Name: 基于荧光的感染组织细菌基因调控方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: 了解基于荧光的细菌基因调控方法，用于分析金黄色葡萄球菌在感染组织中的空间表达模式。该技术可检测细菌群体异质性，为开发新型抗菌靶点提供重要依据。

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我们感谢 Alexander Horswill 惠赠 PsarAP1-tdTomato 融合质粒，感谢 Karen Creswell 在流式细胞术分析方面的帮助。我们还感谢 Alyssa King 在统计学分析方面的建议。本研究部分由美国国立卫生研究院探索性/发展性研究基金（资助号 AI123708）以及 SRB 的实验室启动资金资助。资助方在研究设计、数据收集与解释，以及决定提交论文发表等过程中均未发挥任何作用。

本文所述所有方法均已获得乔治城大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 荧光报告菌株的构建
<ol>
	<li>使用EcoRI和SmaI限制性内切酶对基因组整合型pRB4载体进行连续酶切。根据制造商的说明书，先用SmaI在25 °C下对1 µg pRB4进行过夜消化，然后加入EcoRI，在37 °C下继续酶切反应1小时。通过在65 °C孵育20分钟使酶失活。</li>
	<li>从基因组DNA中PCR扩增目标调控区（本例中为包含嗜热核酸酶[nuc]启动子区域的约350个碱基对的DNA片段），并在扩增片段的5'端引入EcoRI限制性位点，3'端引入SmaI限制性位点。SmaI识别序列必须与翻译起始密码子保持阅读框一致。本研究中，使用高保真DNA聚合酶，按照制造商推荐条件，以正向引物oRB015（5'-atcattgaattctccaaagtaaattataagttatac-3'）和反向引物oRB016（5'-gggcataactaacacctctttctttttag-3'）进行PCR扩增，退火温度为53 °C。使用PCR纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化所得片段。</li>
	<li>将上述PCR产物按照步骤1.1的方法用EcoRI和SmaI进行酶切，并使用T4 DNA连接酶将酶切后的DNA片段连接至pRB4的相应位点，构建整合型重组质粒。将连接产物转化至E. coli中，并验证构建序列的正确性。</li>
	<li>如前所述34，通过电穿孔法将构建质粒转入S. aureus菌株RN4220。简言之，在B2肉汤培养基（1% [w/v] 酪蛋白水解物，2.5% [w/v] 酵母提取物，2.5% [w/v] NaCl，0.1% [w/v] K2PO4，0.5% [w/v] 葡萄糖）中，使用1 µg质粒和70 µL电转化感受态细胞（电击参数：100 Ω，25 µF，2.3 kV）。在含红霉素（5 µg mL-1）和5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃苷（X-Gal；80 µg mL-1）的胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）平板上，于允许温度（30 °C）下筛选红霉素抗性（Emr）转化子。由于质粒编码的β-半乳糖苷酶活性，转化子呈现蓝色。 
	注意：由于强烈的限制-修饰屏障，将DNA转入临床分离株极为困难35。因此，选用S. aureus RN4220作为融合构建体的中间受体，因其缺乏限制系统且具有高度可转化性。</li>
	<li>在允许温度下，通过电穿孔或噬菌体介导的转导36，将质粒转移至目标S. aureus USA300菌株。简言之，使用含5 mM CaCl2的TSA平板，在30 °C过夜培养以在供体菌株上扩增Φ11噬菌体颗粒，随后通过0.45 µM醋酸纤维素注射器滤器过滤除菌。利用所得裂解液将S. aureus LAC菌株转导为红霉素抗性（Emr）。 
	注意：LAC是一种广泛使用的临床分离株，先前通过在TSB培养基中连续传代，消除其携带赋予红霉素抗性的天然质粒pUSA03，从而使其对红霉素敏感37,38。</li>
	<li>如前所述32，通过两次连续的同源重组事件将构建体整合至染色体中。重组子在含5 μg mL-1氯霉素的TSA平板上表现为氯霉素抗性（Cmr），对红霉素敏感（Erms），且不再呈现蓝色。 
	注意：若条件允许，应通过噬菌体介导的转导将标记的融合构建体重新导入USA300菌株，以避免体外传代和温度变化导致的突变累积39。</li>
</ol>
2. 动物感染：接种物制备、系统性感染及组织处理
<ol>
	<li>细菌接种物的制备
	<ol>
		<li>划线 S. aureus 从冷冻甘油菌种中分离目标菌株至血琼脂平板。在37 °C培养16–24小时，根据菌株裂解红细胞（RBCs）并形成清晰透明溶血环的能力，确认其溶血表型。</li>
		<li>在无菌玻璃试管中，将每种菌株的单个菌落接种于4 mL胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中，启动过夜培养。将试管置于约70°倾角、转速为70转/分钟（RPM）的试管旋转仪中，于37 °C旋转培养16–24小时。</li>
		<li>使用分光光度计在600 nm处测量光密度（OD600) 步骤 2.1.2 中培养物的光密度值。使用无菌培养基作为空白对照（空白）。将这些细胞稀释至 OD600 在两个独立的125 mL德隆烧瓶（烧瓶体积与培养液体积比为5:1）中，分别加入25 mL无菌胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）并调节菌液浓度至0.05，在水浴中培养（以确保向培养物有效传热），于37 °C、280 RPM条件下振荡培养。 
		注意：接种物的培养可通过多种方式进行；此处提供一种将细胞培养至对数生长期的方法。无论采用何种方式，重要的是始终使用相同的方法制备用于接种的细胞。</li>
		<li>在 OD600 约为1时，将细胞重新稀释至新鲜培养基中，起始OD600 以确保细胞达到指数生长期，且在过夜培养期间积累的因子已降低至指数生长期水平。</li>
		<li>在指数生长期收获细胞（OD600 ~0.6–0.8）通过在 3,000 离心 x g 室温下孵育10分钟。</li>
		<li>用等体积的无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS；pH 7.4）洗涤沉淀物两次。</li>
		<li>用 1× PBS（pH 7.4）重悬细胞，调整细胞浓度至 1 × 108 菌落形成单位（CFUs）/mL-1 或根据所需实验的实际情况而定。 
		注意： 确定OD之间的关系非常重要600 和 CFU/mL-1 因为不同菌株的细胞大小和形状可能存在差异，这会影响光散射特性，进而影响感染剂量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>动物准备与细菌感染
	<ol>
		<li>将小鼠在纯化饮食 AIN-93 上适应 7 天。该饮食配方旨在提供充足营养，同时减少因摄食标准小鼠饲料中植物性成分所引起的组织自发荧光40. 
		注意： 使用6-8周龄的雌性C57/BL6小鼠，但小鼠品系和性别需根据具体研究而定。</li>
		<li>感染前，用温水扩张小鼠尾静脉。</li>
		<li>通过尾静脉注射100 µL细菌接种物以建立全身性感染。若需进行流式细胞术分析（见第4节），请保留一份初始接种物的等分试样。</li>
		<li>每日监测动物，并使用经本机构动物护理与使用委员会审查和批准的监测系统评估其健康状况。</li>
		<li>让感染按预期持续一定时间。此处，实验在感染后3天终止。 
		注意： 在这些条件下，脓肿由被纤维蛋白沉积物包裹的葡萄球菌细菌群落构成，并被同心层状排列的免疫细胞所包围5,41.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>器官采集与组织处理
	<ol>
		<li>通过 CO 处死动物2 吸入麻醉，随后以颈椎脱位作为辅助方法处死，并进行剖检。</li>
		<li>取肾脏（右侧）及其他重要器官（心脏、肝脏、肺、脾脏），转移至含有10% [v/v] 缓冲福尔马林的15 mL聚丙烯管中。随后将这些器官进行下文步骤2.3.4。</li>
		<li>将左侧肾脏转移至含有约500 µL 2 mm二氧化硅珠和1 mL无菌1x PBS（pH 7.4）的无菌耐冲击2 mL离心管中。将该器官继续进行至步骤4.2。</li>
		<li>将2.3.2步骤中的器官置于室温下避光固定，同时轻轻振荡或旋转，时间至少24小时，但不超过48小时。</li>
		<li>将器官包埋于透明组织冷冻介质中，并于 -80 °C 保存组织。</li>
		<li>使用冷冻切片机将组织切成10 µm厚的切片。</li>
		<li>在预先清洁并带电的玻璃载玻片上将切片于避光条件下干燥 20 分钟，加入含 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染料的封片剂，盖上盖玻片。将封片后的载玻片于室温下避光静置过夜，随后转移至 4 °C 长期保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 激光扫描共聚焦显微镜与图像处理
<ol>
	<li>使用适用于所用荧光报告基因的激光器，通过观察载玻片定位病灶。本实验中采用绿色（GFP）、红色（tdTomato）和蓝色（DAPI）荧光信号。</li>
	<li>选用适当的物镜获取图像，以观察单个细胞（例如，通常使用 20x 或 40x 物镜）。</li>
	<li>测量共聚焦图像中的荧光强度。
	<ol>
		<li>在 Image J 中打开共聚焦图像，并调整亮度/对比度，以清晰显示病灶的荧光信号。</li>
		<li>定义感兴趣区域，并通过使用 阈值设定（Thresholding） 选项，根据需要设置荧光信号的下限和上限。</li>
		<li>在 Image J 的 分析（Analyze） 选项卡中，选择 面积 → 平均灰度值 → 质心 → 限制于阈值，以确定质心位置。&#160;</li>
		<li>提取质心处的荧光强度值，或测量给定病灶单位面积内的平均荧光强度（平均荧光强度，MFI），分别针对 GFP 和 tdTomato 进行。此处使用了 1 µm2 的面积单位。 
		注意： 当样本身份已知时，由另一位研究者进行盲法二次分析可最大限度减少偏差。</li>
		<li>绘制数据图表，并对每组比较进行适当的统计学分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 流式细胞术分析
<ol>
	<li>（可选）在感染当天测定接种物的融合活性（参见第2.2.3节）
	<ol>
		<li>向899 µL的1x无菌PBS（pH 7.4）中加入100 µL每种接种物和1 µL膜通透性核酸染料（见材料表）。作为对照，务必设置不含核酸染料的样本。</li>
		<li>对所有样本进行流式细胞术检测。 
		注意：在首次实验中，建议为所关注的融合设置仅含载体的对照，以确定合适的电压设置。阳性与阴性样本之间应有清晰的分离，这是数据分析的关键，表明报告信号显著高于背景信号。</li>
		<li>通过核酸染料信号（y轴）和前向散射（x轴）绘制事件，以识别细菌群体。</li>
		<li>在核酸染料阳性且前向散射大小符合细菌特征（对于S. aureus，大小在0.5至2.0 µm之间）的事件周围绘制包含门控。 
		注意：在识别该群体时应严格把控，确保仅包含明显符合这些参数的事件。务必确保该门控在其他条件下排除所有阴性对照中的事件。在本研究中，分析时约有70%的细胞群体满足这些条件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>动物安乐死后组织样本的分析：
	<ol>
		<li>对动物实施安乐死，取出左肾（参见步骤2.3），并转移至含有1 mL 1x无菌PBS（pH 7.4）和250 µL 2 mm硼硅酸盐珠的珠磨管中。</li>
		<li>破坏组织以释放细菌细胞。对于肾脏，使用匀浆器进行细胞破碎。本实验中采用三次30秒、6800 rpm的脉冲处理，每次之间在湿冰上冷却1分钟，以尽量减少样本加热。</li>
		<li>在4 °C预冷的台式微量离心机中，以250 x g离心3分钟，沉淀较大的组织碎片。 
		注意：通常管底可见细胞沉淀，上层为漂浮的碎片，中间的水相层含有细菌细胞。</li>
		<li>从水相层中转移10 µL至一个洁净的1.5 mL微量离心管中，该管内已含有1 µL核酸染料溶于989 µL PBS中（总体积1 mL）。</li>
		<li>使用与初始接种物相同的采集参数和门控策略进行流式细胞术检测。 
		注意：由于样本主要含有组织碎片，细菌细胞数量将非常低。当数据载入分析软件后，若细胞为核酸染料阳性且经大小门控，也可使用&#34;活细胞门控&#34;选项。这有助于分析更多目标事件并减小文件大小。通常每样本计数近一百万个事件，但根据感染严重程度和所分析组织的大小，可能需要更多事件计数。</li>
		<li>数据分析：使用第4.1.4节中确定的包含门控，计算每个样本中各荧光染料的平均荧光强度（MFI）。在流式分析软件中将样本归一化至事件计数，通常分析中10,000个计数已足够。 
		注意：由于结果依赖于脓肿形成和感染严重程度，样本中事件数低于此值并不罕见。采用该方法，感染组织中通常可检测到500–40,000个事件。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

细菌感染性疾病由于获得抗生素耐药决定子，已成为全球日益严重的健康问题46由于病原体在感染过程中适应宿主环境对其生长和存活至关重要，因此靶向调控可增强病原体适应性的基因表达程序可能具有治疗潜力。其中一个关键的基因表达程序是由SaeR/S双组分系统（TCS）调控的一组基因，先前研究已证实该系统在免疫逃逸中发挥着至关重要的作用。47SaeR/S 可被多种因素诱导，其中最显著的是与中性粒细胞相关的因素8,20感染期间 S. aureus 引发强烈的炎症反应，导致中性粒细胞和其他吞噬细胞被募集到感染部位2继发液化性坏死和纤维蛋白沉积，形成脓肿以防止进一步的组织损伤48在这些免疫豁免部位内， S. aureus 细胞利用多种依赖Sae的基因产物重编程脓肿，以促进细菌增殖5<...

细菌通过差异性表达适应和生存所需的基因，来响应生理条件的变化以及环境中营养状态的改变。例如，机会性病原菌通常以相对较低的密度定植于宿主体表，且往往无害。然而，一旦细菌突破了物理和化学屏障，就必须应对宿主免疫细胞的防御反应以及营养物质的受限供应1。以Staphylococcus aureus为例，该菌可无症状地定植于约三分之一的人群中，但同时也是严重的皮肤和软组织感染、骨髓炎、心内膜炎及菌血症的致病原因2。S. aureus作为病原菌的成功之处，通常归因于其代谢灵活性，以及一系列与表面相关或可分泌的毒力因子，这些因子使细菌能够逃逸血液循环并在外周组织中复制3,4,5。由于金黄色葡萄球菌引发的疾病若导致宿主死亡，将使其自身陷入进化上的死胡同，并限制其向新宿主传播6，因此对毒力因子产生的投入必须受到严格调控。
一个由蛋白质和非编码RNA组成的复杂调控网络可响应多种环境刺激，包括细胞密度、生长阶段、中性粒细胞相关因子以及营养物质的可利用性，以确保毒力基因在宿主组织内的特定时间和空间精确表达7,8,9,10,11,12,13例如，SaeR/S 双组分系统（TCS）通过感受激酶（SaeS）和反应调节因子（SaeR）调控多种毒力因子的表达14SaeS 在宿主信号（例如）刺激下，会在一个保守的组氨酸残基上发生自磷酸化, 人中性粒细胞肽 [HNPs]、钙卫蛋白8,15,16磷酸基团随后被转移至SaeR上的一个天冬氨酸残基，使其活化为DNA结合蛋白（SaeR~P）17SaeR/S 双组分系统调控着20多个与致病性相关的基因，包括纤连蛋白结合蛋白（FnBPs）、杀白细胞素和凝固酶14,18,19,20靶点可分为高亲和力和低亲和力基因靶点，当SaeR~P水平在响应其诱导信号时升高，这些靶点可能被相继激活21SaeR/S 的活性受到其他基因表达调控因子的控制，例如 Agr 群体感应系统、毒素抑制蛋白（Rot）以及替代性 σ 因子 B（SigB）。22,23,24.
nuc 是金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）中一个依赖 Sae 的毒力基因，编码耐热核酸酶（Nuc），该酶在感染过程中对逃避中性粒细胞胞外诱捕网（neutral extracellular traps, NETs）以及病原体的播散至关重要25,26。在支链氨基酸和 GTP 存在的情况下，nuc 的表达还受到 CodY 的强烈间接抑制27，并受到金黄色葡萄球菌辅助调节蛋白 SarA 的直接抑制28,29，而 SarA 的活性受氧气（氧化还原状态）和 pH 的影响30。鉴于 sae 和 nuc 突变株在小鼠感染模型中表现出毒力减弱，因此人们关注开发能够抑制其相应功能的化学干预手段26,31。尽管如此，目前尚无关于这些基因在感染过程中调控机制的相关信息。
荧光报告基因已被用于在单细胞水平上监测和量化基因表达。本文中，我们介绍一种量化方法 S. aureus 感染过程中基因表达的变化，当与 体外转录组分析以及磁共振成像（MRI）和磁共振波谱（MRS）等强大的成像技术，可揭示细菌生理活动在体内的调控机制以及特定微环境中营养物质的相对丰度。该方法可应用于任何具有可操作遗传系统的细菌病原体。
基因组整合载体的概述。
基因组整合载体 pRB4 包含金黄色葡萄球菌（S. aureus）USA300 菌株假基因 SAUSA300_0087 上游和下游各 500 个碱基对，以促进同源重组。pRB4 源于温度敏感型载体 pMAD 骨架，该骨架含有红霉素抗性盒（ermC）以及用于重组子蓝白斑筛选的热稳定 β-半乳糖苷酶基因 bgaB32。该工程化报告载体还包含氯霉素抗性标记（cat），用于基因组整合后及质粒消除后的筛选，并含有 EcoRI 和 SmaI 酶切位点，用于将目标调控区域与超折叠绿色荧光蛋白（sGFP）连接（图 1）。已知核糖体结合位点（RBS）的选择会影响报告基因的活性，通常需要通过实验进行优化33。因此，本载体未提供特定的 RBS。此处使用天然的核糖体结合位点，以实现更接近自然状态的基因表达模式，但也可使用其他位点。

<table><tbody><tr><td>5% 绵羊血</td><td>Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA)</td><td>A10</td><td></td></tr><tr><td>5-溴-4-氯-3-吲哚基-&amp;beta;-D-半乳糖吡喃苷（X-Gal）</td><td>ThermoScientific</td><td>R0402</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-25</td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6 小鼠</td><td>Charles River</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-0378</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Thermo Scientific</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>培养瓶盖</td><td>VWR International</td><td>2005-02512</td><td></td></tr><tr><td>D+2:25NA 寡核苷酸</td><td>Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>DNA 连接酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>红霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5389</td><td></td></tr><tr><td>流式分析仪</td><td>Becton Dickinson</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>玻璃珠</td><td>Sigma</td><td>Z273627</td><td></td></tr><tr><td>质粒小量提取试剂盒</td><td>Promega</td><td>A1220</td><td></td></tr><tr><td>旋转水浴摇床</td><td>New Brunswick Innova</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>PCR 产物纯化试剂盒</td><td>QIagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Cellgrow</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>Tecan</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24 匀浆器</td><td>Bertin Laboratories</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>pUC57-Kan</td><td>GenScript (Piscataway, NJ)</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Taq DNA 聚合酶</td><td>New England Biolabs (Ipswich, MA)</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>限制性内切酶</td><td>New England Biolabs (Ipswich, MA)</td><td>R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI)</td><td></td></tr><tr><td>逆转录酶</td><td>New England BioLabs</td><td>E6300L</td><td></td></tr><tr><td>Sanger 测序</td><td>Genewiz (Germantown, MD)</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Sub Xero 透明组织冷冻介质</td><td>Mercedes Medical</td><td>MER5000</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>superloop</td><td>GE Lifesciences</td><td>18111382</td><td></td></tr><tr><td>带滤器注射器</td><td>VWR International</td><td>28145-481</td><td></td></tr><tr><td>Syto 40</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11351</td><td>膜通透性核酸染料</td></tr><tr><td>四环素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7660</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨大豆肉汤</td><td>VWR</td><td>90000-376</td><td></td></tr><tr><td>紫外-可见分光光度计</td><td>Beckman Coulter-DU350</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>含 DAPI 的 Vectashield 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr></tbody></table>

一种基于荧光的方法用于研究感染组织中的细菌基因调控

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

细菌的毒力基因通常在转录水平上受到多种因子的调控，这些因子可响应不同的环境信号。某些因子直接作用于毒力基因；另一些则通过调节下游调控因子的表达或影响调控因子活性的信号分子的积累，从而控制致病过程。尽管在 体外 生长过程中，关于感染期间基因表达如何调节的信息仍十分有限。当特定基因产物被视为潜在治疗干预靶点时，这类信息尤为重要。转录水平的研究方法，如定量实时RT-PCR和RNA-Seq，能够在全基因组范围内检测基因表达，但面临诸多技术挑战，包括细菌RNA丰度远低于宿主RNA，以及样本易被RNase降解等问题。利用荧光报告系统评估基因调控相对简便，并可与具有独特光谱特性的荧光蛋白实现多重检测。该方法能够对具有复杂三维结构及影响细菌调控网络的理化梯度的组织中，进行单细胞水平的时空动态基因表达分析。而基于群体平均数据的传统方法则会丢失此类信息。本文中，我们描述了一种定量检测细菌病原体基因表达的方法 原位该方法基于简单的组织处理及对报告蛋白荧光的直接观察。我们通过检测以下基因的表达，验证了该系统的实用性 Staphylococcus aureus 核酸酶（thermonuclease）nuc），其基因产物在体外和体内均对免疫逃逸及完全毒力至关重要。我们证明 nuc-gfp 在肾脓肿中高表达，并显示出异质性基因表达，部分原因在于明显的空间调控 nuc 在完全激活免疫反应的脓肿中启动子活性。该方法可应用于具有可操作遗传系统的任何细菌及任何感染模型，为临床前研究和药物开发提供有价值的信息。

我们开发了一种源自 pMAD 的质粒32 可通过双交换同源重组将任意报告基因融合构建体导入染色体图1）。该载体可用于对任何能够支持GFP蛋白表达并产生高于背景水平荧光信号的调控区域进行定量分析。该质粒具有氨苄青霉素抗性（Apr用于维持和扩增 E. coli 并赋予红霉素抗性（Emr) 在 S. aureus 该质粒还赋予氯霉素抗性（Cmr），从而便于在各种突变菌株之间转移整合的报告基因融合片段，以进行复杂的遗传学分析 S. aureus 
作为概念验证，我们将 nuc 调控区到 gfp. nuc 因其基因产物是实现完全毒力所必需的，并且在限制巨噬细胞方面也发挥必要作用 金黄色葡萄球菌-...

本文介绍了一种在细胞水平上分析动物组织中细菌基因表达的方法。该方法为研究细菌群体在感染过程中响应组织环境而产生的表型多样性提供了资源。

细菌的毒力基因通常在转录水平上受到多种因素的调控，这些因素可响应不同的环境信号。某些……

该方法可以揭示细菌基因表达的空间模式以及细菌在宿主组织微环境中生理适应的策略，而这些信息在对整个组织中的细菌群体进行平均分析时会丢失。利用该技术可检测到潜在的异质性，这在鉴定可作为抗毒力或抗菌化合物靶点的新型细菌通路和蛋白质时必须予以考虑。首先，从冷冻甘油菌种中将感兴趣的金黄色葡萄球菌（S. aureus）菌株划线接种于血琼脂平板，于37°C培养16至24小时，通过观察其溶解红细胞并形成清晰透明溶血环的能力，确认其溶血表型。将各菌株的单菌落分离物分别接种于装有4毫升胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）的无菌玻璃试管中，在37摄氏度下以约70度倾斜角、70转/分钟的转速于试管旋转仪中旋转培养16至24小时。次日，使用分光光度计测定培养物在600纳米处的光密度（OD600），并将菌液用无菌TSB稀释至OD600为0.05，总体积为25毫升，置于125毫升德隆烧瓶中，烧瓶体积与培养液体积比为5:1。将培养物置于37摄氏度水浴摇床中，以280转/分钟振荡培养，并在对数生长期收获菌体。通过离心收集细胞，并用等体积的无菌 PBS 洗涤细胞两次。然后将细胞重悬于新鲜 PBS 中，调整浓度至每毫升含 1 × 10⁸ 个菌落形成单位，用于后续注射至受体动物。在适当的实验终点，将肾脏、心脏、肝脏、肺和脾脏采集至含有 10% 缓冲福尔马林的 15 毫升聚丙烯管中，在室温下避光孵育 24 至 48 小时，并轻轻振荡或旋转。固定结束后，将器官包埋于透明组织冷冻介质中，于零下80摄氏度保存。使用冷冻切片机获取10 µm厚的组织切片，并将切片置于预先清洁的带电荷载玻片上，在避光条件下干燥20分钟，随后加入含DAPI的硬封片剂。然后加盖盖玻片，室温下避光过夜固化，再将样本转移至4摄氏度长期保存。为了识别样本中的病灶，将玻片置于激光扫描共聚焦显微镜的载物台上，选用合适的物镜观察单个细胞，并采集病灶的图像。为测量共聚焦图像中的荧光强度，在 ImageJ 中打开图像，并调整亮度和对比度，以清晰显示病灶的荧光信号。使用多边形选区工具定义感兴趣区域，并在 ImageJ 的“编辑”选项卡下将该区域添加至 ROI 管理器中。选择“编辑”，然后选择“选择”，最后选择“添加到管理器”。接着，重命名感兴趣区域（ROI）并标记相应的图像。为定义质心，打开“分析”选项卡，选择“面积”、“平均灰度值”、“质心”和“限定为阈值”。提取中心点的荧光强度值，或测量给定病灶单位面积内的平均荧光强度。可通过使用阈值功能，根据需要设置荧光强度的下限和上限来实现。将数据导出至 Excel 文件，并准备一列用于标明病灶边缘和核心区域的单位面积平均荧光 intensity。为了计算周边和核心区域单位面积的平均荧光强度，需手动设定阈值的上下限。携带融合基因的细胞中，金黄色葡萄球菌核酸酶GFP融合荧光强度平均比未携带报告融合基因的细胞高出近九倍。同样，串联二聚体番茄红荧光蛋白融合荧光强度约为无报告基因对照的六倍。可通过流式细胞术检测组织匀浆中的报告基因活性模式来确认其表达情况。尽管荧光信号的倍数差异通常较低，但荧光测量值的变异可能源于报告基因表达的异质性。例如，在这些代表性样本中观察到，某些病灶在相同组织样本中距离约100微米范围内表达出一种或两种报告基因。在金黄色葡萄球菌脓肿群落中，以单细胞分辨率检测报告基因活性，揭示了金黄色葡萄球菌耐热核酸酶在强DAPI染色所界定的脓肿区域中存在空间性调控表达，可能与中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps）的形成和释放相关。例如，与位于外围区域相比，金黄色葡萄球菌耐热核酸酶GFP融合蛋白的荧光信号在脓肿群落内部核心区域显著更强。在同一脓肿中，串联二聚体番茄荧光蛋白融合荧光的模式似乎呈倒置状态。然而，本实验中的该模式在统计学上无显著性差异。获得完整的冷冻包埋切片对于荧光图像分析至关重要，应谨慎操作。 对细菌细胞进行分选以捕获不同程度表达融合蛋白的亚群，结合RNA-Seq分析，可揭示转录组范围内的全基因组变化。操作甲醛时需格外小心，因其为致癌物，直接接触可能引起皮肤刺激、过敏反应或眼部损伤。构建携带目标荧光报告基因的菌株的突变衍生物，有助于揭示所观察到的空间调控模式的遗传基础。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

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活体生物发光细菌成像 In Vivo

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