Name: 在脑切片检测轴突本地化mRNAs的高空间分辨率原位杂交 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: 学习在脑切片中使用RNA原位杂交结合免疫组织化学检测轴突定位mRNA的高空间分辨率方法。该技术可在小鼠和人脑组织中可视化mRNA分布，为神经科学研究提供重要工具。

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本工作由阿尔茨海默病协会（Alzheimer’s Association，项目编号：NIRG-10-171721，授予 U.H.）、国家心理健康研究所（National Institute of Mental Health，项目编号：MH096702，授予 U.H.）、国家神经疾病与卒中研究所（National Institute of Neurological Disorders and Stroke，项目编号：NS081333，授予 C.M.T.）以及由美国国立衰老研究所资助的哥伦比亚大学阿尔茨海默病研究中心（项目编号：AG008702，授予 J.B. 和 Y.Y.J.）提供的初步研究资助共同支持，该研究中心同时也支持纽约脑库的运行。我们感谢Hengst实验室成员提出的评论与讨论。

所有动物实验程序均经哥伦比亚大学动物照护与使用委员会（IACUC）批准，并遵循实验室动物护理与使用的相关指南。注意：原位杂交（ISH）实验所用的全部缓冲液均应使用无RNase水或DEPC处理水配制。ISH完成后此建议并非严格必需，但仍建议缓冲液使用经高压灭菌的双蒸水配制，和/或通过过滤灭菌。
1. 检测 Atf4 使用荧光技术在成年小鼠大脑胆碱能轴突中定位的 mRNA 原位 荧光原位杂交（FISH）联合免疫组织化学
<ol>
	<li>用于多聚甲醛固定冷冻脑切片的样本制备
	<ol>
		<li>以下示例中，制备固定后的冷冻小鼠脑组织切片。
		<ol>
			<li>简而言之，通过腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg）麻醉处死9月龄小鼠，随后进行心脏灌注。-1 体重）和赛拉嗪（10 mg/kg）-1 体重）后，经心脏灌注4%多聚甲醛（PBS配制，pH 7.4）。</li>
			<li>取出脑组织，在4°C下用4%多聚甲醛后固定24小时 oC.</li>
			<li>固定后，用 PBS 洗涤样本三次，并在含 30% 蔗糖的 PBS（pH 7.4）中 4 °C 下 cryoprotect 24 小时 oC.</li>
			<li>将脑组织包埋于OCT冷冻包埋剂中，在冷冻切片机上以20 µm厚度连续切片，并贴附于经多聚赖氨酸处理的显微载玻片上。脑切片保存于-20℃ oC 保存至使用。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>从冰箱中取出经多聚甲醛固定的脑切片，在室温下晾干30分钟。</li>
		<li>用1×PBS洗涤三次。</li>
		<li>在通风橱中，于室温下用4%多聚甲醛重新固定脑切片20分钟。 
		&#8203;注意：警告：4%多聚甲醛具有毒性，必须根据安全规程进行操作和废弃处理。</li>
		<li>用1×PBS洗涤三次。</li>
		<li>脱水脑切片。
		<ol>
			<li>配制50%、75%和100%的乙醇溶液。</li>
			<li>将载玻片浸入50%乙醇中，室温下孵育5分钟。</li>
			<li>将载玻片浸入75%乙醇中，室温下孵育5分钟。</li>
			<li>将载玻片浸入100%乙醇中，室温下孵育5分钟。</li>
			<li>将载玻片浸入新鲜的100%乙醇中，室温孵育5分钟。注意： alternatively，载玻片可在-20℃的100%乙醇中保存oC 最多可保存1个月。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>FISH检测联合热诱导抗原/RNA去封闭免疫组织化学
	<ol>
		<li>开始前准备好所有所需材料：
		<ol>
			<li>将杂交炉加热至 40 oC，并将装有蒸馏水的托盘放入烘箱中，以创造一个加湿环境。</li>
			<li>取一个切片盒，在其中放入用蒸馏水浸湿的纸巾以润湿切片盒，然后将切片盒放入杂交炉中。</li>
			<li>从冰箱中取出探针（包括阴性探针和目标探针），在杂交炉中加热10分钟。将探针在室温下冷却。</li>
			<li>将荧光多重试剂盒中包含的扩增试剂 AMP 1-4 平衡至室温。</li>
			<li>配制抗原修复液：10 mM 柠檬酸钠（pH 6）、0.05% Tween 20。注意：该溶液可在室温下长期保存，并可用于后续染色实验。</li>
			<li>使用无RNase水或DEPC处理水将50倍浓缩液（荧光多重试剂盒中包含）稀释，配制1倍洗涤缓冲液。 
			注意：1×洗涤缓冲液可在室温下保存1个月，用于后续染色。50×洗涤缓冲液可能出现沉淀，若如此，将50×洗涤缓冲液在40℃加热 o10 分钟后制备 1x 溶液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>从100%乙醇中取出载玻片，在室温下晾干5分钟。</li>
		<li>准备一个含有50 ml抗原修复液的考兰罐，将切片浸入抗原修复液中，于微波炉内煮沸10分钟。 
		注意：也可将载玻片水平放置于含有100 ml洗脱液的直径为100 mm的圆形玻璃培养皿中。
		<ol>
			<li>将1升烧杯装满蒸馏水，放入微波炉中。 
			注意：在进行抗原修复时，水会起到缓冲热量的作用。</li>
			<li>将切片放入微波炉内的抗原修复液中，高火煮沸5分钟。样品停止沸腾后立即再次以高火加热5分钟。</li>
			<li>在室温下冷却载玻片。 
			注意：关键步骤：煮沸的持续时间和操作程序应根据微波炉的特性由使用者自行确定。煮沸启动越快，溶液蒸发的可能性越高。在此情况下，建议将样品分多次进行煮沸，每次时间较短，累计完成10分钟的总抗原修复时间。相反，若在中等或低功率下加热，可一次性加热10分钟完成抗原修复。然而，若样品未持续煮沸累计约10分钟，则可能导致待检测的目标RNA和蛋白质未能充分暴露。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用1×PBS洗涤载玻片三次。</li>
		<li>加入2-3滴（约100 μl）的 dapB 探针设定为用于评估背景染色的脑切片。注意： dapB 探针组靶向细菌基因，不应识别任何哺乳动物RNA。</li>
		<li>向用于检测目标 RNA 的脑切片中加入 2 - 3 滴靶向探针组。注意：探针组靶向小鼠（Mus musculus）mRNA 第 20 - 1,381 位核苷酸区域 Atf4 本示例中使用 mRNA。</li>
		<li>用封口膜覆盖玻片以防止探针蒸发，将玻片放入杂交炉内的湿盒中，在40℃下孵育 o2 小时，C 
		&#8203;注意：可选：可使用靶向小鼠的探针组对额外的脑切片进行杂交 Polr2A 并用作阳性对照。</li>
		<li>室温下用1×洗涤缓冲液洗涤载玻片两次，每次2分钟。</li>
		<li>向每张脑切片加入 2 - 3 滴扩增试剂 AMP 1-FL，用封口膜覆盖载玻片，放入载玻片盒中，在 40 ℃ 下孵育 o在杂交炉中于 C 下孵育 30 分钟。</li>
		<li>用1×洗涤缓冲液在室温下洗涤载玻片，每次2分钟，共洗涤两次。</li>
		<li>向每张脑切片加入 2 - 3 滴扩增试剂 AMP 2-FL，用封口膜覆盖载玻片，放入载玻片盒中，在 40 ℃ 下孵育 o在杂交炉中于 C 下孵育 15 分钟。</li>
		<li>用1×洗涤缓冲液在室温下洗涤载玻片，每次2分钟，共洗涤两次。</li>
		<li>向每张脑切片加入 2 - 3 滴扩增试剂 AMP 3-FL，用封口膜覆盖载玻片，放入载玻片盒中，在 40 ℃ 下孵育 o在杂交炉中于 C 下孵育 30 分钟。</li>
		<li>用1×洗涤缓冲液在室温下洗涤载玻片，每次2分钟，共洗涤两次。</li>
		<li>向每张脑切片加入 2 - 3 滴扩增试剂 AMP 4-FL，用 Parafilm 封片，放入载玻片盒中，在 40 ℃ 下孵育 o在杂交炉中于 C 下孵育 15 分钟。</li>
		<li>用1×洗涤缓冲液在室温下洗涤载玻片2次，每次2分钟，再用1×PBS洗涤2次。</li>
		<li>加入100–200 μl（或足以完全覆盖切片的体积）封闭液，封闭液组成为含3 mg/ml BSA、100 mM甘氨酸和0.25% Triton X-100的PBS（pH 7.4），用封口膜覆盖载玻片，室温孵育30分钟。</li>
		<li>加入100–200 μl用封闭液按1:100稀释的抗ChAT抗体至载玻片上，用Parafilm封片，于4 °C孵育2天 oC. 确保脑切片不干燥。若需要，可在孵育24小时后重新加入抗ChAT抗体溶液至脑切片。</li>
		<li>将载玻片在1×PBS中于室温下清洗3次，每次5分钟。</li>
		<li>加入100 - 200 μl相应的Alexa荧光标记二抗（例如，针对此特定示例使用 Alexa-594 标记的驴抗山羊二抗）滴加到载玻片上，用封口膜覆盖，室温孵育 1 小时。</li>
		<li>将载玻片在1×PBS中于室温下洗涤3次，每次5分钟。</li>
		<li>用蒸馏水将载玻片清洗一次。</li>
		<li>使用含 DAPI 的封片剂封片。</li>
		<li>在荧光显微镜下观察脑切片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 检测 Atf4 使用显色法在人脑样本轴突中定位的 mRNA 原位 原位杂交（CISH）后接Luxol快蓝与焦油紫复染
<ol>
	<li>福尔马林固定石蜡包埋人脑样本的制备
	<ol>
		<li>将切片置于干燥烘箱中，60 oC 烘烤 1 小时。</li>
		<li>在通风橱中对脑切片进行脱蜡。 
		&#160;注意：警告：试剂具有毒性，必须按照适当的安全规范进行操作和废弃处理
		<ol>
			<li>将载玻片浸入二甲苯替代透明剂中，每次 10 分钟，重复两次。</li>
			<li>将载玻片浸入 100% 乙醇中，每次 1 分钟，重复两次。</li>
			<li>室温下空气干燥 5 分钟。注意：也可选择在室温下过夜干燥，但必须在 24 小时内使用。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基于二氨基联苯胺（DAB）的显色原位杂交（ISH）检测，随后进行快绿（luxol fast blue）和焦油紫（cresyl violet）染色，采用热诱导和蛋白酶诱导的 RNA 去遮蔽方法
	<ol>
		<li>开始前准备所需材料：
		<ol>
			<li>将杂交炉预热至 40 oC，并放置一个盛有蒸馏水的托盘以形成湿润环境。</li>
			<li>取一个载玻片盒，在其中放入用蒸馏水浸湿的纸巾以保持湿度，然后将载玻片盒放入杂交炉中。</li>
			<li>通过将 10x 储存液（包含在 CISH 试剂盒中）用无 RNase 水或 DEPC 处理水稀释，配制 1x 预处理液 2。若在加热板上进行预处理，需将 100 ml 预处理液加入直径为 100 mm 的玻璃培养皿中，以增加培养皿与加热板之间的接触面积（若使用微波炉处理，则可按 1.2.3 所述使用 Coplin 染色缸代替）。&#160;将溶液加热至 100 oC，并在样本浸入前保持沸腾不超过 30 分钟。</li>
			<li>将阴性探针和阳性探针在 40 oC 下加热 10 分钟，随后在室温下冷却。</li>
			<li>将扩增试剂 AMP 1–6（包含在 CISH 试剂盒中）平衡至室温。</li>
			<li>通过将 50x 储存液（包含在 CISH 试剂盒中）用蒸馏水稀释，配制 1x 洗涤缓冲液。注意：1x 洗涤缓冲液可在室温下保存 1 个月，并可用于后续染色。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>向每张脑切片加入约 4 滴（约 120 μl）预处理液 1，用封口膜覆盖后在室温下孵育 10 分钟。</li>
		<li>用新鲜蒸馏水洗涤 3 至 5 次。</li>
		<li>进行热诱导去遮蔽：
		<ol>
			<li>将载玻片转移至预热的预处理液 2（包含在 CISH 试剂盒中）中，煮沸 15 分钟。注意：煮沸可在加热板上进行，需确保持续沸腾；也可在微波炉中进行，具体操作步骤见&#160;1.2.3 所述。&#160;</li>
		</ol>
		</li>
		<li>立即将载玻片转移至蒸馏水中，并洗涤 3 至 5 次。</li>
		<li>用新鲜 100% 乙醇洗涤载玻片 3 至 5 次。</li>
		<li>室温下空气干燥 5 分钟。注意：也可选择过夜干燥。</li>
		<li>进行蛋白酶诱导去遮蔽：
		<ol>
			<li>向每张脑切片加入 4 滴预处理液 3（包含在 CISH 试剂盒中），用封口膜覆盖后，在杂交炉中 40 oC 孵育 30 分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用新鲜蒸馏水洗涤载玻片 3 至 5 次。</li>
		<li>向用于评估背景染色的脑切片加入 4 滴 dapB 探针组。</li>
		<li>向用于检测目标 RNA 的脑切片加入 4 滴目标探针组。 
		注意：本示例中使用针对人 ATF4 mRNA 第 15–1,256 位核苷酸的探针组。可选：可额外使用针对人 PPIB 的探针组对其他脑切片进行杂交，作为阳性对照。</li>
		<li>将载玻片放入载玻片盒中，在杂交炉中 40 oC 孵育 2 小时。</li>
		<li>在室温下用 1x 洗涤缓冲液洗涤载玻片两次，每次 2 分钟。</li>
		<li>向每张脑切片加入 4 滴 AMP 1 试剂，用封口膜覆盖载玻片，放入载玻片盒中，在杂交炉中 40 oC 孵育 30 分钟。</li>
		<li>在室温下用 1x 洗涤缓冲液洗涤载玻片两次，每次 2 分钟。</li>
		<li>向每张脑切片加入 4 滴 AMP 2 试剂，用封口膜覆盖载玻片，放入载玻片盒中，在杂交炉中 40 oC 孵育 15 分钟。</li>
		<li>在室温下用 1x 洗涤缓冲液洗涤载玻片两次，每次 2 分钟。</li>
		<li>向每张脑切片加入 4 滴 AMP 3 试剂，用封口膜覆盖载玻片，放入载玻片盒中，在杂交炉中 40 oC 孵育 30 分钟。</li>
		<li>在室温下用 1x 洗涤缓冲液洗涤载玻片两次，每次 2 分钟。</li>
		<li>向每张脑切片加入 4 滴 AMP 4 试剂，用封口膜覆盖载玻片，放入载玻片盒中，在杂交炉中 40 oC 孵育 15 分钟。</li>
		<li>在室温下用 1x 洗涤缓冲液洗涤载玻片两次，每次 2 分钟。</li>
		<li>向每张脑切片加入 4 滴 AMP 5 试剂，用封口膜覆盖载玻片，在室温下孵育 30 分钟。</li>
		<li>在室温下用 1x 洗涤缓冲液洗涤载玻片两次，每次 2 分钟。</li>
		<li>向每张脑切片加入 4 滴 AMP 6 试剂，用封口膜覆盖载玻片，在室温下孵育 15 分钟。</li>
		<li>在室温下用 1x 洗涤缓冲液洗涤载玻片两次，每次 2 分钟。</li>
		<li>将 BROWN-1 和 BROWN-2 试剂（包含在 CISH 试剂盒中）等体积混合，向每张脑切片加入约 120 μl 混合液，用封口膜覆盖后在室温下孵育 10 分钟。</li>
		<li>在室温下用 1x 洗涤缓冲液洗涤载玻片两次，每次 2 分钟，随后用蒸馏水冲洗一次。 
		注意：关键步骤：以下步骤至关重要，以获得最佳的轴突复染效果，同时避免遮蔽 RNA 颗粒的存在。</li>
		<li>在进行复染前，先在明场显微镜下检查目标 mRNA 的存在情况。在脑样本中确定参考区域，用于在整个复染过程中监测点状信号的存在。</li>
		<li>将快绿溶液预热至 60 oC。</li>
		<li>将载玻片放入快绿溶液中，在 60 oC 下孵育 30 分钟。</li>
		<li>用蒸馏水多次冲洗。</li>
		<li>将载玻片在 0.05% 碳酸锂溶液中浸洗数次，以开始分化。</li>
		<li>将载玻片在新鲜 75% 乙醇中浸洗两次。</li>
		<li>用蒸馏水冲洗。</li>
		<li>在明场显微镜下检查脑切片。注意，灰质和白质应开始可区分，RNA 颗粒仍可见为深蓝/黑色点状结构。确认轴突开始呈现为浅蓝色纤维。</li>
		<li>重复步骤 2.2.28 至 2.2.32。每次使用快绿溶液孵育 10–20 分钟，仔细监测复染效果及 RNA 颗粒的可见性。注意：通常总孵育时间 60–90 分钟可获得最佳复染效果，但如果怀疑 RNA 颗粒可能被快绿染色遮蔽，则可缩短时间（参见 图 2 示例）。</li>
		<li>在室温下将载玻片在焦油紫溶液中孵育 10 分钟。</li>
		<li>用蒸馏水冲洗载玻片。</li>
		<li>将载玻片在 70% 乙醇中浸洗 5 至 10 次。</li>
		<li>通过三次快速更换 100% 乙醇对脑切片进行脱水。</li>
		<li>在通风橱中，将脑切片在二甲苯替代透明剂中浸洗两次，每次 2 分钟，第三次 5 分钟，室温下进行。</li>
		<li>使用基于二甲苯的永久封片剂封片。</li>
		<li>在明场显微镜下分析样本。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突披露。

在本报告中，我们描述了一种高分辨率原位杂交（ISH）技术在检测轴突局部定位的 Atf4 mRNA 中的应用。这些研究以及先前已发表的研究表明，该技术可与基于抗体的蛋白质检测方法兼容，适用于组织甚至整个胚胎33。重要的是，该技术最近已被用于检测海马神经元树突内的 Arc mRNA34。此外，它还可与组织学染料联合用于组织染色。最后，该技术适用于多种靶RNA的同步检测28,30,33。这些结果充分体现了高分辨率RNA原位杂交技术的多功能性，且对原始实验方案进行的微小修改并不会降低该方法的灵敏度。
最初描述使用Z-结构探针在组织中以单分子分辨率检测目的mRNA的实验方案建议通过蛋白酶消化和样本煮沸两个步骤进行mRNA去遮蔽30,35。本文表明，蛋白酶诱导的去遮蔽会负面影响基于抗体的ChAT检测，特别是在来自隔-海马通路的胆碱能轴突中（图2A和B）。因此，我们决定在轴突共染涉及抗体使用时省略该步骤，仅...

轴突内 mRNA 的招募和局部翻译使轴突能够以时空特异性的方式快速响应胞外刺激1。目前对轴突内蛋白质合成的理解主要集中在神经发育过程中，其在生长锥行为2-8、轴突导向9-11以及逆行信号传导12,13中发挥关键作用。然而，关于在发育完成后神经元中轴突蛋白质合成的功能意义，目前所知甚少，因为在这些成熟神经元中，轴突内的 mRNA 和核糖体水平已显著降低14,15。长期以来，人们认为成熟的脊椎动物轴突不具备翻译活性16。然而，最近的研究表明，在病理条件下，成熟轴突中的局部翻译会被重新激活。例如，在神经损伤后，一部分 mRNA 会被招募至再生中的轴突，且轴突内的蛋白质合成对于这些轴突的正确再生至关重要17。此外，我们课题组已证明，在局部暴露于阿尔茨海默病相关肽 Aβ1-42 后，特定的 mRNA 会被招募至轴突，且转录因子 ATF4 的局部翻译对于将 Aβ1-42 的神经退行性效应从轴突传递至神经元胞体是必需的18。最后，高通量分析揭示，成熟轴突的转录组比预期更为复杂且具有动态变化特征18-21，尤其是在病理条件下。鉴于这些研究进展，迫切需要一种高灵敏度和高特异性的方法，用于检测成年神经系统中定位于轴突的 mRNA。
成熟轴突中 mRNA 招募与局部翻译的大部分研究工作均在培养的神经元上进行。对于转录组分析而言尤其如此，因为已有专门的培养方法可实现轴突与胞体-树突区室的有效分离。18-20尽管此类研究为局部翻译在成熟轴突中的作用提供了宝贵的见解，但培养的神经元是否能真实反映体内情况仍有待探讨 体内 或者mRNA的募集是否是轴突对培养条件的一种适应性反应，目前仍不明确。少数研究提供了mRNA被募集到成熟轴突中的证据 体内例如，已在成年感觉神经元的轴突中检测到编码嗅觉标记蛋白的转录本22含有β-actin mRNA 3’非翻译区的转基因在小鼠外周和中枢神经系统神经元的轴突中被转运，并在发育阶段后进行局部翻译23Lamin b2 mRNA 定位于非洲爪蟾蝌蚪视网膜轴突中，其耗竭会影响轴突发育后的轴突维持21干扰细胞色素C氧化酶IV编码mRNA的轴突运输会改变小鼠行为24最后， Atf4 mRNA存在于小鼠和人类大脑成年轴突中，且与Aβ相关1-42诱导的神经退行性变18.
高通量转录组分析已被证明可用于鉴定分离轴突中的mRNA表达谱 体外 但对……存在局限性 体内 由于在完整组织中轴突从不孤立存在，而是与神经元胞体、胶质细胞及其他细胞类型相互混杂，因此需要结合成像技术以确认mRNA的亚细胞定位。RNA 原位 杂交（RNA原位杂交，RNA ISH）可实现细胞和组织中特定RNA序列的检测与可视化。然而，早期的RNA ISH检测方法仅适用于丰度较高的RNA的鉴定25，而轴突定位的mRNA很少出现这种情况。近几十年来，人们 increasingly efforts have been put into developing novel technologies that allow the detection of mRNAs at the single-molecule level25,26例如，Singer 及其同事开发了用于在单细胞中检测 mRNA 的原位杂交探针，该探针由5段不重叠的、带荧光标记的50-mer组成（详见 27）。上述技术与本文所述技术的主要区别在于，后者使用20个双Z结构（非线性）探针，通常靶向目标RNA约1 kb的区域，从而确保高特异性和低背景信号。随后，探针与预扩增序列和扩增序列杂交，最终被荧光标记或与可催化显色反应的酶偶联。这些扩增步骤相较于其他原位杂交（ISH）技术，显著提高了信噪比。28在此，我们描述两种使用RNAscope的方法，分别结合荧光免疫细胞化学或组织学染料进行轴突复染。这两种方案均适用于可视化轴突中RNA的定位。 Atf4 成年小鼠和人类大脑中的mRNA。

<table><tbody><tr><td>定制探针，靶向小鼠 &lt;i&gt;Atf4&lt;/i&gt; mRNA 第20-1,381位残基（NM_009716）</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>-</td><td>探针</td></tr><tr><td>定制探针，靶向人 &lt;i&gt;ATF4&lt;/i&gt; mRNA 第15-1,256位残基（NM_001675.2）</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>-</td><td>探针</td></tr><tr><td>阴性对照探针-DapB</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310043</td><td>探针</td></tr><tr><td>阳性对照探针-小鼠 Polr2A（可选）</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>312471</td><td>探针</td></tr><tr><td>阳性对照探针-人 PPIB（可选）</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>313901</td><td>探针</td></tr><tr><td>RNAscope 荧光多重试剂盒（用于荧光检测）</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>320850</td><td>&lt;i&gt;in situ&lt;/i&gt; 杂交试剂盒</td></tr><tr><td>RNAscope 2.0 HD 试剂盒 - 棕色（用于显色检测）</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310035</td><td>&lt;i&gt;in situ&lt;/i&gt; 杂交试剂盒</td></tr><tr><td>山羊多克隆抗-ChAT 抗体</td><td>Millipore</td><td>AB144P</td><td></td></tr><tr><td>Luxol 快速蓝-藏红快紫染色试剂盒</td><td>American MasterTech</td><td>KTLFB</td><td></td></tr><tr><td>Clearify 透明剂（二甲苯替代品）</td><td>American MasterTech</td><td>CACLEGAL</td><td></td></tr><tr><td>含 DAPI 的 ProLong Gold 封片介质&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>DPX 封片介质</td><td>Sigma</td><td>6522</td><td></td></tr></tbody></table>

使用高分辨率技术检测脑切片中轴突定位的mrna 原位 杂交

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNA 常定位于脊椎动物的轴突中，其局部翻译在发育过程中对轴突导向或分支至关重要，并在发育后期对轴突的维持、修复或神经退行性变具有重要作用。近期的高通量分析显示，轴突的转录组比先前预期的更为动态且复杂。然而，这些分析主要是在培养的神经元中进行的，在此类模型中轴突可与胞体-树突区室实现分离。而在完整组织中，几乎无法实现此类分离。 体内因此，为了验证mRNAs的招募及其在完整动物体内的功能相关性，理想情况下应将转录组分析与能够实现mRNAs可视化的技术相结合 原位近年来，已开发出可在单分子水平上检测RNA的新型原位杂交（ISH）技术。该技术在分析mRNA的亚细胞定位时尤为重要，因为定位于特定区域的RNA通常表达水平较低。本文中，我们描述了两种利用新型超敏RNA原位杂交技术检测轴突定位mRNA的实验方案。我们结合了RNAscope原位杂交技术与荧光免疫组织化学或组织学染料对轴突进行复染，以验证mRNA在轴突中的招募情况 Atf4 mRNA 向轴突的运输 体内 在成年小鼠和人类大脑中。

上述步骤的简要总结见图1。
利用热诱导去封闭法在胆碱能轴突中对Atf4 mRNA 颗粒进行最佳检测
在评估mRNA的轴突定位时，关键是要能够识别轴突，并能够可视化丰度较低的RNA。本文所述的RNA原位杂交（ISH）技术可实现单分子分辨率的RNA检测。使用该技术的标准方案建议结合两种去封闭方法以有效检测目标RNA：蛋白酶诱导去封闭和热诱导去封闭28。然而，当将原位杂交与免疫组织化学联合用于识别轴突时，蛋白酶诱导去封闭可能无法实现最佳的抗原检测效果29。
在本文描述的第一个实验方案中，避免了蛋白酶消化步骤，因为所使用的抗体无法识别通常存在于由隔-海马通路发出的齿状回轴突中的胆碱乙酰转移酶（ChAT）。图 2A 和 B)，尽管可检测到阳性mRNA颗粒。另一方面，使用10 mM柠檬酸缓冲液（pH 6）进行热诱导抗原修复...

RNA 原位 杂交（ISH）能够实现对细胞和组织中RNA的可视化。本文展示了如何将RNAscope ISH与免疫组织化学或组织学染色相结合，成功检测小鼠和人脑切片中定位于轴突的mRNA。

使用高分辨率技术检测脑切片中轴突定位的mRNA 原位 杂交

mRNAs 常定位于脊椎动物的轴突中，其局部翻译在发育过程中对轴突导向或分支是必需的，并且对……

以下实验的总体目标是检测成年脑组织样本中意外定位的 mRNA。该目标通过预处理实现：首先将样本煮沸并进行蛋白酶消化，以暴露 mRNA 分子；第二步进行杂交，随后进行扩增和检测，从而实现目标 mRNA 的可视化。接下来，使用抗体或染料对轴突进行染色，以验证目的 mRNA 是否定位于轴突中。结果显示，通过不同的抗原修复方法和计数器，结合基于显微镜分析的染色方法，在脑组织样本中检测到 TF four mRNA 的存在。该方法有助于回答神经科学领域的一些问题，例如哪些 mRNA 在无外显子的情况下仍可定位于轴突并进行翻译。尽管该方法可为细胞内蛋白质合成提供研究线索，但也可应用于其他存在 mRNA 定位的系统，例如树突以及非神经元细胞和组织。根据书面实验方案中的说明固定脑切片后，准备一个含有 60 毫升抗原修复液的 Copin 瓶，并将载玻片浸入该溶液中。接下来，用一个一升的烧杯装入蒸馏水并放入微波炉中，以缓冲热量。进行抗原修复时，将装有切片和修复液的共平面染色缸放入微波炉中。用高火煮沸切片5分钟。在溶液停止沸腾后立即再次用高火加热切片额外5分钟。将载玻片在室温下冷却。冷却后，将载玻片浸入盛有 PBS 的培养皿中进行洗涤，随后再重复洗涤两次。洗涤完成后，将载玻片置于平坦表面上，并在两到三个脑切片上作为对照加入两到三滴或 100 µL DAP B.探针。为评估背景染色，在实验组切片上加入两到三滴靶向探针。为检测目标 RNA，此处使用靶向小鼠 a TF four RNA 第 20 至 1381 位核苷酸的探针。使用镊子将封片膜覆盖在载玻片上，以防止探针蒸发。然后将载玻片放入杂交炉内的湿盒中，在40摄氏度下孵育两小时。孵育结束后，在室温下用一倍洗涤缓冲液将载玻片在培养皿中洗涤两分钟。接着，向每张脑切片加入两到三滴扩增试剂a MP one fl。然后用新鲜的封口膜覆盖，放入载片盒中，在杂交炉中于 40 摄氏度孵育 15 分钟。按照之前的方法洗涤载片后，向每张脑切片加入两到三滴扩增试剂 A MP four fl，并用 perfil 覆盖。将载片放入载片盒中，在杂交炉中于 40 摄氏度孵育 15 分钟。在室温下，用一倍洗涤缓冲液将载玻片洗涤两次，每次两分钟。同前，最后一次洗涤后，向每张切片加入100至200微升封闭液（含3毫克/毫升BSA、100毫摩尔/升甘氨酸和0.25% Triton X-100的PBS溶液），用封片液覆盖每张载玻片，于室温孵育30分钟。孵育结束后，向载玻片加入100至200微升用封闭液稀释的一抗抗体。此处使用抗胆碱乙酰转移酶抗体，加样后用封片液覆盖，于4摄氏度孵育两天。确保脑切片不会干燥，必要时在孵育24小时后重新加入抗CHATT抗体溶液。在1倍XPBS中将切片洗涤三次，每次五分钟。室温下，向切片加入100至200微升相应的Alexa荧光标记二抗。用封片剂覆盖，室温避光孵育一小时。孵育结束后，将切片在1×PBS中洗涤三次，每次五分钟，方法同前，然后用蒸馏水洗涤一次。用含DPI的封片剂封片，随后在荧光显微镜下观察脑切片。根据方案书面部分的说明，制备好甲醛固定石蜡包埋的人脑样本后，将切片浸入预热的预处理液二中，煮沸15分钟，进行热诱导抗原修复。用蒸馏水冲洗3至5次，再用新鲜的100%乙醇冲洗3至5次后，室温下干燥5分钟，以进行蛋白酶诱导抗原修复。在切片上滴加4滴预处理液三，覆盖封口膜，置于杂交炉中40摄氏度孵育30分钟。随后用蒸馏水冲洗3至5次。与之前相同，在对照脑片上加入四滴DAP B探针组以评估背景染色，并在实验切片上加入四滴靶向探针组。将一对覆有薄膜的载玻片放入染色盒中，在杂交炉中于40摄氏度孵育两小时。按照书面实验方案中的步骤显色目标mRNA的DAB信号后，在明场显微镜下检查信号的存在情况。在脑组织样本中确定参考区域，用于在整个复染过程中监测 puncta 的存在情况。进行复染时，首先将载玻片放入预热至 60 摄氏度的 Luxol 快蓝溶液中，在 60 摄氏度下孵育 30 分钟。孵育结束后，用蒸馏水将载玻片冲洗数次，然后将载玻片浸入0.05%碳酸锂溶液中数次以开始分化。接着，将载玻片在新鲜的75%乙醇中浸入两次，并用蒸馏水冲洗。在明场显微镜下检查脑切片。请注意，灰质和白质应开始可区分，RNA颗粒仍可见为深蓝黑色的点状结构。验证轴突开始呈现为浅蓝色纤维后，重复卢萨尔蓝染色步骤，以10至20分钟为间隔孵育卢萨尔蓝，仔细监测复染情况及RNA颗粒的存在，直至达到最佳染色效果。将冲洗后的切片放入结晶紫溶液中，孵育10分钟，孵育结束后进行后续操作。用蒸馏水冲洗载玻片。将载玻片在70%乙醇中浸洗5至10次，然后在通风橱中用100%乙醇快速更换三次进行脱水。用二甲苯孵育两次以透明脑切片。用替代透明剂分别处理两分钟和第三次处理五分钟。在室温下，将脑切片置于二甲苯基永久封片剂中封片，并在明场显微镜下进行分析。鱼类实验采用蛋白酶诱导抗原修复，随后通过抗体检测红色显示的胆碱乙酰转移酶。当进行蛋白酶处理时，该抗体未能识别出chat。图中显示了使用相同显微镜设置和图像调整条件下，非靶标探针与靶向ATF四的探针所获得的结果示例。绿色的ATF四阳性颗粒显示出轴突定位不明确，以问号标示。蓝色区域为使用热诱导抗原修复法进行染色后呈阳性的细胞核。免疫荧光染色再次显示为红色，表明染色成功。TF4 阳性颗粒定位于轴突，呈橙色，标记为“ok”。随后，轴突使用 Luxol 进行复染。快速蓝和神经元SOTA用嵴紫亚优卢萨尔进行复染。如果温度降低，可能导致快速蓝染色。此处样品在40摄氏度下用卢萨尔快速蓝染色四小时。TF 四阳性颗粒伴有不明确的意外定位，以问号标示。若在短暂孵育后未检查复染的强度，则可能出现次优染色，如此处所示。此处展示了与 ish 结合使用的最佳 LFB 染色示例，包括使用非靶向探针或 TF 四靶向探针的情况。图像采集已自动调整至最佳信噪比。轴突定位的转录因子四个颗粒标记为正常。掌握后即可。该技术可在染色后的一至三天内完成，具体时间取决于所选择的复染方法。该技术为神经科学家探索 mRNA 的翻译及其精确定位提供了途径。

detection-axonally-localized-mrnas-brain-sections-using-high

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

在脑切片检测轴突本地化mRNAs的高空间分辨率<em&gt;原位</em&gt;杂交

本方案涉及一种非放射性方法 原位...

双荧光 原位 新鲜脑切片中的杂交反应

本视频介绍了一种顺序杂交策略，该策略通过将mRNA探针与特定靶标mRNA进行杂交来实现检测。在探针杂交完成后，进行信号放大，以降低组织学样本RNA-CISH过程中的信噪比，从而提高分辨率。...

RNA原位杂交中的探针杂交与信号放大：组织切片中特异性RNA序列检测技术

来源：Jolly, S.，等．在小鼠脑切片中联合使用双重荧光原位杂交与免疫标记检测三个基因的表达．J. Vis. Exp.

在小鼠脑切片中进行双重荧光原位杂交以检测基因表达

来源：Baleriola, J., 等.，使用高分辨率原位杂交法检测脑切片中轴突定位的 mRNA。 J. Vis. Exp. (2015)本视频展示了利用荧光原位杂交和抗体染色技术，在固定的小鼠海马脑片中检测胆碱能轴突内 mRNA 的方法。荧光显微镜可揭示探针标记的 mRNA...

小鼠脑切片荧光原位杂交后神经元的免疫染色

本方案描述了一种快速且简化的 原位 杂交方法适用于多聚甲醛固定的脑组织，从而减少了使用新鲜冷冻组织时所需的复杂且耗时的步骤。该方法通过鉴定5-羟色胺5-HT受体验证其有效性。2A 受体基因 htr2a...

快速 原位 使用寡核苷酸探针在甲醛固定的大鼠脑组织上进行杂交以检测5-羟色胺综合征

由于缺乏特异性抗体，将基因表达定位到特定细胞类型可能具有挑战性。本文中，我们描述了一种通过结合双重荧光RNA原位杂交与免疫染色技术，实现基因表达同时三重检测的实验方案。...

双荧光联合检测 原位 小鼠脑切片中三种基因表达检测的杂交与免疫标记联合方法

本方案描述了一种结合荧光的方法 原位...

多重荧光联合检测 原位 新鲜或固定小鼠脑切片上的荧光免疫组织化学杂交

扩增辅助迭代荧光原位杂交（EASI-FISH）是一种强大的技术，结合了扩增显微镜与荧光原位杂交（FISH），用于在厚组织中检测多个基因的表达。本方案概述了该方法的最新进展及其在完整Drosophila中枢神经系统标记中的应用。...

完整组织中基因表达的多重检测 果蝇 利用扩增辅助迭代荧光技术研究大脑 原位 杂交

我们建立了一种双联检测方法 原位...

小鼠脑内胰岛素受体A和B的RNA精确可视化 原位 杂交实验

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使用多孔膜插入物和RTddPCR分离与定量轴突mRNA

学习在脑切片中使用RNA原位杂交结合免疫组织化学检测轴突定位mRNA的高空间分辨率方法。该技术可在小鼠和人脑组织中可视化mRNA分布，为神经科学研究提供重要工具。

使用高分辨率技术检测脑切片中轴突定位的mRNA 原位杂交

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