Name: 应用荧光共振能量转移（FRET）审查效应转运效率由贝氏柯克斯体 siRNA沉默中 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: 了解如何利用siRNA基因沉默结合FRET报告基因检测技术，研究宿主细胞过程对贝氏柯克斯体效应蛋白转运效率的影响。该方法为细胞微生物学中的宿主-病原体相互作用研究提供了重要工具。

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本工作由国家健康与医学研究委员会（NHMRC）基金（基金编号 1062383 和 1063646）资助，授予 HJN。EAL 获澳大利亚研究生奖学金支持。

注意：所有涉及 Coxiella burnetii RSA439 NMII 培养或操作的实验步骤均须在生物安全二级实验室内的生物安全柜中进行，并遵守当地相关安全规范。下文所述的反向转染与易位实验流程示意图见图2。
1. 准备 C. burnetii 表达与CBU0077融合的培养物 &#946;-β-内酰胺酶（pBlaM-CBU0077）（第1天）
<ol>
	<li>制备1X ACCM-26:
	<ol>
		<li>将所列组分混合 表1. 用 6 M NaOH 将 pH 调至 4.75，并过滤除菌（不可高压灭菌）。ACCM-2 在 4°C 下保存约可稳定三周 4 &#176;C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生成 C. burnetii pBlaM-CBU0077 质粒保存液
	<ol>
		<li>感染HeLa 229细胞 C. burnetii 携带 pBlaM-CBU0077 质粒的菌株，传代培养直至大多数细胞中观察到大型空泡。
		<ol>
			<li>培养 C. burnetii 携带 pBlaM-CBU0077 质粒的菌株，置于 20 ml 含有 3 &#181;g/ml 75 cm 中的氯霉素2 带通气盖的组织培养瓶中培养 7 天 37 &#176;C 在 5 % CO2，2.5 % O2.</li>
			<li>离心 C. burnetii pBlaM-CBU0077 菌液在 15,000 条件下培养 &#215; g 室温下孵育15分钟。</li>
			<li>将沉淀重悬于20 ml DMEM + 10%胎牛血清（FCS）+ 3 &#181;g/ml 氯霉素（维持培养基）。从50%汇合度的75 cm²培养瓶中移除培养基。2 HeLa 229 细胞培养瓶。加入重悬的 C. burnetii 接种至 HeLa 229 细胞。在 37°C、5% CO₂ 条件下孵育 2 天。 37 &#176;C 在5 % CO₂中2 以建立对 HeLa 229 细胞的感染。</li>
			<li>将细胞分至175 cm²培养瓶中2 组织培养瓶
			<ol>
				<li>从75 cm²培养瓶中移除培养基2 烧瓶中用10 ml预热的PBS洗涤单层细胞两次。</li>
				<li>加入1 ml 0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液，将细胞置于 37 &#176;C + 5 % CO₂2 孵育3 - 5分钟以解离细胞。</li>
				<li>将细胞重悬于10 ml维持培养基中。取2 ml重悬的细胞加入至175 cm²培养瓶中。2 含有38 ml维持培养基的培养瓶</li>
				<li>孵育于 37 &#176;C 在5 % CO₂中2 再培养3至5天，直至达到100%汇合度并观察到大量空泡。</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
		<li>从175 cm²培养瓶中收集上清液2 烧瓶，加入 10 ml dH₂O2O覆盖感染的HeLa 229细胞，孵育15分钟以裂解感染细胞。</li>
		<li>将上清液与裂解的细胞混合，在15,000离心收集沉淀 &#215; g 室温下孵育15分钟。</li>
		<li>将沉淀重悬于10 ml dH₂O中2O. 使用连接10 ml注射器的23G针头，将重悬液反复通过针头至少20次，进一步裂解细胞。500 ×g离心沉淀 &#215; g 5分钟以去除细胞碎片。</li>
		<li>去除上清液，并在15,000 × g下离心沉淀 &#215; g 在室温下孵育15分钟以收集 C. burnetii.</li>
		<li>重悬 C. burnetii 在DMEM + 10% FCS中培养，并按以下方法定量细菌数量 4. 稀释至 1 &#215; 109 基因组/ml，使用 DMEM + 10% FCS + 10% 二甲基亚砜（DMSO），分装 50 &#181;l 将样品分装至微量离心管中，于 -80 &#176;C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接种于10 ml预热的ACCM-2培养基中 3 &#181;g/ml 氯霉素与 20 &#181;l 的 C. burnetii pBlaM-CBU0077 菌株17 （由在以下过程中生成的菌株） 1.2 储存于 -80 &#176;C) 在 25 cm² 培养瓶中2 带透气盖的组织培养瓶。将细菌培养物在7天内培养 37 &#176;C 在5 % CO₂中2，2.5 % O2.</li>
</ol>
2. siRNA 反向转染及 HeLa 229 细胞接种（第 4 天）
<ol>
	<li>首次使用实验用 siRNA 时，请按以下步骤制备 siRNA：
	<ol>
		<li>短暂离心冻干的 siRNA，确保 siRNA 沉淀位于离心管底部。</li>
		<li>用移液器加入适量的 1× siRNA 缓冲液（表 2），将沉淀状 siRNA 重悬至终浓度为 20 µM。</li>
		<li>上下吹打溶液 3–5 次混匀，然后置于摇床上，室温孵育 30 分钟，每 5–10 分钟颠倒混匀一次。</li>
		<li>短暂离心离心管，确保 siRNA 集中在管底。</li>
		<li>将 siRNA 分装至微量离心管中，每管 50 µl，于 -20 °C 保存备用。</li>
		<li>需要时，取 50 µl 的 siRNA 储存液（20 µM），加入 950 µl 的 1× siRNA 缓冲液，配制成 1 µM 的工作液。注意：该 1 µM 工作液可多次冻融，用于重复转染。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 DMEM + 10 % FCS&#160;、0.05&#160;% 胰蛋白酶-EDTA 和 PBS 置于 37 °C 水浴（或等效设备）中预热 30 分钟。</li>
	<li>转染组分的制备： 
	注意：以下方案已针对 96 孔黑色壁、平底透明底微孔板中的 HeLa 229 细胞优化。不同细胞系可能需要优化转染试剂用量、siRNA 浓度及细胞接种密度。
	<ol>
		<li>每孔使用 0.1 µl 转染试剂、15.9 µl 低血清培养基（用于转染的最低必需培养基，参见 材料表）和 4 µl 的 1 µM siRNA（最终 siRNA 浓度为 40 nM）。为 OTP、PLK1、Rab5A 和 Rab7A 分别使用独立的微量离心管。每个实验条件设三个重复。96 孔板布局示例见 图 3。 
		注意：本方案包含两个对照：OTP 和 PLK1。OTP 由四种经优化以减少脱靶效应的 siRNA 混合而成，因此作为阴性非靶向对照。也可使用随机序列 siRNA 作为阴性对照。PLK1 表达缺失可通过激活促凋亡通路导致多种细胞系发生广泛细胞死亡，因此 PLK1 siRNA 作为转染阳性对照，其细胞死亡程度可反映转染效率。
		<ol>
			<li>对于每个实验用 siRNA 转染，分别在独立的微量离心管中加入 0.4 µl 转染试剂和 63.6 µl 低血清培养基。涡旋混匀所有微量离心管，室温孵育 5 分钟使组分形成复合物。</li>
			<li>向含有转染复合物的相应微量离心管中加入 16 µl 各种实验用 siRNA。涡旋混匀后，室温孵育 20 分钟。注意：孵育时间不得超过 30 分钟，否则转染效率将下降。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 20 分钟孵育期间（2.3.1.2），将 20 µl 转染试剂 + 低血清培养基 + siRNA 混合液加入无菌黑色壁、平底透明底 96 孔板的相应孔中。</li>
	<li>20 分钟孵育结束后，立即以 3.92 × 103 个细胞/孔的密度接种 HeLa 229 细胞。
	<ol>
		<li>从预热的 DMEM + 10% FCS 中，收获汇合或亚汇合状态的 75 cm2 组织培养瓶中的 HeLa 229 细胞，按标准方法将细胞重悬至终密度为 4.9 × 104 个细胞/ml。为确保转染效率不受影响，应在 20 分钟孵育期间（2.3.1.2）完成细胞制备。
		<ol>
			<li>用 10 ml 预热的 PBS 洗涤 HeLa 229 细胞单层两次。</li>
			<li>加入 1 ml 0.05 % 胰蛋白酶-EDTA 溶液，将 HeLa 229 细胞置于 37 °C + 5 % CO2 条件下孵育 3–5 分钟&#160;以使细胞脱落。</li>
			<li>用 9 ml 预热的 DMEM + 10 % FCS 收集细胞，使用血细胞计数板计数，并用 DMEM + 10 % FCS 将细胞调整至终密度为 4.9 × 104 个细胞/ml。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>向含有转染试剂 + 低血清培养基 + siRNA 混合液的各孔中加入 80 µl 密度为 4.9 × 104 个细胞/ml 的 HeLa 229 细胞。这相当于每孔细胞密度为 3.92 × 103 个细胞。 
		注意：BlaM 底物检测需要进行背景扣除。
		<ol>
			<li>在“空白”孔中不加细胞或 siRNA（图 3），而是加入 80 µl DMEM + 10 % FCS，设三个重复孔。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在 37 °C + 5 % CO2 条件下孵育 24 小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 更换培养基（第 5 天）
<ol>
	<li>24 小时后，使用连接至真空源的多通道适配器或手动多通道移液器移除培养基，并加入 100 µl 新鲜预热的 DMEM + 10% FCS。</li>
	<li>在 37 °C、5 % CO2 条件下继续培养 48 小时。</li>
	<li>此时，使用标准光学显微镜观察细胞的存活情况。若反向转染成功，则与含有 OTP siRNA 的孔相比，含有 PLK1 siRNA 的孔中将观察到明显的细胞死亡。</li>
</ol>
4. 使用 qPCR 定量测定 Coxiella burnetii pBlaM-CBU0077 菌株（第 7 天）
<ol>
	<li>在ACCM-2中培养7天后 37 &#176;C 在5 % CO₂中2，2.5% O2 (1.3），将10 ml离心 C. burnetii pBlaM-CBU0077 菌液在 15,000 条件下培养 &#215; g 室温下孵育15分钟。</li>
	<li>将细菌沉淀重悬于 10 ml 预热的 DMEM + 10% FCS 中。使用 dH₂O 对培养物（样品）进行 1:10 和 1:100 稀释。2O.</li>
	<li>设置qPCR所需的组分。 
	注意：基因组DNA（gDNA）提取可预先完成，并在-20 °C下保存20 &#176;C 直至需要时
	<ol>
		<li>标准品的制备：
		<ol>
			<li>从样本中提取基因组DNA Coxiella burnetii RSA439 NMII 野生型菌株在 ACCM-2 培养基中培养 37 &#176;C 在 5 % CO₂ 环境中2，2.5 % O2 使用基因组DNA提取试剂盒，按照制造商说明书操作，提取7天。</li>
			<li>测量基因组DNA浓度（g/&#181;l使用 Nanodrop（或同等设备）在 260 nm 吸光度下测定。</li>
			<li>计算每基因组拷贝数 &#181;l 使用以下公式进行计算，并转换为基因组数/毫升。 
			<img alt="方程" src="/files/ftp_upload/54210/54210eq1.jpg" /></li>
			<li>将基因组数量调整至每毫升10个9/毫升（最终体积为 100 &#181;l) 转移至新的微量离心管中，使用 dH₂O2O. 此溶液可煮沸10分钟&#160;并储存于 -20 &#176;C 直至需要时。</li>
			<li>在感染当天，制备10倍系列稀释的108 基因组/毫升至105 基因组/毫升，来自109 基因组/毫升 原液
			<ol>
				<li>移液器 10 &#181;l 10 分之 19 基因组/毫升进入 90 &#181;l 的 dH2O以生成108 基因组/毫升。涡旋混匀。用移液器移取 10 &#181;l 10 中的8 基因组/毫升进入 90 &#181;l 的 dH2O 以生成 107 基因组/毫升。涡旋并重复直至105 基因组/毫升</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
		<li>设置qPCR反应。为25个孔配制主混合液，以弥补加样误差。每个孔使用 10 &#181;l qPCR预混液 2 &#181;l 的 ompA 引物混合物（primer mix）4.3.2.2）和 3 &#181;l 的 dH2O. 
		注意：OmpA 是一种外膜蛋白 C. burnetii39 并在一个高度保守区域中选择了一段82个碱基对的片段作为探针，具体方法如前所述40.
		<ol>
			<li>设置每个标准品（dH₂O）2O, 105, 106, 107, 108, 109 基因组/ml）和样品（1:10 和 1:100 稀释）分别以双复孔或三复孔形式加入 96 孔 PCR 无裙边可撕板中。加入 5 &#181;l 将样品或标准品加入相应的孔中。</li>
			<li>使用 dH₂O2O，稀释两者 ompA 上游引物（5'-CAGAGCCGGGAGTCAAGCT-3'）和 ompA 反向引物（5'-CTGAGTAGGAGATTTGAATCGC-3'）至终浓度 4 &#181;M 合并至同一微量离心管中。 
			注意：该 ompA 引物混合物可预先配制，并于 -20 &#176;C 直至需要时</li>
			<li>结合 250 &#181;l qPCR预混液， 50 &#181;l ompA 引物混合物, 75 &#181;l dH2O，涡旋混匀。加入 15 &#181;l 将此主混合液加入含有标准品或样品的孔中。</li>
			<li>将8联管盖压紧至相应孔位，短暂离心PCR管，确保所有液体沉降至管底。</li>
			<li>在定量 PCR 仪上设置以下程序： 50 &#176;C 2 分钟， 95 &#176;C 10 分钟，随后进行 45 个循环的 95 &#176;C 1 秒，并 60 &#176;C 20 秒（图 4A).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>分析qPCR的Ct（循环阈值）值：
		<ol>
			<li>使用程序的导出功能将 Ct 值转移至电子表格中。</li>
			<li>创建标准品的散点图 105 基因组/毫升直至109 基因组数/毫升（以对数值表示）。剔除三个重复样本中的明显异常值。生成对数趋势线并确定该图的方程。</li>
			<li>使用生成的方程计算样品中每毫升的基因组总数 4.3.3.2不要忘记考虑样品的初始稀释倍数（1:10 和 1:100）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 反向转染细胞的感染（第7天）
<ol>
	<li>在计算用于感染的 C. burnetii pBlaM-CBU0077 培养物的总基因组数（基因组/ml）后，用预热的 DMEM + 10% FCS 将重悬的细菌培养物调整至感染复数（MOI）为 300，每孔终体积为 50 µl。 
	注意：接种的 HeLa 229 细胞在 72 小时后具有正常倍增时间，预期密度为 3.136 × 104 个细胞/孔。以 MOI 300 感染所需的细菌量为每 50 µl 中 9.408 × 106 个，相当于 1.88 × 108 个细菌/ml。
	<ol>
		<li>根据 qPCR 测得的数值（基因组/ml）（4.3.3.3），用预热的 DMEM + 10% FCS 将重悬的细菌稀释至终体积 2 ml，用于感染反向转染的细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>移除空白孔和反向转染细胞中的原有培养基。</li>
	<li>向相应孔中加入 50 µl 稀释后的细菌（1.88 × 108 个细菌/ml）。向空白孔和未感染孔中各加入 50 µl DMEM + 10% FCS。</li>
	<li>在 37 °C、含 5% CO2 条件下孵育 24 小时。</li>
</ol>
6. 加入BlaM底物以测定转位水平（第8天）
<ol>
	<li>准备BlaM底物6倍上样溶液的各组分溶液。 
	注意：溶液A、B和C由BlaM底物试剂盒提供（参见材料表）。溶液B在室温下可能形成沉淀。使用前将其置于37 °C温育，沉淀应可溶解。
	<ol>
		<li>首次使用试剂盒时，向干燥的溶液A中加入185 µl DMSO（随BlaM底物试剂盒提供）。随后将重悬后的溶液A储存于-20 °C。</li>
		<li>预先配制0.1 M丙磺舒溶液，并以1 ml分装储存于-20 °C备用。
		<ol>
			<li>配制0.4 M NaOH溶液（将1.6 g NaOH溶于100 ml dH2O中）。</li>
			<li>配制100 mM Na磷酸盐缓冲液（pH 8）（将1.56 g NaH2PO4·2H2O和1.41 g Na2HPO4溶于100 ml dH2O中）。</li>
			<li>将1.25 g丙磺舒加入22 ml 0.4 M NaOH中，剧烈震荡使其溶解。</li>
			<li>加入22 ml 100 mM Na磷酸盐缓冲液（pH 8）（溶液将变浑浊），搅拌以溶解形成的沉淀。</li>
			<li>必要时用1 M NaOH/HCl调节pH至8。</li>
			<li>剧烈搅拌并轻微加热（&#60; 50 °C），直至溶液基本澄清。</li>
			<li>经0.2 µm孔径滤膜过滤后，分装为1 ml每份。分装液储存于-20 °C。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每孔使用0.06 µl溶液A、0.54 µl溶液B、7.9 µl溶液C和1.5 µl 0.1 M丙磺舒。为30孔配制总混合液：先在微量离心管中混合1.8 µl溶液A和16.2 µl溶液B，充分涡旋混匀。随后加入237 µl溶液C和45 µl 0.1 M丙磺舒，再次涡旋使所有组分充分混合。 
	注意：6倍上样溶液在避光条件下可稳定保存最多4小时，但应尽量在使用前新鲜配制。</li>
	<li>将10 µl 6倍上样溶液直接加入所有空白孔和反向转染孔中，无需移除原有培养基。</li>
	<li>将培养板在室温、避光条件下孵育2小时。</li>
	<li>为测定转位水平，使用酶标仪定量荧光强度。 
	注意：以下步骤专用于ClarioSTAR酶标仪，其他等效酶标仪亦可使用。
	<ol>
		<li>创建一个新的荧光强度检测程序，读数模式选择终点法。</li>
		<li>按如下方式调整基本参数：
		<ol>
			<li>选择96孔板。</li>
			<li>在光学设置中，选择2个多色通道，并按以下用户自定义设置：(1) 激发波长设为410-10 nm，发射波长设为520-10 nm；(2) 激发波长设为410-10 nm，发射波长设为450-10 nm。确保选择“孔内多色检测”（well multichromatics）。</li>
			<li>选择轨道平均扫描，轨道直径设为3 mm。</li>
			<li>在光学模式中，选择底部检测（bottom optic）。</li>
			<li>在速度与精度设置中，选择“精确”（precise），对应每孔8个检测区域。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过选择相应孔作为样品来调整板布局。</li>
		<li>选择开始测量。</li>
		<li>移去盖子，将板放入酶标仪中。为避免荧光信号饱和，需调整增益值。为此，对一孔经OTP siRNA反向转染的感染孔进行增益校准，该孔代表预期最高转位水平。</li>
		<li>选择开始测量，使用底部荧光检测模式，激发波长为410 nm，分别在450 nm和520 nm处检测蓝色和绿色荧光，以测量所有目标孔。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 结果分析：
<ol>
	<li>在扣除空白值后，计算所有样本在 450 nm 与 520 nm（蓝色与绿色）的比值，并以未感染的 OTP 样本为参照进行相对表达。 
	注意：以下分析步骤适用于简单的电子表格程序。
	<ol>
		<li>使用酶标仪的导出功能，将获得的 520 nm 和 450 nm 发射波长下的原始荧光值（6.5）导入电子表格中。</li>
		<li>计算“空白”读数（仅培养基，无细胞）在 520 nm 波长下的平均值：将原始 520 nm 荧光值相加后除以孔数（3）。对 450 nm 波长的空白值重复此计算。这些数值代表由 96 孔板和培养基引起的背景荧光。</li>
		<li>扣除背景荧光。利用 7.1.2 中获得的数值，从所有样本的 520 nm 荧光值中减去空白 520 nm 波长的平均值。对 450 nm 波长的数值重复此步骤。</li>
		<li>为获得 450:520 nm 比值，使用经空白校正后的数值（7.1.3）。将每个样本的 450 nm 荧光值除以其对应的 520 nm 荧光值。</li>
		<li>通过将未感染 OTP 样本的 450:520 nm 比值（来自 7.1.4）相加后除以孔数（3），计算其平均值。</li>
		<li>通过将 7.1.4 中计算出的样本 450:520 nm 比值除以 7.1.5 中计算出的未感染 OTP 比值的平均值，计算各样本相对于未感染 OTP 的比值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 转位实验后加入细胞核染色以确定细胞数量（第8天）
<ol>
	<li>荧光定量后，使用连接至真空源的多通道适配器或手动多通道移液器，从所有孔中移除含有6倍上样液的培养基。</li>
	<li>向所有相应孔中加入50 µl含4% PFA（多聚甲醛）的PBS溶液以固定细胞。室温孵育20分钟。</li>
	<li>按照8.1步骤移除4% PFA PBS溶液，并用75 µl PBS洗涤细胞两次。</li>
	<li>向每孔中加入50 µl可穿透细胞的核染色剂，例如DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）。使用荧光显微镜采集图像，并利用适当的图像分析软件（如ImageJ41）对siRNA处理后各孔中的细胞核数量进行定量分析。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

分泌系统及其将效应蛋白转运至宿主细胞胞质的过程，是许多致病菌在特定复制生态位中建立感染所依赖的重要毒力组分。目前许多研究团队的关注重点在于细菌效应蛋白与宿主蛋白之间的相互作用，以及这些效应蛋白对宿主细胞通路的影响。然而，关于宿主蛋白是否可能在细菌效应蛋白的成功转位过程中发挥必要作用，相关研究极为有限，甚至尚未开展。
本研究中使用了专性胞内病原体Coxiella burnetii，该病原体是人畜共患Q热的致病因子。进入宿主细胞后，含有Coxiella的液泡被动地经过经典的内吞途径，最终到达酸性的溶酶体来源的液泡，并在其中大量复制。除了利用宿主正常的运输途径外，Coxiella建立成功复制微环境的能力还依赖于一个功能性的IVB型分泌系统（T4SS）及其后续的效应蛋白转运8,17。该分泌系统在功能上类似于已被深入研究的Legionella的Dot/Icm IV型分泌系统。这一点已通过用相应的Coxiella基因互补Legionella特定的dot/ic...

Coxiella burnetii 是一种独特的人畜共患胞内病原体，可引起人类感染——Q热。该疾病临床表现多样，从无症状的血清学转化到危及生命的慢性感染均有发生，后者常在暴露数年后表现为心内膜炎1。人类感染主要通过吸入被污染的气溶胶而发生，反刍动物是主要的感染宿主，尤其是奶牛、绵羊和山羊。尽管这些动物中的Coxiella感染通常为亚临床状态，但感染可导致流产，且分娩液和胎盘中含有大量细菌，可能污染局部环境1。此类污染对公共卫生和农业产业造成巨大负担的一个实例，是最近在荷兰发生的Q热暴发事件2。在2007年至2010年期间，确诊了超过4,000例人类Q热病例，此次暴发与山羊养殖场的严重污染密切相关3。此外，由于该细菌在环境中具有高度稳定性，且仅需极低感染剂量即可导致严重的发病率和死亡率，Coxiella已被美国疾病控制与预防中心列为潜在的生物武器制剂4。
Coxiella 存在两个相：从自然来源分离的I相生物体具有极强的毒力，而II相生物体则显著减毒 体内例如，在多次之后 体外 传代 贝氏柯克斯体 九英里I相生物体，产生含有不可逆染色体缺失的II相细菌，导致脂多糖（LPS）截短5。该菌株， C. burnetii 非肌肉型II型肌球蛋白（NMII）在组织培养模型中表型上与I期相似，为研究人员提供了一个更安全的研究模型。 Coxiella 实验室中的发病机制5近年来，多个突破性进展极大地推动了该领域的发展 Coxiella 遗传学。最显著的是，无菌培养基（酸化柠檬酸半胱氨酸培养基 - ACCM-2）的开发使得无细胞培养军团菌成为可能 Coxiella 在液体和固体培养基中6,7这直接改进了现有的可用遗传工具 Coxiella 包括可诱导基因表达系统、穿梭载体和随机转座子系统8-11最近，两种靶向基因失活的方法也已得到开发，为研究特定的毒力基因候选对象铺平了道路12.
肺泡巨噬细胞吞噬Coxiella后，该病原体在一种由膜包被的区室——即Coxiella包涵体（CCV）——内大量复制。CCV需要通过宿主的内吞运输途径，依次经过早期内体和晚期内体，最终成熟为溶酶体来源的细胞器13。在此过程中，CCV会获得多种宿主因子，这些因子或短暂存在，或持续与包涵体结合，包括但不限于Rab5、Rab7、CD63和LAMP-113-15。Coxiella在宿主细胞内的复制完全依赖于功能完整的Dot/Icm IVB型分泌系统（T4SS）8,16,17。该分泌系统是一种多蛋白复合结构，进化上与接合系统相关，跨越细菌和包涵体膜，将细菌蛋白（称为效应蛋白）递送至宿主细胞质中18。Coxiella的T4SS在功能上与已被深入研究的Legionella pneumophila的IVB型Dot/Icm分泌系统非常相似19,20。有趣的是，T4SS的激活及其后续的效应蛋白转运，直到Coxiella进入酸性溶酶体来源的细胞器后才发生，通常在感染后约8小时启动17,21。迄今为止，已鉴定出超过130种Dot/Icm效应蛋白9,17,22-24。其中许多效应蛋白可能在Coxiella于宿主细胞内复制过程中发挥重要作用，但目前仅有少数效应蛋白的功能得到了明确表征25-29。
本研究采用一种基于荧光的转位检测方法，该方法依赖于宿主细胞胞质内β-内酰胺酶活性对CCF2-AM FRET底物（下文简称BlaM底物）的切割作用（图1）。将目的基因与TEM-1 β-内酰胺酶（BlaM）在报告质粒上融合，该质粒可实现组成型表达。BlaM底物由两种荧光基团（香豆素和荧光素）组成，二者构成一个FRET配对。在无效应蛋白转位的情况下，香豆素被激发后会发生向荧光素的能量转移（FRET），产生绿色荧光发射；然而，若BlaM-效应蛋白融合蛋白被转位至宿主细胞胞质内，则其β-内酰胺酶活性会切割BlaM底物中的β-内酰胺环，使FRET配对分离，激发后产生蓝色荧光发射。该转位检测方法已被广泛验证，可用于鉴定多种不同胞内和胞外细菌的效应蛋白，包括C. burnetii、L. pneumophila、L. longbeachae、Chlamydia trachomatis、肠致病性E. coli、Salmonella和Brucella17,30-35。
为了确定特定宿主因子在Coxiella效应蛋白转运中的作用，我们采用了一种成熟的基因沉默方法——RNA干扰，特别是小干扰RNA（siRNA）。RNA干扰最初在Caenorhabditis elegans中被发现，是一种保守的内源性细胞过程，可用于抵御病毒的天然防御机制以及基因表达调控36,37。当序列特异性的siRNA结合后，通过RISC（RNA诱导的沉默复合体）介导mRNA降解，从而实现特定基因的沉默或表达下调38。在本研究中，使用siRNA靶向两种重要的内吞途径调控蛋白Rab5A和Rab7A。通过C. burnetii pBlaM-CBU0077检测Rab5A和Rab7A沉默对效应蛋白转运的影响。选择CBU0077是因为先前研究已证实其可由Coxiella的Dot/Icm分泌系统转运17。
通过结合使用siRNA基因沉默技术和本文所述的基于荧光的转位检测方法，我们正逐步明确宿主因子在Coxiella效应蛋白转位过程中的作用。该方法可广泛应用于具有类似分泌系统、负责效应蛋白转位的多种胞内和胞外细菌。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>Sigma</td><td>C0759</td><td>ACCM-2 培养基组分</td></tr><tr><td>柠檬酸钠</td><td>Sigma</td><td>S4641</td><td>ACCM-2 培养基组分</td></tr><tr><td>磷酸钾</td><td>Sigma</td><td>60218</td><td>ACCM-2 培养基组分</td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Calbiochem</td><td>442611</td><td>ACCM-2 培养基组分</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td>ACCM-2 培养基组分</td></tr><tr><td>硫酸亚铁</td><td>Fisher</td><td>S93248</td><td>ACCM-2 培养基组分</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>ACCM-2 培养基组分</td></tr><tr><td>L-半胱氨酸</td><td>Sigma</td><td>C6852</td><td>ACCM-2 培养基组分</td></tr><tr><td>Bacto-新蛋白胨</td><td>BD</td><td>211681</td><td>ACCM-2 培养基组分</td></tr><tr><td>酪蛋白氨基酸</td><td>Fisher</td><td>BP1424</td><td>ACCM-2 培养基组分</td></tr><tr><td>甲基-β-环糊精</td><td>Sigma</td><td>C4555</td><td>ACCM-2 培养基组分</td></tr><tr><td>RPMI + Glutamax</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870-036</td><td>ACCM-2 培养基组分</td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>Sigma</td><td>C0378</td><td>用于细菌培养</td></tr><tr><td>ON-TARGETplus 非靶向对照池 (OTP)</td><td>Dharmacon</td><td>D-001810-10-05</td><td>非靶向对照</td></tr><tr><td>siGENOME 人 PLK1 (5347) siRNA - SMARTpool</td><td>Dharmacon</td><td>M-003290-01-005</td><td>引起细胞死亡；用于检测转染效率</td></tr><tr><td>siGENOME 人 RAB5A (5968) siRNA - SMARTpool</td><td>Dharmacon</td><td>M-004009-00-0005</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME 人 RAB7A (7879) siRNA - SMARTpool</td><td>Dharmacon</td><td>M-010388-00-0005</td><td></td></tr><tr><td>5x siRNA 缓冲液</td><td>Dharmacon</td><td>B-002000-UB-100</td><td>使用无菌无 RNase 的水将 5x siRNA 缓冲液稀释为 1x siRNA 缓冲液</td></tr><tr><td>DharmaFECT-1 转染试剂</td><td>Dharmacon</td><td>T-2001-01</td><td>用于转染</td></tr><tr><td>Opti-MEM + GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51985-034</td><td>低血清培养基，用于转染</td></tr><tr><td>DMEM + GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10567-014</td><td>用于细胞培养和感染</td></tr><tr><td>热灭活胎牛血清 (FCS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30071.03</td><td>可使用其他等效产品</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>用于储存贝氏柯克斯体菌株</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶 + EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-054</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td>用于 qPCR 样品和标准品的稀释</td></tr><tr><td>Quick-gDNA Mini Prep</td><td>ZYMO Research</td><td>D3007</td><td>可使用其他等效产品提取基因组 DNA</td></tr><tr><td>SensiFAST SYBR No-ROX Kit</td><td>Bioline</td><td>BIO-98020</td><td>可使用其他等效的 qPCR 预混液产品进行 qPCR 反应</td></tr><tr><td>LiveBLAzer FRET-B/G 加载试剂盒（含 CCF2-AM）</td><td>Invitrogen</td><td>K1032</td><td>用于通过荧光检测易位并制备 6X 加载溶液（包含溶液 A、B、C 和 DMSO）</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Merck</td><td>106469</td><td>丙磺舒溶液组分</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Sigma</td><td>71505</td><td>丙磺舒溶液组分</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Merck</td><td>106586</td><td>丙磺舒溶液组分</td></tr><tr><td>丙磺舒</td><td>Sigma</td><td>P8761</td><td>丙磺舒溶液组分</td></tr><tr><td>DRAQ5 荧光探针溶液 (5 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62251</td><td>细胞核染色剂，用于检测细胞活力。使用时以 PBS 按 1:4000 稀释。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>含 4% PFA（多聚甲醛）的 PBS 溶液</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>用于 HeLa 229 细胞的固定</td></tr><tr><td>25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 带透气盖的组织培养瓶</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>用于细菌菌株的培养</td></tr><tr><td>96 孔平底透明黑色聚苯乙烯 TC 处理微孔板，单独包装，带盖，无菌</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 带透气盖的组织培养瓶</td><td>Corning</td><td>430641</td><td>用于 HeLa 229 细胞的培养</td></tr><tr><td>175 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 带透气盖的组织培养瓶</td><td>Corning</td><td>431080</td><td>用于 HeLa 229 细胞的培养</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td></td><td></td><td>用于 HeLa 229 细胞的定量</td></tr><tr><td>Tear-A-Way 96 孔 PCR 板</td><td>4titude</td><td>4ti-0750/TA</td><td>用于 qPCR 反应</td></tr><tr><td>8 孔平盖链</td><td>Sarstedt</td><td>65.989.002</td><td>用于 qPCR 反应</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>台式微量离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>台式涡旋振荡器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>旋转混合器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td>用于收集细菌培养物</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td></td><td></td><td>用于基因组 DNA 定量</td></tr><tr><td>Mx3005P qPCR 仪</td><td>Aligent Technologies</td><td>401456</td><td>用于定量 7 天培养物中的贝氏柯克斯体基因组</td></tr><tr><td>ClarioSTAR 微孔板读数仪</td><td>BMG LabTech</td><td></td><td>用于荧光检测</td></tr></tbody></table>

应用荧光共振能量转移（fret）技术检测sirna沉默期间coxiella burnetii效应蛋白转位效率

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii 是 Q 热的致病原，是一种依赖 IV 型 Dot/Icm 分泌系统建立复制生态位的胞内病原体。大量效应蛋白通过该系统被转运至宿主细胞内，以操控宿主的生物学过程，并形成一种独特的、来源于溶酶体的复制性液泡。本文所介绍的方法结合了两种成熟的技术：利用 siRNA 进行特异性基因沉默，以及利用基于 β-内酰胺酶活性的 FRET 底物来检测效应蛋白的转位。通过整合这两种方法，我们可以初步理解宿主因子在细菌分泌系统功能及效应蛋白转位过程中的作用。在本研究中，我们探讨了 Rab5A 和 Rab7A 的作用，这两种蛋白均为内吞运输通路的重要调控因子。我们证明，沉默任一蛋白的表达均会导致效应蛋白转位效率下降。这些方法可轻松改造，用于研究其他同样利用分泌系统的胞内和胞外病原体。由此，有望揭示参与细菌效应蛋白转位的宿主因子的全局图景。

本研究选用 C. burnetii pBlaM-CBU0077 菌株，因为已有研究表明 CBU0077 是 Coxiella Dot/Icm 分泌系统的一种被转位的效应蛋白17。感染前，使用 qPCR 对培养 7 天的 C. burnetii pBlaM-CBU0077 菌液中的基因组总数（基因组数/ml）进行计数。 图4 展示了 qPCR 后标准品和样本中预期得到的循环阈值（Ct）值示例。Ct 值（在扩增曲线图中以图形表示（图4B）和数值形式列出（图4C））被导出并按 4.3.3 节所述进行分析。根据所示的代表性数据，10 ml 重悬细菌培养物中含有 2.31 × 108 个基因组/ml（图4D）。为制备适当的细菌稀释液（2 ml 中含 1.88 × 108 个基因组/ml），将 1....

研究细菌病原体与其宿主之间的相互作用是生物学研究的重要领域。本文介绍了利用BlaM底物在siRNA基因沉默过程中检测贝氏柯克斯体（Coxiella burnetii）效应蛋白转位所需的关键技术。

应用荧光共振能量转移（FRET）技术检测siRNA沉默期间Coxiella burnetii效应蛋白转位效率

贝氏柯克斯体（Coxiella burnetii）是Q热的致病原，是一种依赖IV型Dot/Icm分泌系统在宿主细胞内建立感染的胞内病原体。

本实验方案的总体目标是研究特定宿主过程对细菌病原体转运效应蛋白能力的影响。该方法有助于解答细胞微生物学领域中的关键问题，特别是宿主在阻断或促进细菌毒力效应蛋白递送至宿主细胞过程中所发挥的作用。该技术的主要优势在于结合了两种成熟的方法，即siRNA基因沉默和报告基因检测，用于测量细菌蛋白的转位，以研究病原体与真核细胞之间的相互作用。该方法有助于深入了解柯克斯体的致病机制，也可用于研究依赖高效蛋白质转位的其他细菌与宿主之间的病原相互作用，例如沙眼衣原体、沙门氏菌以及附着侵袭性大肠杆菌。在表达CBU0077的贝氏柯克斯体培养后，按照文本方案，在带有通气盖的25平方厘米培养瓶中将β-内酰胺酶进行融合。取20微升菌液接种于10毫升预热的含3微克/毫升氯霉素的ACCM2培养基中。将培养物置于37摄氏度、5%二氧化碳和2.5%氧气条件下培养7天。使用siRNA对海拉细胞进行反向转染，在按照文本方案配制siRNA后，将含10%FCS的DMEM、0.5%胰蛋白酶EDTA以及PBS置于37摄氏度水浴中预热30分钟，以备使用。每次实验性 siRNA 转染时，在单独的微量离心管中加入 0.4 µL 转染试剂和 63.6 µL 低血清培养基。将所有微量离心管涡旋混匀，并在室温下孵育 5 分钟，使组分形成复合物。向含有转染复合物的相应微量离心管中加入 16 µL 的每种实验性 siRNA。然后涡旋混匀，并在室温下孵育20分钟。在20分钟孵育期间，向无菌黑色、平底、透明底的96孔板的相应孔中加入20微升转染试剂、减血清培养基和siRNA混合物。同时，在20分钟孵育期间，用10毫升预热的PBS洗涤一个75平方厘米培养瓶中汇合或亚汇合的HeLa细胞单层。向培养瓶中加入1毫升0.5%胰蛋白酶EDTA溶液，于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育3至5分钟，以解离细胞。用9毫升预热的含10%FCS的DMEM收集细胞。使用血细胞计数板对细胞进行计数。然后用含10%胎牛血清的DMEM培养基将细胞调整至终浓度为每毫升4.9 × 10⁴个细胞。20分钟孵育结束后，立即用移液器将80 µL细胞悬液加入含有siRNA转染混合物的96孔板的每个孔中，使每孔细胞密度达到3.92 × 10³个细胞。这是该实验步骤中最关键的一步。在孵育20分钟后，必须立即将HeLa细胞加入siRNA转染混合物中，否则转染效率可能会受到影响。确保空白孔中仅含有80 µL DMEM和10% FCS。将培养板孵育24小时。然后，使用连接至真空源的多通道适配器和移液器，将培养基更换为100微升新鲜DMEM，其中添加10% FCS。继续孵育细胞48小时。在 ACCM2 培养七天后，于室温下以 15,000 × g 离心 10 毫升 C.burnetii P BlaM CBU0077 培养物 15 分钟。弃去上清液后，加入 10 毫升预热的 DM

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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