu;l</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血清学移液器</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冰桶</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量离心机（适用于管和条带管）</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷冻柜，-20 &amp;deg;C</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &amp;deg;C 冰箱</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水浴或珠浴</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养箱（37 &amp;deg;C）</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血清学移液管，1&amp;nbsp;ml</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血清学移液管，5&amp;nbsp;ml</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血清学移液管，10&amp;nbsp;ml</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血清学移液管，25&amp;nbsp;ml</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>手套</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>刀片/解剖刀</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KimWipes 纸巾</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml 锥形管</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml 锥形管</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>纸巾</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 proof 乙醇</td><td>任意供应商</td><td></td><td>存放于易燃品柜中</td></tr><tr><td>2-丙醇（异丙醇）</td><td>任意供应商</td><td></td><td>存放于易燃品柜中</td></tr><tr><td>25 ml 储液槽</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 N NaOH</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 通道移液器，1 &amp;ndash; 10 &amp;mu;l</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 通道移液器，10 &amp;ndash; 100 &amp;mu;l</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 通道移液器，20 &amp;ndash; 300 &amp;mu;l</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冰桶</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水冲洗瓶</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>酒精冲洗瓶</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>镜头清洁纸</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 孔 PCR 板，半裙边</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 孔管条，0.2&amp;nbsp;ml</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP 磁珠</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>BioShake IQ 或 3000-T elm</td><td>Bulldog Bio/Q.Instruments</td><td>1808-0506/ 1808-0517</td><td></td></tr><tr><td>DropPlate96 S - LabChipDS</td><td>Caliper</td><td>128876</td><td></td></tr><tr><td>DropPlate96 D - LabChipDS</td><td>Caliper</td><td>132848</td><td></td></tr><tr><td>DropSense96</td><td>Caliper (Trinean)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DropQuant 软件</td><td>Caliper (Trinean)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>板密封膜</td><td>Denville</td><td>B1212-5S</td><td></td></tr><tr><td>铝密封箔</td><td>Denville</td><td>B1212-6S</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶纯水系统</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5424 离心机</td><td>Eppendorf</td><td>22621408</td><td></td></tr><tr><td>5804R 离心机</td><td>Eppendorf</td><td>22623508</td><td>均需配备 15 ml 管和板转子，建议使用最高可达 2,500 x g 的离心机。</td></tr><tr><td>Safe-Lock 管 1.5 ml，自然色</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 管，DNA LoBind 管</td><td>Eppendorf</td><td>30108310</td><td></td></tr><tr><td>5430R 离心机</td><td>Eppendorf</td><td>022620645</td><td>任何板转子离心机均可使用</td></tr><tr><td>Hybex 微量样品孵育器</td><td>Fisher Scientific</td><td>1057-30-0</td><td></td></tr><tr><td>Hybex 0.2 ml 管块</td><td>Fisher Scientific</td><td>1057-31-0</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Amplicon &amp;ndash; 癌症 panel</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1008</td><td>96 次反应</td></tr><tr><td>TruSeq 定制扩增子</td><td>Illumina</td><td>PE-940-1011</td><td>96 次反应</td></tr><tr><td>TruSeq 定制扩增子索引试剂盒</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1003</td><td>96 个索引，384 个样本</td></tr><tr><td>MiSeq 试剂盒 v3，500 个循环</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3003</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq 试剂盒 v2，300 个循环</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2002</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq 试剂盒 v2，500 个循环</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2003</td><td></td></tr><tr><td>实验管理器</td><td>Illumina</td><td>1.3 或更高版本</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq 报告软件</td><td>Illumina</td><td>2.0 或更高版本</td><td></td></tr><tr><td>测序分析查看器</td><td>Illumina</td><td>1.8 或更高版本</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq 定制扩增子索引板固定装置和卡环套件</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1007</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq v2</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq 定制扩增子滤板</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1006</td><td></td></tr><tr><td>索引接头替换盖</td><td>Illumina</td><td>11294657</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 0.5 ml 管</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA 宽范围检测试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>Q32853</td><td></td></tr><tr><td>DynaMa6-96 磁力架，侧裙边</td><td>Invitrogen</td><td>120.27</td><td></td></tr><tr><td>GeneAmp PCR 系统 9700（金/银模块）</td><td>Life Technologies</td><td>N8050200</td><td></td></tr><tr><td>Gentra Puregene 血液试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>158489</td><td></td></tr><tr><td>脱蜡溶液（16 ml）</td><td>Qiagen</td><td>19093</td><td></td></tr><tr><td>缓冲液 ATL（4 × 50 ml）</td><td>Qiagen</td><td>939011</td><td></td></tr><tr><td>蛋白沉淀溶液（50 ml）</td><td>Qiagen</td><td>158910</td><td></td></tr><tr><td>DNA 水合溶液（100 ml）</td><td>Qiagen</td><td>158914</td><td></td></tr><tr><td>糖原溶液（500&amp;nbsp;&amp;mu;l）</td><td>Qiagen</td><td>158930</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen 蛋白酶 K</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td></td></tr><tr><td>RNase（5 ml）</td><td>Qiagen</td><td>158924</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水（10 × 50 ml）&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>129114</td><td></td></tr><tr><td>研磨杵</td><td>USA Scientific</td><td>1415-5390</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 10 &amp;#181;l 延长型滤芯吸头，无菌架装，10 架，每架 96 个吸头（共 960 个）</td><td>USA Scientific</td><td>1180-3810</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 100 &amp;#181;l 自然色，斜面滤芯吸头，无菌架装，10 架，每架 96 个吸头（共 960 个）</td><td>USA Scientific</td><td>1180-1840</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 200 &amp;mu;l 自然色，斜面滤芯吸头，无菌架装，10 架，每架 96 个吸头（共 960 个）</td><td>USA Scientific</td><td>1180-8810</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 20 &amp;mu;l 自然色，斜面滤芯吸头，无菌架装，10 架，每架 96 个吸头（共 960 个）</td><td>USA Scientific</td><td>1180-1810</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 1,000 &amp;mu;l 自然色，带刻度 XL 滤芯吸头，</td><td>USA Scientific</td><td>1182-1830</td><td></td></tr></tbody></table>

用于检测实体瘤和液体肿瘤中可靶向突变的下一代测序

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

随着我们对癌症发生和进展所需驱动突变的理解不断深入，我们获得了关键信息，可用于预测肿瘤特定分子谱对治疗药物的反应性，或提供有关预后的知识。本机构已将肿瘤基因分型项目纳入常规临床诊疗，利用两种下一代测序（NGS）检测面板，对血液系统肿瘤和实体瘤进行广泛突变谱筛查：一种是定制的33基因血液系统恶性肿瘤检测面板，适用于外周血和骨髓样本；另一种是商业化的实体瘤检测面板，适用于甲醛固定石蜡包埋组织，靶向47个在癌症中常见突变的基因。我们的工作流程包括由病理学家对活检样本进行评估，以确保肿瘤含量满足检测要求，随后对样本进行定制化的DNA提取。样本质量控制包括对DNA的数量、质量和完整性进行评估，只有通过上述指标检测的DNA才会用于扩增子文库构建并进行测序。所得数据通过本机构自建的生物信息学分析流程进行处理，对检出的变异进行致病性审阅与解读。本文通过两个临床病例，简要展示两种检测面板的应用价值，说明设计良好的NGS工作流程如何助力优化临床诊疗结果。

病例1 - 血红素NGS panel
从白血病外周血中提取的DNA质量与数量均满足Heme-NGS Panel检测要求（176 ng/µl）。总体平均覆盖深度为4,933x（高于最低要求的1,000x平均覆盖深度）。其他运行统计数据见表3。在8个覆盖深度低于250x的区域中，3个是由于引物修剪不当所致（即，因测序错误导致引物序列未能正确去除），1个为该检测已知的技术假象，其余4个为不同基因外显子的部分区域，均无临床可报告的变异。尽管我们的临床检测方案仅要求报告覆盖深度至少为250×的变异，但所有覆盖深度不低于100×的数据均会被导入数据库以供审阅。
生物信息学分析流程的数据处理检测到三个可报告的、与疾病相关的突变；其中包含一个错义突变 FLT3，一个错义突变在 IDH2，以及一个移码突变 NPM1外显子变异及其等位基因频率在下文中有详细描述 表4一种常见突变在 FLT3 是 FLT3-内部串联重复（ITD），该变异未被我们的分析流程自动识别，需对第14外显子进行目视检查。对第14外显子的目视检查显示 FLT3 在提交的样本中未发现插入或重复现象。 FLT3 I836del 的等位基因频率为1%，由于低于经过验证的5%最低等位 基因频率阈值，因此未被纳入最终报告。该突变与 FLT3 D835Y 变化（即，在同一扩增子区域观察到，但不在 &#34;顺式&#34; 在任何测序读段中均未发现），仅在验证 p.D835Y 变异时通过手动审查 .bam 文件观察到。这两个变异的等位基因频率较低 FLT3 突变提示这些突变可能代表异质性或克隆进化；然而，这种差异也可能是由于该扩增子的检测性能，或引物序列附近或重叠区域的单核苷酸多态性（SNP）影响了该等位基因的扩增所致。
AML病例1的Heme-NGS panel检测结果发现了以下突变 FLT3, IDH2 和 NPM1，急性髓系白血病中三个常见突变基因. 突变在 FLT3 在约25%的成人急性髓系白血病（AML）患者中可观察到（COSMIC数据库）17）且为内部串联重复（ITDs）或酪氨酸激酶结构域的错义突变。 FLT3-ITDs 是较为常见的突变类型，且与对标准化疗的不良反应相关，而其预后意义 FLT3 激酶结构域的点突变（如该急性髓系白血病患者中所见）对预后的影响尚不明确14异柠檬酸脱氢酶2（NADP+），线粒体（IDH2) 是一个编码表观遗传修饰因子的基因，在急性髓系白血病（AML）中常发生突变。表观遗传修饰因子的突变在 AML 中相对常见，其中表观遗传修饰因子的突变包括 IDH1 和 DNMT3A 代表此类基因中导致基因表达失调的其他突变。核磷蛋白（nucleophosmin）基因的突变NPM1) 是急性髓系白血病（AML）中最常见的获得性突变之一，通常被认为是一个良好的预后因素（在不存在其他高危因素的情况下）。 FLT3-ITD).
NPM1 与 IDH2 的共突变在文献中被描述为一种预后良好的指标5，其3年总生存率为89%。与 NPM1 和 IDH2 野生型患者31%的3年总体生存率相比，这一数据代表了显著的生存获益。例如，当前的标准诊疗实践包括对 NPM1 和 FLT3-ITD 突变进行检测。在此情况下，若仅检测到 NPM1 突变，则无法准确评估患者的危险分层，因为伴随的二次突变可能为有利因素（例如，IDH2）或不利因素（例如，TET2），从而降低医生对避免进行骨髓移植决策的信心。
案例2 - 固体组织NGS panel
从FFPE组织中提取的DNA质量与数量均满足Solid-NGS Panel检测要求，其浓度为252 ng/µl，仅有4%的DNA片段小于1,000个碱基对（bp）。数据分析结果显示，平均测序深度为9,167×（远高于我们设定的1,000×最低测序深度阈值），且无任何区域的测序深度低于250×。其他质量控制指标见表3。
通过生物信息学分析流程处理的数据检测到两个与疾病相关的突变：ERBB2（Her2/neu）第20号外显子中的一个框内插入突变以及TP53中的一个错义突变。所有外显子变异及其等位基因频率均列于表5中。该ERBB2插入突变实际上代表一段串联重复的（Her2/neu）序列，这一点在命名中已有体现。框内插入突变的识别与确认需通过IGV对测序读长进行人工审阅。所检测到的突变频率高于50%，如TP53和Her2/neu突变所示，提示可能发生杂合性缺失（LOH）事件（见讨论部分）。
针对第2例肺腺癌患者的Solid-NGS Panel检测结果发现了ERBB2（HER2/neu）和TP53基因的突变，这两个基因目前尚未被常规纳入肺癌患者的标准诊疗检测范围。HER2/neu编码一种酪氨酸激酶受体，与肺癌中另一常见突变基因EGFR具有相似性。HER2/neu外显子20插入突变在肺腺癌中发生率为2%–4%，构成了肺癌中大多数HER2/neu突变类型，通常出现在其他驱动基因（如EGFR和ALK）无突变的肿瘤中12。已有多个研究证据表明，携带激活型HER2/neu插入突变的患者可能从多种治疗方案中获益，包括使用HER2/neu抑制剂联合mTOR抑制剂治疗后出现部分缓解13，以及采用单克隆抗体曲妥珠单抗（Trastuzumab）联合化疗实现显著疾病控制15。在癌症中发现TP53基因改变并不罕见，但目前尚无针对该突变的可操作性治疗手段。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>案例 1</td>
			<td>案例 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>起始读段总数</td>
			<td>2,215,926</td>
			<td>2,129,110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>比对上的读段百分比</td>
			<td>98.42%</td>
			<td>98.29%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>靶向区域读段百分比</td>
			<td>99.01%</td>
			<td>97.29%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>过滤后靶向区域读段百分比</td>
			<td>97.60%</td>
			<td>95.45%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>可用读段百分比</td>
			<td>94.87%</td>
			<td>91.79%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>覆盖深度超过 250x 的碱基百分比</td>
			<td>98.40%</td>
			<td>100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>覆盖深度超过 1000x 的碱基百分比</td>
			<td>95.90%</td>
			<td>99.70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>覆盖深度低于 250x 的扩增子数量</td>
			<td>8</td>
			<td>0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：测序运行质控指标。 这是用于数据审查以确定文库制备样本是否通过质控的最重要运行统计信息的汇总，不包括平均覆盖度。如果所有百分比均高于90%，则整个流程视为成功；但由于FPU清洗步骤中SW1或UB1的残留，或引物串扰，可能导致“靶上百分比”处于80%至90%的较低范围。如果“比对率”过低，则提示可能存在细菌或其他DNA污染，因为所有样本均应比对至人源基因组。当任何一项指标低于80%时，该样本将被标记以进行进一步审查，以帮助确定后续处理方案并优化实验流程。
<img alt="表4" src="/files/ftp_upload/52758/52758tbl4.jpg" /> 
表4：病例1结果。 列出了高于5%等位基因频率报告标准的致病性、疾病相关性、意义未明变异（VUS）以及可能良性外显子变异。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52758/JoVE_Table_4.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
<img alt="表 5" src="/files/ftp_upload/52758/52758tbl5.jpg" /> 
表 5：病例 2 结果。 列出了高于报告标准（等位基因频率 5%）的致病性、与疾病相关、意义未明的变异（VUS）以及可能良性的外显子变异。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52758/JoVE_Table_5.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充图1：基于扩增子的SampleSheet.csv示例。 该文件用于向测序仪传递运行所需的参数信息，包括所使用的化学试剂类型（本例中为扩增子）、工作流程（例如，GenerateFastq）、应用与检测类型（例如，FastqOnly）、测序的碱基数（或读长，本例中为186 bp × 186 bp），以及最后各特定索引（index）所对应的样本信息（本例中采用双端索引）。标黄部分可根据实验人员的具体需求进行修改，但在本例中，实验室采用这些参数设置。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52758/SupplementaryFigure1.pdf" target="_blank">请点击此处下载该图。</a>

本文描述了两种下一代测序 panel 的临床方案。其中一个 panel 检测血液系统恶性肿瘤，而另一个 panel 则靶向在实体瘤中常见突变的基因。对人类恶性肿瘤中驱动突变进行分子分型可提供重要的预后和预测信息。

随着我们对癌症发生和进展所需驱动突变的理解不断深入，我们获得了关于特定……如何发挥作用的关键信息

本项新一代测序靶向扩增子检测技术的总体目标是检测患者肿瘤中的致病性突变，以用于治疗目的，包括诊断、预后判断以及对靶向治疗的反应评估。该方法可回答一些关键问题，例如患者某个基因中是否存在突变，从而判断其是否可从靶向治疗或替代疗法中获益。该技术的主要优势在于，仅需一次检测即可在任何肿瘤组织中同时识别多个基因中常见及罕见的、具有临床干预意义的突变。由于这些技术与设备极为复杂，且操作步骤难以掌握，因此必须通过视觉化方式演示该方法。这标志着医学肿瘤学发展的一个关键性时刻。随着下一代测序技术在临床中的应用，我们将为患者提供更丰富且更有效的癌症治疗方案。我们的继续专业发展（CPD）技术专家 Barentt Li、Patrick Candrea、Karthik Ganapathy 和 Joe Grubb 将演示该实验流程。我也会协助完成该过程，以展示检测中更为复杂的部分。按照文本方案并遵循制造商的说明提取基因组DNA后，取两微升（2 µL）提取的DNA在荧光计上检测，以获得样品的工作浓度。为构建扩增子文库，在一个名为杂交板（Hyb Plate）的半裙边96孔板中，加入适量体积的低EDTA TE缓冲液，5微升引物组的寡核苷酸管（Oligo Tube）溶液，并向每个对应的孔中加入100至250纳克的基因组DNA。这是整个流程中最关键的一步，此处任何操作失误都将导致严重后果。加入用于测序的寡核苷酸杂交试剂1（Oligo Hybridization for Sequencing Reagent 1）后，按照文本方案进行离心，随后将杂交板置于预热至95摄氏度的杂交孵育器中孵育1分钟。将孵育箱缓慢冷却至40摄氏度后，从孵育箱中取出培养板，将杂交板中每个样本的全部体积转移至先前准备好的、已预洗的对应滤板单元（FPU）中央。盖上FPU，于2,250 × g、20摄氏度条件下离心3分钟。随后加入45 µL的SW1溶液，再次离心。 用SW1缓冲液再次清洗并用UB1缓冲液清洗后，向每个样本孔中加入45 µL的延伸连接混合液3，上下吹吸混匀三次。使用粘性铝箔密封反应板，并将整个FPU组件置于预热至37°C的培养箱中孵育45分钟。为进行PCR扩增加索引，在索引扩增板（IAP夹具）中排列引物，并将所用的索引加入板中对应的孔内，然后每孔加入22 µL PCR预混液2E12，上下吹吸混匀三次。根据文本方案，将45分钟的延伸连接反应离心后，向FPU的每个样品孔中加入25微升50毫摩尔的氢氧化钠，并上下吹打至少六次，确保移液枪头接触到膜。然后将板子略微倾斜，使用多通道移液器设定为20微升，对FPU板中的氢氧化钠上下吹打至少六次。将FPU中的洗脱液转移至IAP中对应的柱子。在运行文本方案中所述的PCR程序之前，轻轻吹打混匀，以充分将DNA与PCR预混液混合。在确认文库产量后，根据文本方案将样品与磁性纯化 beads 孵育，然后向每孔洗涤后的 beads 中加入30 µL EBT。上下吹打数次，确保beads从管壁脱离。将平板先进行振荡孵育，随后静置孵育后，置于磁力架上，取20微升上清液转移至一个全新的平板中，该平板称为文库标准化板（Library Normalization Plate，LNP）。在制备好标准化混合液后，通过间歇性颠倒并涡旋震荡溶液，向LNP的每个样品中加入45微升。然后使用透明粘性封膜密封平板，并在1,800 RPM条件下振荡30分钟。洗涤磁珠后，将LNP从磁力架上取下，为洗脱样品，向每个孔中加入30微升新鲜的0.1 N氢氧化钠溶液。然后，以1,800转/分钟振荡LNP 5分钟。将LNP重新放回磁力架上，待上清液澄清后，将30微升洗脱液转移至储存板中预先准备好的文库标准化储存缓冲液1中。将板弯曲后，向已标记的扩增子文库混合液（Pooled Amplicon Library，简称 PAL）1.5 毫升离心管中加入各待测序样品 5 µL。根据所使用的测序化学体系，将 4 至 10 µL 的 PAL 加入 590 至 596 µL 的 HT1 缓冲液中。清洗并加载流动池。加入试剂。然后，根据屏幕上的提示启动测序运行。测序运行完成后，执行生物信息学分析流程。分析测序运行统计数据，以确保文库已通过实验室设定的质量控制指标。最后，在基因组数据浏览器中通过查看 BAM 文件手动审查每个变异位点。以下是用于判断文库制备样本是否通过质控的关键运行统计数据摘要（不包括平均测序深度）。如病例一中所示，生物信息学分析检测到四个可报告的与急性髓系白血病（AML）相关的突变。FLT3基因中的一个错义突变、IDH2基因中的一个错义突变以及NPM1基因中的一个移码突变。FLT3基因突变在约25%的急性髓系白血病（AML）成人患者中被观察到。如该AML患者所示，FLT3激酶区点突变的预后意义对预后的影响尚不明确。异柠檬酸脱氢酶2（IDH2）编码一种在急性髓系白血病（AML）中常见突变的表观遗传修饰因子。编码核仁磷酸蛋白（NPM1）的基因突变是AML中最常见的获得性突变之一。此表格列出了病例二的所有外显子变异。检测到两个与疾病相关的突变。ERBB2 基因第20外显子发生了一个框内插入突变，以及 TP53 基因的一个错义突变。HER2/neu（即 ERBB2）编码一种酪氨酸激酶受体。HER2/neu第20号外显子插入突变在肺腺癌中出现的比例为2%至4%，构成了肺癌中大多数HER2/neu突变类型。TP53基因改变在癌症中也十分常见。必须密切关注提取DNA的质量和数量。这对于FFPE样本尤为重要。我们常常遇到DNA降解严重且DNA得率不一的情况。在临床检测的验证过程中，应在将DNA推进至文库构建之前，为每个样本建立DNA质量和数量的评估指标。除了文库制备外，通过确定测序运行的截断值、质量控制统计、文库制备统计、扩增子的测序深度以及最低可报告等位基因频率，来验证生物信息间谍计划（Bioinfomatic Spy Plan）也至关重要。一旦掌握，文库制备可在一个工作日内完成。然而，整个检测流程还需要更多时间用于DNA提取、测序、数据处理和变异分析。该实验方案旨在仅检测某些关键热点区域内的基因组DNA突变。还可采用基于RNA的其他检测方法，以回答其他问题，例如基因的差异表达、相关肿瘤风险以及结构重排等。该领域即将迎来重大进展。自动化技术的应用以及独特的分子条形码技术的引入，将使实验室能够缩短周转时间，减少样本投入量，并在极低等位基因频率下检测出变异。在癌症样本中检测与疾病相关的突变已有数十年的标准诊疗实践。下一代测序（NGS）是一种偏倚更小的测序方法，可同时平行检测多种癌症相关基因，从而识别出多种突变，为患者提供更优的治疗方案。感谢观看，祝您的实验顺利。

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癌症研究

新一代测序为可操作的突变在固体和液体瘤检测

我们描述了条形码DNA文库的制备，以及随后基于杂交的外显子捕获方法，用于通过大规模并行的“下一代”测序技术在临床肿瘤样本中检测关键的癌症相关突变。靶向外显子测序具有高通量、低成本和深度测序覆盖的优势，因而能够高灵敏地检测低频突变。...

通过外显子捕获与大规模并行测序检测肿瘤标本中的体细胞遗传改变

本文描述了一种用于肿瘤学样本靶向二代测序的集成系统。该跨平台系统针对质量差、数量少的肿瘤活检样本进行了优化，可兼容低量DNA输入，包含经过充分表征的多变异对照，并采用一种新型变异检出算法，该算法结合了定量的分析前质量控制指标。...

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本文描述了一种用于检测循环肿瘤DNA（ctDNA）中低频突变的技术——ER-Seq。该方法的独特之处在于采用了双向错误校正、特殊的背景过滤以及高效的分子富集。...

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从肿瘤组织中获取高质量基因组DNA是利用下一代测序技术分析遗传变异的关键第一步。本文介绍一种简单快速的方法，可从印片细胞学标本中富集肿瘤细胞并提取完整的DNA。...

利用触印细胞学技术从临床病理标本中简单快速获取高质量肿瘤DNA的方法

在临床诊断中，检测血液中的循环核糖核酸（cRNA）是一个尚未满足的需求。本文介绍了利用高灵敏度和特异性的数字聚合酶链式反应，对非小细胞肺癌患者来源的cRNA进行表征的方法。该检测方法符合设计要求，可在72小时内检测出融合变异体。...

一种基于血液的检测方法，利用数字聚合酶链式反应检测循环核糖核酸中的ROS1与RET融合转录本

本文介绍了一种检测患者生物流体（生物液体）中循环DNA内肿瘤体细胞突变的实验方案。我们基于微滴数字聚合酶链式反应（dPCR）的方法可定量检测肿瘤突变的等位基因频率（MAF），为肿瘤的诊断以及对肿瘤治疗反应的时序性监测提供一种微创的补充手段。...

患者生物流体中肿瘤相关循环DNA的检测与监测

本文介绍了一种用于识别特定患者不同样本中克隆性和亚克隆性改变的方法。尽管此处描述的实验集中于某一特定肿瘤类型，但该方法可广泛适用于其他实体瘤。...

通过靶向测序方法进行比较性病变分析

本文详细介绍了使用基于锚定多重聚合酶链式反应的文库制备试剂盒，随后进行高通量测序，以检测临床实体瘤样本中的致癌基因融合。文中描述了湿实验操作和数据分析的各个步骤。...

使用锚定多重聚合酶链式反应联合下一代测序检测致癌基因融合

本文中，我们介绍了一种非侵入性液体活检技术的详细方案，包括血液采集、血浆和白细胞层分离、游离DNA（cfDNA）与种系DNA提取、cfDNA或种系DNA的定量，以及cfDNA片段富集分析。...

癌症患者血浆样本中游离DNA的检测

非鳞状非小细胞肺癌（NS-NSCLC）治疗管理中需检测的分子生物标志物日益增多，推动了快速且可靠的分子检测方法的发展。本文介绍了一种采用超快速下一代测序（NGS）技术对NS-NSCLC患者进行基因组变异评估的工作流程。...

基于超快速扩增子的非小细胞非鳞状肺癌下一代测序

本方案描述了一种用于检测非小细胞肺癌（NSCLC）福尔马林固定石蜡包埋组织中可靶向基因组改变的自动化、通过ISO15189认证的下一代测序工作流程。...

使用下一代测序技术检测非小细胞肺癌中的可靶向基因变异

了解新一代测序靶向扩增子检测技术，用于检测血液恶性肿瘤和实体瘤中的可靶向突变。该方法通过生物信息学分析识别FLT3、IDH2和NPM1等基因突变，为癌症精准治疗提供诊断和预后信息。

用于检测实体瘤和液体肿瘤中可靶向突变的下一代测序

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