在脑切片检测轴突本地化mRNAs的高空间分辨率原位杂交
2015年6月17日
RNA 原位杂交 （ISH） 能够使细胞和组织中的 RNA 可视化。在这里，我们展示了如何将 RNAscope ISH 与免疫组织化学或组织学染料相结合，成功地检测小鼠和人脑切片中定位于轴突的 mRNA。
以下实验的总体目标是检测成人大脑样本中意外定位的 mRNA。这是通过预处理实现的。通过煮沸和蛋白酶消化来揭示 mRNA 分子的样品，第二步进行杂交，然后进行扩增和检测步骤，从而能够可视化目标 mRNA。
接下来，用抗体或染料对轴突进行染色，以验证感兴趣的 mRNA 是否定位于轴突。结果显示，使用不同的揭露程序和计数器，基于显微镜分析的染色方法，大脑样本中存在 TF 4 mRNA。这种方法可以帮助回答神经科学中的问题，例如哪些 mRNA 在没有外显子的情况下定位和翻译。
虽然这种方法可以提供对 intracon 蛋白质合成的见解，但它也可以应用于其他系统，例如树突和非神经元细胞和发生 mRNA 定位的组织。固定脑切片后，根据书面方案中的说明，准备一个含有 60 毫升抗原修复溶液的 copin 罐，并将载玻片浸入溶液中。接下来，在一升烧杯中加入蒸馏水，然后将其放入微波炉中以缓冲热量。
执行揭蔽时，将包含载玻片和检索溶液的 coplan jar 放入微波炉中。将玻片以高功率煮沸 5 分钟。溶液停止沸腾后立即再次以高功率加热玻片再加热 5 分钟。
让载玻片在室温下冷却 冷却后，将载玻片浸入含有 PBS 的培养皿中清洗，然后再重复洗涤两次 洗涤后，将载玻片放在平坦的表面上，向两到三个脑切片中加入 2 至 3 滴或 100 微升 DAP B.Probe 作为对照。为了评估背景染色，向实验切片中加入两到三滴靶向探针为了检测感兴趣的 RNA，这里使用靶向小鼠 TF four RNA 残基 20 至 1381 的探针。使用镊子将参数放在载玻片上，以避免探针蒸发。
然后将载玻片放入杂交炉内的加湿载玻片盒中，并在 40 摄氏度下孵育 2 小时。孵育时间过后，在装有 1 x 洗涤缓冲液的培养皿中，在室温下洗涤玻片 2 分钟。接下来，向每个脑切片中加入 2 到 3 滴扩增试剂 1 液 1 液量。
然后盖上新鲜的封口膜，放入载玻片盒中，在 40 摄氏度下在杂交炉中孵育 15 分钟。像以前一样洗涤载玻片后，向每个脑切片中加入 2 到 3 滴扩增试剂 A MP 4 fl，并用 perfil 覆盖。将载玻片盒中的玻片在 40 摄氏度下在杂交炉中孵育 15 分钟。
在室温下用 1 x 洗涤缓冲液洗涤玻片两次，每次 2 分钟。与之前一样，最后一次洗涤后，用 100 至 200 微升封闭溶液覆盖每个切片，其中含有 3 毫克/毫升 BSA、100 毫摩尔甘氨酸和 0.25%Triton X 100 的 PBS 溶液，用封口覆盖每张载玻片，并在室温下孵育 30 分钟，孵育后，向载玻片中加入 100 至 200 微升用封闭溶液稀释的抗体。在用 perfil 覆盖载玻片后，在 4 摄氏度下孵育两天后，这里使用抗胆碱乙酰转移酶抗体。
确保脑切片不会变干，如果需要，请在孵育 24 小时后将抗 CHATT 抗体溶液重新涂抹在脑切片上。在一次 XPBS 中洗涤玻片 3 次，持续 5 分钟。在室温下，向玻片中加入 100 至 200 μL 适当的 Alexa 偶联二抗。
盖上 param 盖子，在室温下孵育 1 小时，一小时后避光孵育。像以前一样，在一个 XPBS 中洗涤玻片 3 次，每次 5 分钟，然后用蒸馏水洗涤一次。用含有 DPI 的封固剂封固载玻片，然后在荧光显微镜下观察脑切片。
在制备正式和固定的石蜡包埋的人脑样品后，根据方案书面部分的说明，通过将载玻片浸入热预处理两种溶液中并煮沸 15 分钟来进行热诱导抗原修复。在蒸馏水中洗涤 3 到 5 次，在新鲜的 100% 乙醇中洗涤 3 到 5 次后，让玻片在室温下干燥 5 分钟，以进行蛋白酶诱导的抗原修复。加入四滴预处理剂，三滴用 perfil 覆盖，并在 40 摄氏度的杂交炉中孵育 30 分钟，然后在蒸馏水中洗涤 3 到 5 次。
和以前一样，加入四滴 DAP B 探针组以控制脑切片以评估背景染色，并加入四滴靶向探针组到实验切片中。将一对覆盖薄膜的载玻片放入载玻片盒中，并在杂交炉中于 40 摄氏度孵育 2 小时。按照书面方案中的步骤为感兴趣的 mRNA 开发 DAB 信号后，在明场显微镜下检查信号是否存在。
定义脑样本中的参考区域，以在整个反染色程序中监测点的存在。对抗污渍。首先将玻片放入预热至 60 摄氏度的 luxal fast blue 中，并在 60 摄氏度下孵育 30 分钟。
孵育后，用蒸馏水冲洗载玻片数次，然后将载玻片浸入 0.05% 碳酸锂溶液中数次以开始分化。接下来，将载玻片浸入新鲜的 75% 乙醇中两次，然后用蒸馏水冲洗。在明场显微镜下检查脑切片。
请注意，灰质和白质应该开始可区分，并且 RNA 颗粒仍然可见为深蓝色黑色点。验证轴突是否开始显示为浅蓝色纤维，重复 luxal blue 染色程序，以 10 到 20 分钟的步骤与 luxal blue 孵育，并在达到最佳染色时仔细监测复染和 RNA 颗粒的存在。将冲洗玻片放入牙槽槽状紫溶液中，孵育后孵育 10 分钟。
用蒸馏水冲洗载玻片。将玻片浸入 70% 乙醇中 5 到 10 次，然后在通风橱中快速更换 3 次 100% 乙醇脱水。通过在二甲苯中孵育两次来清除脑切片。
替代清算代理 2 分钟，第三次 5 分钟。在室温下，将脑切片封片在二甲苯基永久封片剂中，并在明场显微镜下进行分析。使用蛋白酶诱导的揭开进行鱼类检测，然后对胆碱乙酰转移酶进行抗体检测，如红色所示。
进行蛋白酶处理时，抗体无法识别聊天。显示了使用非目标探针和 TF 四目标探针使用相同的显微镜设置和图像调整获得的结果示例。绿色 ATF 4 个轴突定位不明确的阳性颗粒用问号表示。
蓝色区域是使用热诱导抗原进行捕鱼时斑驳染色的细胞核。再次以红色显示的 unmasking chat immunofluorescent 染色成功。A TF 四个定位于轴突的阳性颗粒呈橙色，并在 ish 轴突用 luxal 复染后标记为正常。
固蓝和神经元 SOTA 用嵴紫色次优 luxal 复染。如果温度降低，可能会导致快速的蓝色染色。在这里，样品在 40 摄氏度下用豪华固蓝染色 4 小时。
A TF 4 个意外定位不明确的阳性颗粒用问号表示。如图所示，当在短孵育期后未检查复染剂的强度时，也会发生次优染色。此处显示了使用非靶探针或 TF 四个靶向探针的最佳 LFB 染色与 ish 相结合的示例。
图像采集会自动调整以获得最佳信噪比。轴突定位 a TF 四个颗粒标记为正常。一旦掌握。
该技术可以在一到三天内完成，具体取决于所选的复染方法 显影后.这项技术为神经科学家探索 mRNA 翻译和定位的细微差别铺平了道路。
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概述
本研究展示了RNA原位杂交（ISH）结合免疫组织化学技术来可视化小鼠和人脑组织轴突中的mRNA。该方法允许检测局部mRNA，提供了关于其在神经科学中的作用的见解。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 分子生物学
- 基因表达
背景
- RNA原位杂交（ISH）是一种用于在细胞内可视化RNA的技术。
- 理解mRNA定位对于研究大脑中的基因表达至关重要。
- 将ISH与免疫组织化学结合可增强检测能力。
- 这种方法可以揭示神经组织中mRNA的空间分布。
研究目的
- 检测大脑样本中定位于轴突的mRNA。
- 探索mRNA定位与神经元中的翻译之间的关系。
- 验证不同去屏蔽程序和染色方法的有效性。
使用的方法
- 涉及煮沸和蛋白酶消化的样本预处理。
- RNA探针与目标mRNA的杂交。
- 用于可视化的扩增和检测步骤。
- 用抗体或染料染色轴突以进行验证。
主要结果
- 成功可视化脑样本中的TF four mRNA。
- 展示不同去屏蔽程序产生一致的结果。
- 通过显微镜分析确认mRNA定位于轴突。
- 关于大脑中定位mRNA翻译的见解。
结论
- 结合ISH和免疫组织化学方法对研究mRNA定位有效。
- 这种方法可以帮助回答神经科学中的关键问题。
- 进一步研究可以扩大对神经组织中mRNA动力学的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding subcellular mRNA localization in axons provides mechanistic insights into neuronal function, supporting target validation in neurodegenerative disease models. This technique enables direct visualization of low-abundance transcripts in complex tissues, reducing reliance on artificial culture systems. It enhances predictive confidence in preclinical target de-risking by confirming spatial gene expression patterns relevant to axon pathfinding, repair, and neurodegeneration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by confirming axonal mRNA recruitment in vivo.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct visualization of target transcript localization.
- Predictive Value: Strengthens target confidence by linking mRNA localization to axonal function in mature brain tissue.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing mRNA-axon colocalization.
- Quantitative Output: Provides puncta-based readouts amenable to image analysis for screening applications.
- Platform Reuse: Compatible with multiple counterstains (immunohistochemistry, histological dyes) enabling adaptability across target classes.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to models of neurodegeneration where axonal mRNA localization and local translation are implicated.
- Translational Continuity: Bridges discovery findings to preclinical validation by verifying mRNA localization in human and mouse brain sections.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in target mechanism by confirming subcellular RNA distribution prior to functional studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation, particularly for neuroscience targets involving axonal biology.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by determining which mRNAs are localized to axons in intact tissue.
- Screening: Enables assay standardization through reproducible detection of RNA puncta in axonal compartments.
- Analytics: Generates spatial and quantitative mRNA readouts that help compare experimental conditions across brain regions.
- Translational Research: Connects in vitro findings to in vivo relevance by validating localization in mammalian brain sections.
- Enterprise Reuse: Represents a adaptable capability for multiple targets beyond Atf4, supporting broad neuroscience programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity around mRNA function.
- Operational Value: Delivers standardization and reproducibility through standardized unmasking, hybridization, and detection steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing direct evidence of target engagement in axons.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on confirmed subcellular mRNA localization.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA handling, immunohistochemistry, and fluorescence microscopy.
- Depends on access to RNAscope ISH reagents, hybridization ovens, and antigen retrieval systems.
- Necessitates standardization across teams for probe design, unmasking conditions, and counterstain optimization.
- Must account for tissue-specific variability in antigen retrieval efficiency between mouse and human samples.
- Limited by the need for optimized counterstaining to avoid obscuring RNA puncta signal.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:26
Heat-Induced Antigen/RNA Unmasking
2:21
Probe Hybridization
4:01
Immunofluorescence Staining
5:42
Diaminobenzidine (DAB)-based Chromogenic ISH Assay Followed by Luxol Fast Blue and Cresyl Violet Stain Using Heat-induced and Protease-induced RNA Unmasking
8:54
Results: Aft4 Localization to Cholinergic Axons in the Mouse Dentate Gyrus and Myelinated Axons in the Adult Hippocampal Formation
10:53
Conclusion
