使用高分辨率技术检测脑切片中轴突定位的mRNA 原位 杂交

以下实验的总体目标是检测成年脑组织样本中意外定位的 mRNA。该目标通过预处理实现：首先将样本煮沸并进行蛋白酶消化，以暴露 mRNA 分子；第二步进行杂交，随后进行扩增和检测，从而实现目标 mRNA 的可视化。

接下来，使用抗体或染料对轴突进行染色，以验证目的 mRNA 是否定位于轴突中。结果显示，通过不同的抗原修复方法和计数器，结合基于显微镜分析的染色方法，在脑组织样本中检测到 TF four mRNA 的存在。该方法有助于回答神经科学领域的一些问题，例如哪些 mRNA 在无外显子的情况下仍可定位于轴突并进行翻译。

尽管该方法可为细胞内蛋白质合成提供研究线索，但也可应用于其他存在 mRNA 定位的系统，例如树突以及非神经元细胞和组织。根据书面实验方案中的说明固定脑切片后，准备一个含有 60 毫升抗原修复液的 Copin 瓶，并将载玻片浸入该溶液中。接下来，用一个一升的烧杯装入蒸馏水并放入微波炉中，以缓冲热量。

进行抗原修复时，将装有切片和修复液的共平面染色缸放入微波炉中。用高火煮沸切片5分钟。在溶液停止沸腾后立即再次用高火加热切片额外5分钟。

将载玻片在室温下冷却。冷却后，将载玻片浸入盛有 PBS 的培养皿中进行洗涤，随后再重复洗涤两次。洗涤完成后，将载玻片置于平坦表面上，并在两到三个脑切片上作为对照加入两到三滴或 100 µL DAP B.探针。为评估背景染色，在实验组切片上加入两到三滴靶向探针。为检测目标 RNA，此处使用靶向小鼠 a TF four RNA 第 20 至 1381 位核苷酸的探针。使用镊子将封片膜覆盖在载玻片上，以防止探针蒸发。

然后将载玻片放入杂交炉内的湿盒中，在40摄氏度下孵育两小时。孵育结束后，在室温下用一倍洗涤缓冲液将载玻片在培养皿中洗涤两分钟。接着，向每张脑切片加入两到三滴扩增试剂a MP one fl。

然后用新鲜的封口膜覆盖，放入载片盒中，在杂交炉中于 40 摄氏度孵育 15 分钟。按照之前的方法洗涤载片后，向每张脑切片加入两到三滴扩增试剂 A MP four fl，并用 perfil 覆盖。将载片放入载片盒中，在杂交炉中于 40 摄氏度孵育 15 分钟。

在室温下，用一倍洗涤缓冲液将载玻片洗涤两次，每次两分钟。同前，最后一次洗涤后，向每张切片加入100至200微升封闭液（含3毫克/毫升BSA、100毫摩尔/升甘氨酸和0.25% Triton X-100的PBS溶液），用封片液覆盖每张载玻片，于室温孵育30分钟。孵育结束后，向载玻片加入100至200微升用封闭液稀释的一抗抗体。此处使用抗胆碱乙酰转移酶抗体，加样后用封片液覆盖，于4摄氏度孵育两天。

确保脑切片不会干燥，必要时在孵育24小时后重新加入抗CHATT抗体溶液。在1倍XPBS中将切片洗涤三次，每次五分钟。室温下，向切片加入100至200微升相应的Alexa荧光标记二抗。

用封片剂覆盖，室温避光孵育一小时。孵育结束后，将切片在1×PBS中洗涤三次，每次五分钟，方法同前，然后用蒸馏水洗涤一次。用含DPI的封片剂封片，随后在荧光显微镜下观察脑切片。

根据方案书面部分的说明，制备好甲醛固定石蜡包埋的人脑样本后，将切片浸入预热的预处理液二中，煮沸15分钟，进行热诱导抗原修复。用蒸馏水冲洗3至5次，再用新鲜的100%乙醇冲洗3至5次后，室温下干燥5分钟，以进行蛋白酶诱导抗原修复。在切片上滴加4滴预处理液三，覆盖封口膜，置于杂交炉中40摄氏度孵育30分钟。随后用蒸馏水冲洗3至5次。

与之前相同，在对照脑片上加入四滴DAP B探针组以评估背景染色，并在实验切片上加入四滴靶向探针组。将一对覆有薄膜的载玻片放入染色盒中，在杂交炉中于40摄氏度孵育两小时。按照书面实验方案中的步骤显色目标mRNA的DAB信号后，在明场显微镜下检查信号的存在情况。

在脑组织样本中确定参考区域，用于在整个复染过程中监测 puncta 的存在情况。进行复染时，首先将载玻片放入预热至 60 摄氏度的 Luxol 快蓝溶液中，在 60 摄氏度下孵育 30 分钟。

孵育结束后，用蒸馏水将载玻片冲洗数次，然后将载玻片浸入0.05%碳酸锂溶液中数次以开始分化。接着，将载玻片在新鲜的75%乙醇中浸入两次，并用蒸馏水冲洗。在明场显微镜下检查脑切片。

请注意，灰质和白质应开始可区分，RNA颗粒仍可见为深蓝黑色的点状结构。验证轴突开始呈现为浅蓝色纤维后，重复卢萨尔蓝染色步骤，以10至20分钟为间隔孵育卢萨尔蓝，仔细监测复染情况及RNA颗粒的存在，直至达到最佳染色效果。将冲洗后的切片放入结晶紫溶液中，孵育10分钟，孵育结束后进行后续操作。

用蒸馏水冲洗载玻片。将载玻片在70%乙醇中浸洗5至10次，然后在通风橱中用100%乙醇快速更换三次进行脱水。用二甲苯孵育两次以透明脑切片。

用替代透明剂分别处理两分钟和第三次处理五分钟。在室温下，将脑切片置于二甲苯基永久封片剂中封片，并在明场显微镜下进行分析。鱼类实验采用蛋白酶诱导抗原修复，随后通过抗体检测红色显示的胆碱乙酰转移酶。

当进行蛋白酶处理时，该抗体未能识别出chat。图中显示了使用相同显微镜设置和图像调整条件下，非靶标探针与靶向ATF四的探针所获得的结果示例。绿色的ATF四阳性颗粒显示出轴突定位不明确，以问号标示。

蓝色区域为使用热诱导抗原修复法进行染色后呈阳性的细胞核。免疫荧光染色再次显示为红色，表明染色成功。TF4 阳性颗粒定位于轴突，呈橙色，标记为“ok”。随后，轴突使用 Luxol 进行复染。

快速蓝和神经元SOTA用嵴紫亚优卢萨尔进行复染。如果温度降低，可能导致快速蓝染色。此处样品在40摄氏度下用卢萨尔快速蓝染色四小时。

TF 四阳性颗粒伴有不明确的意外定位，以问号标示。若在短暂孵育后未检查复染的强度，则可能出现次优染色，如此处所示。此处展示了与 ish 结合使用的最佳 LFB 染色示例，包括使用非靶向探针或 TF 四靶向探针的情况。

图像采集已自动调整至最佳信噪比。轴突定位的转录因子四个颗粒标记为正常。掌握后即可。

该技术可在染色后的一至三天内完成，具体时间取决于所选择的复染方法。该技术为神经科学家探索 mRNA 的翻译及其精确定位提供了途径。