利用分裂型绿色荧光蛋白系统可视化细菌感染过程中递送的效应蛋白

该方法有助于回答植物-微生物互作领域中的关键问题，例如致病菌如何通过向植物细胞分泌称为效应子的蛋白质来破坏其宿主植物细胞的最适状态。该技术的主要优势在于，细菌效应子蛋白在细菌细胞内利用其天然表达系统进行表达，并通过细菌的III型分泌系统递送至植物细胞。开始此实验前，请按照文本方案中所述准备本氏烟草（Nicotiana benthamiana）和拟南芥（Arabidopsis thaliana）植株。

接下来，使用标准的电穿孔法将携带效应子基因并融合了sfGFP11标签的质粒转化至丁香假单胞菌番茄致病变种CUCPB5500菌株中。最佳观察时间点和表达水平，或sfGFP的重组情况，实际上取决于您所研究的效应子蛋白。我们建议优化接种或观察条件。

将转化后的细菌细胞轻轻涂布于King's B琼脂平板表面，然后在28°C条件下培养两天。之后，挑取一个细菌菌落接种至含有适用于该载体的抗生素的King's B液体培养基中。

在28摄氏度、200 rpm振荡条件下过夜培养。次日，向接种后的培养基中加入经高压灭菌的甘油，使其终浓度为50%，于-80摄氏度保存。首先，按照文本方案所述，将质粒转化至农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株GV3101细胞中。

在补充的LB琼脂培养基中，于28摄氏度培养细胞两天。从LB琼脂培养基中挑取单菌落，接种于5毫升补充的液体LB培养基中，然后在28摄氏度、200 rpm振荡条件下过夜培养细胞。

此后，在 3000 G 条件下离心 10 分钟以收集细胞。倒出上清液，并将沉淀重悬于 1 毫升新鲜配制的浸润缓冲液中。使用分光光度计，通过测量 600 纳米波长处的吸光度值来确定农杆菌细胞的数量。

然后，使用浸润缓冲液将细菌细胞的 OD 600 调整至 0.5。将菌液在室温下置于轻柔摇床上孵育 1 至 5 小时。进行叶片浸润时，用 10 微升移液器枪头在每片叶片的中心刺一个小孔。

使用无针头的1毫升注射器，小心地将500微升农杆菌悬浮液注入叶片的近轴面。用擦拭法去除叶片上残留的菌液，并标记出浸润区域的边界。将浸润后的植株置于25摄氏度、60%湿度的培养室中培养两天。

将转化后的假单胞菌菌株从甘油保存液中划线接种至含有适当抗生素的King's B琼脂培养基上。在28摄氏度下培养两天。用接种环挑取假单胞菌细胞接种于甘露醇谷氨酸液体培养基中。

将培养物在28摄氏度下振荡培养过夜，转速为200 rpm。随后在3000 ×g 条件下离心10分钟以收集细胞。弃去上清液，并将沉淀重悬于10毫摩尔的氯化镁溶液中。

然后，将烟草（Nicotiana benthamiana）叶片的光密度调整至0.02，将拟南芥（Arabidopsis）叶片的光密度调整至0.002。对于烟草叶片，将假单胞菌悬浮液注入与两天前农杆菌注射相同的区域。对于转基因拟南芥，将假单胞菌悬浮液注入两片四星期大、在短日照条件下生长的叶片中。

最后，从接种了假单胞菌的叶片上切取叶盘。在假单胞菌侵染后的特定时间点，使用共聚焦激光扫描系统对来自同一植株的两个、面积各为两平方厘米的叶盘进行成像。观察时应选择远离侵染孔洞的细胞，以避免受到伤口导致死亡的细胞干扰。

细菌转位的效应分子仅以极微量存在。因此，可适当提高激光功率并增强荧光发射，以检测荧光信号。但切勿过度增强，以免接收到植物细胞自发荧光产生的假信号。

本研究采用基于荧光蛋白的方法，用于监测细菌分泌至宿主细胞内的效应因子。图中显示的是感染后三小时的本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片的共聚焦激光扫描图像。仅表达优化型 sfGFP 与 AvrB 的细胞未显示出任何荧光信号。

然而，在含有 AvrB 和 sfGFP11 的感染细胞中可以观察到 GFP 信号。这证实了 AvrB-sfGFP11 复合物在细胞质中与优化的 sfGFP 重新构建，并随后转位至质膜。在进行该实验操作时，需注意保持植物材料的健康状态，并制备新鲜的细菌培养物以获得活性细胞。

在完成该实验步骤后，可进一步采用其他方法（如树脂血液分析），以研究植物免疫反应过程中细菌效应蛋白在植物细胞内的错误翻译修饰。观看本视频后，您应能够充分掌握如何对感染植物细胞中的III型效应蛋白递送过程进行可视化观察。植物材料和细菌培养物应按照实验室关于生物危害废弃物的处理标准进行处置，切勿忘记穿戴个人防护装备（PPE）。