基于荧光的感染组织细菌基因调控方法

这种方法可以揭示细菌基因表达的空间模式和生理适应宿主组织微环境的策略，这些环境在组织中整个种群中平均时丢失。使用这种技术，可以检测到潜在的异质性，在确定新的细菌途径和蛋白质时，必须考虑抗病毒或抗菌化合物的目标。首先从冷冻甘油库存中条纹血脂盘上感兴趣的S.aureus菌株，并在37摄氏度下孵育血版，16至24小时，以基于其对红血球进行解压和形成透明区域的能力来确认其血解表型。

在无菌玻璃管中，将每株单菌落分离在四毫升的尝试大豆汤（TSB）中，并在37摄氏度的管辊中以约70度角和每分钟70次旋转旋转管管16至24小时。第二天早上，测量分光光度计培养物的光学密度为600纳米（OD 600），并在25毫升无菌TSB中，以5至1瓶的体积比在125毫升德龙烧瓶中稀释至0.05的OD 600。在37摄氏度的水浴中孵育培养物，每分钟旋转280次，并在指数阶段收获细胞。

通过离心使细胞产生离心，并在同等体积的无菌PBS中洗涤细胞两次。然后将新鲜PBS中的细胞重新注入到每毫升浓度形成单位的第八个菌落的1倍，供它们随后注射到接受动物体内。在适当的实验终点，将肾脏、心脏、肝脏、肺和脾脏收获到15毫升聚丙烯管中，含有10%缓冲的甲醛，在室温下在黑暗中通过温和的摇动或旋转孵育24至48小时。

在固定结束时，将器官嵌入透明组织冷冻介质中，在零下80摄氏度储存。使用低温恒温器获取 10 微米厚的组织部分，并在黑暗中干燥单个预清洁带电玻璃幻灯片上的部分 20 分钟，然后应用硬安装介质，辅以 DAPI。然后应用盖板，并在室温下一夜之间固化幻灯片，然后将样品转移到四摄氏度的长期储存中。

要识别样品中的病变，请将幻灯片放在激光扫描共认显微镜的舞台上，并使用适当的目标来可视化单个细胞，以获得病变的图像。要测量共合图像中的荧光强度，请打开 ImageJ 中的图像并调整亮度和对比度，以正确可视化病变的荧光信号。使用多边形选择工具定义感兴趣的区域，并将 ROI 添加到 ImageJ 中的"编辑"选项卡下的 ROI 管理器。

选择"编辑"，然后选择，最后选择"添加到管理器"。接下来，重命名 ROI 并标记相应的映像。要定义质心，请打开"分析"选项卡并选择"面积、平均灰色值、中心值"和"限制阈值"。

提取重心荧光强度值或测量给定单位面积给定病变中平均荧光强度。这可以通过使用阈值函数设置下荧光限值和上荧光限值来达到此目的。将数据导出到 Excel 文件，并准备一列，指示外围和核心单位区域的单位平均荧光强度。

要计算外围和核心单位面积的均荧光强度，请手动定义阈值的上限和下限。金黄色葡萄球菌热核素聚变GP融合荧光在携带融合基因的细胞中平均比不携带记者融合的细胞高近9倍。同样，串联二元番茄聚变荧光比空处理者控制高大约六倍。

记者活动的模式可以通过流动细胞学与组织均质体来证实。虽然荧光的折叠差异通常较低。荧光测量的变化可能是由于记者的异构表达。

例如，在这些代表性的样品中，观察到在同一组织样本中，有些病变表示一个或两个记者在大约100微米的距离内。检查记者在金黄色葡萄球菌群落中单细胞分辨率的活动，可以发现金黄色葡萄球菌热核素酶表达在脓肿中的空间调节，这些脓肿受到强DAPI染色，可能与中性粒细胞外陷阱的形成和释放有关。例如，与局部到外围相比，在金黄色葡萄球菌聚变聚变荧光中观察到明显高于金黄色葡萄球菌。

在同一个 abces 中，串联二元番茄融合荧光的模式似乎倒置。但是，此实验中的模式在统计学上并不显著。获得完整的低温嵌入解剖对于荧光图像分析至关重要，应谨慎进行。

对细菌细胞进行排序，以捕获不同程度表达融合的亚群，加上RNA-Seq分析，可以照亮转录组基因组范围的变异。使用甲醛时小心，因为它是致癌物质，在直接接触时可能导致皮肤刺激、过敏反应或眼睛损伤。生成携带荧光报告者兴趣的菌株的突变衍生物有助于揭示观察到的空间调控模式的遗传基础。