施加诱导表达系统研究与细胞内信号细菌毒力因子的干扰
2015年6月25日
此处描述的方法用于在确定的步骤诱导凋亡信号级联反应，以解剖抗凋亡细菌效应蛋白的活性。该方法还可用于促凋亡或毒性蛋白的诱导表达，或用于剖析对其他信号通路的干扰。
以下实验的总体目标是研究细菌毒力因子对细胞内信号传导的干扰。这是通过建立稳定的细胞系来实现的，表达目标蛋白质 为了作为第二步在大量细胞水平上研究其活性，创建了一个诱导型表达载体系统，该系统允许在定义的步骤激活宿主细胞信号级联反应。接下来，将分析感兴趣的蛋白质是否可以干扰宿主细胞信号级联反应的激活，以缩小目标蛋白质的活性点，结果表明，舒适的黄色 Burnett 毒力因子 KA B 干扰了基于蛋白质印迹分析的背部下游和级联 3 激活上游的凋亡级联反应。
这种方法可以帮助回答传染病生物学领域的关键问题，例如确定给定细菌效应蛋白干扰的信号转导级联反应中的关键步骤。这不仅有助于我们更好地了解病原微生物如何纵宿主，还有助于我们更好地了解这些基本的细胞过程是如何运作的。虽然这种方法可以深入了解细菌策略以防止凋亡细胞死亡的发生，但它也可以应用于细胞死亡场中的其他信号转导系统，例如 ons 或 pyro ptosis，或者也适用于参与细胞增殖、基因调控或免疫系统反应的信号网络。
演示此程序的是 Mann 实验室的研究生 Stephanie Besler。通过接种稳定表达 GFP 或 GFP 的 HEK 2 93 细胞开始此过程，例如 B 在 12 中。孔板密度为 100， 000 个细胞/孔。
接下来，在 75 μL opt 培养基中分别制备 DNA 和聚乙烯平均转染试剂，并在室温下孵育 5 分钟以形成复合物。在室温下将两种混合物一起孵育 15 分钟。之后，将聚乙烯 DNA 溶液滴加到细胞中，并在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳中孵育。
转染后 5 小时，向培养基中加入每毫升 1 μg 多西环素，诱导促凋亡蛋白的表达。然后在光学显微镜下将细胞在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳中孵育 18 小时。收获前检查细胞是否诱导细胞死亡。
检查诱导的凋亡细胞，这些细胞可通过凋亡小体的存在来检测。接下来，去除上清液并洗涤粘附的细胞。用温 PBS 后，将细胞重悬于 100 微升 2 x lamby 样品缓冲液中。
然后在 95 摄氏度下加热 5 分钟，之后存放在零下 20 摄氏度下以备后用。之后，加载 6 μL 商业蛋白质分子量标准作为分子量标记物。然后将每个样品中大约 40， 000 个细胞加载到 12%SDS 页面凝胶上。
在凝胶电泳系统中，在 180 V 恒定电压下，使用 1 x Laly 电泳缓冲液电泳 45 至 60 分钟。然后，将蛋白质以 16 伏特的恒定电压BLO 到 PVDF 膜上 60 分钟。使用反式印迹 SD 半干式转印槽，然后在室温下用 10 mL MPT 封闭膜 1 小时。
在 7 mL MPT 中稀释 7 μL 抗裂解 PARP 抗体。将 PVDF 膜与抗体溶液在 4 摄氏度下孵育过夜。取出抗体溶液，用 PBS 0.05%Tween 20 进行 3 次 10 分钟的洗涤，孵育后，将膜与 1.4 微升辣根过氧化物酶偶联的二抗（用 7 毫升 MPT 稀释）在室温下孵育 1 小时。
用 PBS 0.05%Tween 20 洗涤膜 3 次，根据制造商的方案，用商业试剂盒检测辣根过氧化物酶活性。并应用标准设备进行胶片显影，以可视化蛋白质条带。然后用 PBS 0.05%Tween 20 洗涤 3 次后，将膜与 7 毫升 western blot 剥离缓冲液在室温下孵育 30 分钟，去除结合的抗体，在 4 摄氏度下用 4 微升抗肌动蛋白抗体在 4 毫升 MPT 中探测膜过夜。
第二天，用大约 10 毫升 PBS 0.05% 吐温 20 在膜上进行三个 10 分钟的洗涤步骤，然后在室温下孵育 1 小时后，将膜与 1.4 微升辣根过氧化物酶偶联的二抗稀释在 7 毫升 MPT 中孵育。用 PBS 0.05%Tween 20 洗涤膜 3 次，用商业试剂盒检测辣根过氧化物酶活性，并使用标准设备进行胶片显影以可视化蛋白质禁令。在本实验中，对 HEK 2 93 GFP 和 HEK 2 93 GFP sabe 细胞的全细胞裂解物进行免疫输血，使 GFP 表现出稳定的表达。
HEK 2 93 GFP 和 HEK 2 93 GFP sabe 细胞的代表性流式细胞术分析显示 GFP 表达的强度。HEK 2 93 GFP 和 HEK 2 93 GFP sabe 细胞用 4 微摩尔孢菌素处理 6 小时以诱导内源性细胞凋亡。通过裂解的 PARP 免疫印迹分析细胞凋亡，其中发现与 HK 2 93 GFP 细胞相比，HK 2 9 3 GFP SA B 细胞的 PARP 切割减少。
CB 可防止 bax 诱导的细胞凋亡，但不能防止 caspase 3 诱导的细胞凋亡。在实施此程序时，重要的是要探测尽可能多的信号通路组分以帮助识别相互作用步骤。最好测试在基态和活化状态下均被激活的蛋白质，以确定所选效应蛋白是否干扰通路本身，或者更确切地说是干扰此程序后的激活步骤。
可以进行其他方法，如敲除、敲除酵母、两种杂交下拉、翻译后修饰或蛋白水解稳定性测定，以回答其他问题，例如，这些微生物效应器采用哪些确切的分子机制来纵正常的宿主细胞生理学？以及这对病原体的生存和传播有何益处。
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概述
本研究调查了细菌毒力因子如何干扰细胞内信号传导途径，特别关注凋亡信号级联反应。通过利用可诱导表达系统，研究人员可以剖析特定蛋白质的活性及其对宿主细胞信号传导的影响。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞信号传导
- 细菌致病
- 凋亡
背景
- 理解细菌如何操纵宿主细胞过程对于感染生物学至关重要。
- 凋亡信号传导途径是细菌效应蛋白的主要靶标。
- 识别干扰点可以揭示致病机制。
- 这种方法也可以应用于其他细胞死亡途径和信号网络。
研究目的
- 分析细菌蛋白与宿主细胞信号级联反应的干扰。
- 确定细菌毒力因子影响的凋亡信号传导的具体步骤。
- 增强对病原体如何逃避宿主防御的理解。
使用的方法
- 建立表达目标蛋白的稳定细胞系。
- 创建可诱导表达载体系统。
- 在特定步骤激活宿主细胞信号级联反应。
- 使用Western blotting分析评估对凋亡信号传导的干扰。
主要结果
- Burnett毒力因子KA B干扰凋亡级联反应。
- 干扰发生在特定信号传导组分的下游。
- 结果提供了对细菌毒力机制的洞察。
- 该方法可以适用于研究其他信号传导途径。
结论
- 这种方法对于剖析细菌在信号传导途径中的干扰是有效的。
- 研究结果有助于理解致病策略。
- 潜在应用范围扩展到各种细胞死亡和信号传导机制。
常见问题
Executive Industry Relevance
Dissecting the precise step at which bacterial virulence factors interfere with host intracellular signaling is critical for target validation and mechanistic de-risking in infectious disease drug discovery. This inducible expression system enables functional mapping of protein or small molecule effects within defined signaling cascades, supporting predictive confidence in early-stage portfolio decisions. The approach is directly relevant for prioritizing anti-virulence strategies and clarifying host-pathogen interaction mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses by pinpointing effector action within signaling pathways.
- Supports biological de-risking by clarifying whether targets act upstream or downstream of key pathway nodes.
- Facilitates functional target validation through inducible, step-specific pathway activation.
- Improves predictive confidence for advancing anti-infective candidates.
Screening & Assay Development
- Prepares validated cellular systems for downstream screening of bacterial effectors or small molecules.
- Standardizes pathway activation and readout conditions for reproducible quantitative analysis.
- Enables robust comparison of compound or protein effects at defined signaling steps.
- Supports scalable assay development for high-content screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mechanistic findings with disease-relevant host-pathogen interactions.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of anti-virulence strategies.
- De-risks translational advancement by clarifying molecular mechanisms of host manipulation.
- Supports biomarker identification for pathway-specific intervention points.
Pipeline & Workflow Integration
This inducible system integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to lead identification and preclinical validation of anti-infective agents.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway mapping for bacterial effector proteins.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts for comparing intervention effects at specific signaling nodes.
- Analytics: Enables statistical analysis of pathway inhibition or activation using immunoblot and flow cytometry outputs.
- Translational Research: Bridges mechanistic insights to preclinical models of host-pathogen interaction.
- Enterprise Reuse: Offers a modular platform adaptable to diverse signaling pathways and effector classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible workflows for pathway interrogation.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by clarifying intervention points.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of anti-virulence and host-targeted strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in inducible expression systems and cell signaling analysis.
- Needs access to cell culture, transfection, and immunoblotting infrastructure.
- Demands cross-team standardization of pathway activation and readout protocols.
- Adaptable to various cell lines and signaling pathways with appropriate validation.
- Dependent on availability of well-characterized pathway components and quantitative assays.
