应用荧光共振能量转移（FRET）审查效应转运效率由贝氏柯克斯体 siRNA沉默中

该实验程序的总体目标是检查特定宿主过程对细菌病原体易位效应蛋白能力的影响。这种方法可以帮助回答细胞微生物学领域的关键问题。具体来说，宿主如何参与阻断或促进细菌毒力效应子向宿主细胞的递送。

这种技术的主要优点是它结合了两种成熟的技术。即 siRNA 基因沉默和报告论文测量细菌蛋白质易位。研究病原体与真核细胞之间的相互作用。

该方法提供了对柯克斯菌病原体的见解，也可用于研究依赖于有效蛋白质易位的其他细菌的宿主病原体相互作用。例如，衣原体、沙门氏菌和连接连接的大肠杆菌。培养表达 CBU0077 的贝氏梭菌后，根据文本方案将β内酰胺酶融合在带有通气盖的 25 平方厘米的培养瓶中。

接种 10 毫升预热的 ACCM2，每毫升氯霉素含有 3 微克，含有 20 微升细菌。在 37 摄氏度、5% 的二氧化碳和 2.5% 的氧气下培养培养物 7 天。要使用 siRNA 反向转染 hela 细胞，根据文本方案制备 siRNA 后，将 DMEM 加 10% FCS、05% 胰蛋白酶 EDTA 和 PBS 置于 37 摄氏度的水浴中 30 分钟，使其在使用前变温。

对于每个实验性 siRNA 转染，将 0.4 μL 转染试剂和 63.6 μL 减血清培养基混合在一个单独的微量离心管中。涡旋所有微量离心管，让组件在室温下复合 5 分钟。将 16 μL 每种实验 siRNA 添加到含有转染复合物的相应微量离心管中。

然后涡旋并在室温下孵育 20 分钟。在 20 分钟的孵育过程中，将 20 μL 转染试剂、减量血清培养基和 siRNA 混合物加入无菌黑色、平底、透明底 96 孔托盘的相应孔中。同样在 20 分钟的孵育过程中，使用 10 mL 预热的 PBS 在 75 cm² ² 的培养瓶中洗涤单层汇合或亚汇合的 hela 细胞。

向培养瓶中加入 1 毫升 05% 胰蛋白酶 EDTA 溶液，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 3 到 5 分钟以分离细胞。将细胞收集在 9 毫升含 10% FCS 的预热 DMEM 中。使用血细胞计数器对细胞进行计数。

然后用 DMEM 10%FCS 使细胞的最终密度达到每毫升 4 个细胞的 4.9 乘以 10。孵育 20 分钟后，立即将 80 μL 细胞移液到含有 siRNA 转染混合物的 96 孔板的每个孔中，这将使细胞密度达到每孔第三个细胞的 3.92 乘以 10。这是手术中最关键的一步。

20 分钟后，立即将 hela 细胞添加到 siRNA 转染混合物中，这一点非常重要。否则，转染效率可能会受到影响。确保空白孔仅含有 80 微升 DMEM 和 10% FCS。

将板孵育 24 小时。然后，将多通道适配器连接到真空源和移液器，用 100 μL 新鲜 DMEM 和 10%FCS 替换培养基。将细胞再孵育 48 小时。

在 ACCM2 中生长 7 天后，将 10 毫升贝氏柯斯体 P BlaM CBU0077培养物以 15， 000 倍 g 和室温离心 15 分钟。去除上清液后，使用 10 毫升预热的 DMEM FCS 重新悬浮沉淀。然后用水制备最终体积为 100 微升培养物的 1 分之一和 100 分之一的稀释液，并根据文本方案设置 QPCR。

在计算贝氏梭菌 P BlaM CBU0077培养物中每毫升的总基因组数后，使用预热的 DMEM FCS 将培养物体积调整至 2 毫升，浓度为 1.88 乘以每毫升 10 至 8 个细菌。接下来，从空白细胞中取出培养基并反向转染。然后将 50 微升稀释的细菌添加到适当的孔中，并将 50 微升 DMEM FCS 添加到空白和未感染的孔中。

根据文本方案制备 BlaM 底物的溶液后，通过混合 1.8 微升溶液 A 和 16.2 微升溶液 B 来制备预混液。然后加入 237 微升溶液 C 和 45 微升 0.1 摩尔丙磺舒。再次涡旋试管。

10 μL Six X 上样溶液直接加入所有空白和反向转染孔中，无需去除现有培养基。将板在室温下避光孵育 2 小时。为了确定易位水平，在酶标仪上，使用 Endpoint 作为读取模式创建荧光强度方案。

选择 96 孔微孔板，然后在光学设置下，选择两个多色，对于第一个数字预设，输入 410-10 纳米激发和 520-10 发射。对于第二个数字预设，输入 410-10 纳米激发和 450-10 发射。然后确保 Well multichromatics 处于选中状态。

接下来，选择直径为 3 毫米的轨道平均。在 Optical （光学） 下，选择 Bottom optical （底部光学）。然后在 Speed and Precision （速度和精度） 下，选择 Precise （精确）。

这相当于每孔 8 个区域。通过选择合适的孔作为空白孔和样品孔来调整板布局。然后，选择 Start measurement（开始测量）。

取下盖子，将托盘放入读板器中。通过对已用 OTP siRNA 反向转染的感染孔之一进行增益调整，确保调整增益值以避免达到最大荧光值。选择开始测量，使用 410 纳米激发的底部荧光以及蓝色和绿色荧光的 450 纳米和 520 纳米发射来测量所有合适的孔。

根据文本协议分析结果。该图展示了 QPCR 后标准品和样品的预期循环阈值示例，以确定 7 天贝氏柯克斯体培养中每毫升的基因组总数。根据这些数据，在 10 毫升重悬细菌培养物中，每毫升有 2.31 乘以 10 到 8 个基因组。

此处显示了在反向转染细胞与 BlaM 底物孵育后，三个独立实验中 Rab5A 或 Rab7A 对效应子易位沉默的结果。与 OTP 对照相比，在 Rab5A 和 Rab7A 沉默期间，BlaM CBU0077易位水平显着降低。如图所示，尽管与 OTP 对照相比，Rab5A 或 Rab7A 处理会导致细胞活力降低，但这种降低并不像 PLK1 处理那么严重，PLK1 是一种已知在沉默时会导致细胞死亡的基因。

观看本视频后，您应该对如何使用 siRNA 沉默特定宿主靶标有很好的了解，然后使用基于 FRET 的报告基因分析研究这对细菌效应蛋白易位的影响。该方案已针对 hela 细胞的 coxieller 感染中 Rab GTP 酶的沉默进行了优化。为了利用这种方法靶向其他宿主蛋白，需要优化转染条件以确保有效的基因沉默。

与将此方法与其他细菌病原体一起使用类似，需要优化感染条件。