分离绿色荧光蛋白系统可视化细菌在感染过程中传递的效应
May 24th, 2018
以荧光蛋白为基础的方法来监测细菌分泌到宿主细胞中的效应, 这是很有挑战性的。这是由于荧光蛋白与 III. 型分泌系统之间的不相容。在这里, 一个优化的分裂 superfolder GFP 系统是用来可视化的效应, 细菌分泌的宿主植物细胞。
这种方法可以帮助回答植物-微生物相互作用领域的关键问题，例如病原菌如何通过使用分泌到植物细胞中的称为效应子的蛋白质来扰乱其宿主植物细胞的最佳状态。该技术的主要优点是细菌效应蛋白使用其天然表达系统在细菌细胞中表达，然后通过细菌 III 型分泌系统递送到植物细胞。要开始此过程，请按照文本方案中的概述准备 Nicotiana benthamiana 和 Arabidopsis thaliana 植物。
接下来，使用标准电穿孔将与 sfGFP11 标签融合的质粒携带和效应基因转化为丁香假单胞菌 pathovar 番茄CUCPB5500菌株。最佳时间点和表达水平，或重组 sfGFP，实际上取决于您的效应蛋白。我们建议优化接种或观察条件。
将转化的细菌细胞轻轻铺在 King's B 琼脂板的表面。然后将板在 28 摄氏度下孵育两天。之后，将一个细菌菌落接种到含有适合该载体的抗生素的 King's B 液体培养基中。
在 28 摄氏度下孵育过夜，并以 200 rpm 的速度摇动。第二天，将高压灭菌的甘油添加到接种的培养基中，至终浓度为 50%储存在负 80 摄氏度。首先，将质粒转化到根癌农杆菌菌株GV3101细胞中，如文本方案中所述。
在 28 摄氏度下在补充的 LB 琼脂培养基上培养细胞两天。使用来自 LB 琼脂培养基的单个菌落，接种 5 mL 补充的液体 LB 培养基。然后，在 28 摄氏度下以 200 rpm 振荡使细胞生长过夜。
之后，以 3000 G 离心 10 分钟以收获细胞。倒出上清液，将沉淀重新悬浮在 1 毫升新鲜制备的浸润缓冲液中。使用分光光度计，通过测量 600 纳米吸光度下的光密度值来确定农杆菌细胞的数量。
然后，使用浸润缓冲液将细菌细胞的 OD 600 调节至 0.5。将培养物放在室温下轻轻摇杆上 1 到 5 小时。要渗透叶子，请使用 10 微升移液器吸头在每片叶子的中心戳一个孔。
使用 1 毫升无针注射器小心地将 500 微升农杆菌悬浮液注射到叶子的近轴侧。擦去叶子上残留的细菌悬浮液，并标记浸润区域的边界。将浸润的植物放在 25 摄氏度和 60% 湿度的生长室中两天。
用适当的抗生素将甘油原液中转化的假单胞菌菌株划线到 King's B 琼脂培养基上。在 28 摄氏度下孵育两天。在甘露醇谷氨酸液体培养基中接种假单胞菌细胞环。
将培养物在 28 摄氏度下孵育过夜，并以 200 rpm 的速度振荡。之后，以 3000 G 离心 10 分钟以收获细胞。倒出上清液，将沉淀物重新悬浮在 10 毫摩尔氯化镁溶液中。
然后，将本氏烟草叶的光密度调整为 0.02，将拟南芥叶的光密度调整为 0.002。对于 Nicotiana benthamiana 叶子，将假单胞菌悬浮液浸润到与两天前浸润农杆菌相同的区域。对于转基因拟南芥，将假单胞菌悬浮液浸润到两个 4 周龄的短日生叶中。
最后，为接种假单胞菌的叶子切出一个叶盘。在假单胞菌浸润后的特定时间点，使用共聚焦激光扫描系统对来自单个植物的两个 2 平方厘米的叶盘进行成像。远离浸润孔观察细胞，以避免死细胞被伤害杀死。
来自细菌的易位效应子仅以非常少量存在。因此，您可以增加激光功率并获得荧光发射来检测荧光信号。但是，不要过度使用，以避免从植物细胞的自发荧光中捕获错误信号。
在这项研究中，使用基于荧光蛋白的方法监测细菌分泌到宿主细胞中的效应子。此处显示了感染 3 小时后本氏烟草叶的共聚焦激光扫描。仅使用 AvrB 表达优化 sfGFP 的细胞不显示任何荧光信号。
然而，从含有 AvrB 、 sfGFP11 的感染细胞中可以看到 GFP 信号。这验证了 AvrB sfGFP11 复合物在胞质溶胶中与优化的 sfGFP 重组，然后易位到质膜。在尝试此程序时，重要的是要记住保持植物材料的健康并为活性细胞准备新鲜的细菌培养物。
按照此程序，可以预先使用其他方法（如树脂血液分析）来了解植物免疫反应期间植物细胞中细菌效应蛋白的假翻译修饰。观看此视频后，您应该对如何在受感染的植物细胞中可视化 III 型效应子递送有很好的了解。植物材料和细菌培养物应按照实验室的生物危害性废物标准进行处理，不要忘记佩戴个人防护装备。
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概述
本研究介绍了一种优化的分裂超文件GFP系统，用于可视化被分泌到宿主植物细胞中的细菌效应蛋白。该方法解决了与荧光蛋白兼容性和III型分泌系统相关的挑战。
研究的关键组成部分
科学领域
- 植物-微生物相互作用
- 致病菌
- 荧光蛋白可视化
背景
- 致病菌分泌效应蛋白以操纵宿主植物细胞。
- 传统的荧光蛋白方法面临兼容性问题。
- III型分泌系统对效应蛋白传递至关重要。
- 优化可视化技术对研究至关重要。
研究目的
- 开发一种可靠的方法来可视化植物细胞中的细菌效应蛋白。
- 增进对植物-微生物相互作用的理解。
- 为该领域的研究人员提供一种协议。
使用的方法
- 准备烟草和拟南芥植物。
- 电穿孔转化携带效应基因的质粒。
- 使用sfGFP11标签来可视化效应蛋白。
- 根据效应蛋白优化接种和观察条件。
主要结果
- 成功可视化了宿主细胞中的细菌效应蛋白。
- 展示了分裂超文件GFP系统的兼容性。
- 提供了关于最佳结果的时间和表达水平的见解。
- 为植物-微生物相互作用的未来研究建立了协议。
结论
- 优化的分裂超文件GFP系统对研究效应蛋白有效。
- 该方法可以推进植物-病原体相互作用研究。
- 进一步优化可能会提高可视化结果。
常见问题
Executive Industry Relevance
Visualizing effector protein delivery from bacterial pathogens into host cells is critical for understanding virulence mechanisms and identifying therapeutic targets in plant-microbe interactions. The split sfGFP system enables direct observation of translocated effectors via the native type III secretion system, overcoming fluorescent protein compatibility barriers. This approach supports target validation by confirming subcellular localization and dynamics of pathogen-derived proteins in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing effector translocation and host compartmentalization in real time.
- Operational Value: Uses native bacterial expression and secretion systems to preserve effector functionality and avoid artifacts from heterologous expression.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts at specific organelles, supporting assay standardization for effector localization studies.
- Operational Value: Compatible with confocal imaging platforms, allowing scalable screening of effector variants or mutants across plant models.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system insights into effector targeting of plasma membrane and cytosol, informing mechanistic de-risking of virulence factors.
- Operational Value: Establishes a reproducible workflow from bacterial culture to plant infection and imaging, enabling cross-functional collaboration between microbiology and plant biology teams.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where effector delivery and host targeting must be confirmed prior to lead identification or mechanistic screening campaigns.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of effector function by linking secretion to subcellular localization in live plant cells.
- Screening: Enables assay readiness through standardized reconstitution of split GFP upon effector delivery, providing a binary readout of translocation success.
- Analytics: Generates spatially resolved fluorescence signals that allow comparison of effector variants or mutants in planta.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by validating effector activity in a native host context, supporting biomarker-aligned pathway analysis.
- Enterprise Reuse: Platform can be adapted to other effector-organelle pairs by swapping sfGFP11-effector and organelle-targeted sfGFP1-10OPT constructs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in effector functionality by confirming delivery and localization without reliance on surrogate systems.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized bacterial preparation, infiltration, and imaging conditions across laboratories.
- Strategic Value: Reduces biological risk in target selection by validating effector behavior in a native infection model.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of effector-targeted strategies by confirming subcellular activity in planta.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial genetics, plant infiltration, and confocal microscopy.
- Dependent on fluorescence detection instrumentation and spectral separation capabilities to distinguish signal from plant autofluorescence.
- Necessitates cross-team standardization of bacterial culture conditions, OD adjustment, and infiltration timing for reproducible results.
- Must account for variation in effector expression, stability, and secretion efficiency across different pathogen strains and host species.
- Limited by low effector translocation levels, requiring optimization of laser power and gain to avoid false signals while maintaining sensitivity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:49
Preparation of Plant Materials and Pseudomonas Culture
2:09
Transient Expression of Organelle-targeted sfGFP1-10OPT in N. benthamiana
3:58
Inoculation of Pseudomonas and Observation of sfGFP Signal via Confocal Microscopy
5:46
Results: Split Superfolder Fluorescent Protein System: A Useful Tool to Examine the Dynamics of Effectors in Host Plants
6:32
Conclusion
