Name: TRAP-RC，翻译核糖体亲和纯化的稀有细胞群果蝇胚胎 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: 学习TRAP-RC技术，用于从果蝇胚胎的稀有细胞群中分离翻译中的mRNA。该方法通过GFP标记核糖体亚基实现细胞类型特异性捕获，无需细胞解离即可快速鉴定少量细胞中的翻译RNA，适用于发育生物学研究。

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作者感谢Nicolas Allegre、Maud Peyny和Jean-Philippe Da Ponte提供的出色技术协助。本工作得到法国国家科研署（ANR-JC-CARDIAC-SPE）、法国国家健康与医学研究院（INSERM）启动基金、ANR ID-CELL-SPE基金、FRM团队基金以及AFM 15845基金的资助。

1. 果蝇品系构建&#160;
<ol>
	<li>构建两种不同的表达载体。在第一种载体中，将RpL10A cDNA（核糖体蛋白亚基L10a）克隆至pUASP-PL-GFP-Nter质粒（来自文献32的改良版本）中GFP的下游。使用生殖系启动子可使转基因品系具有更广泛的适用性。 
	注意：通过将驱动slouch基因组织特异性表达的调控序列克隆至pPTGAL4质粒中GAL4（转录因子）的上游，获得第二种载体。</li>
	<li>将质粒分别注射到w1118果蝇中，并通过P因子插入法将构建物整合到果蝇基因组中（按照标准操作流程）33。</li>
	<li>筛选转化子，以获得两种构建物分别位于不同染色体上的果蝇品系。通过遗传杂交将这两个品系合并，从而获得一个双转基因的稳定品系，即最终的TRAP品系。F0代：w-; Cyo, UAS EGFP::RpL10A; MKRS/TM6B × w-; Cyo/Scu; Slouch Gal4/TM6B。F1代：w-; Cyo, UAS EGFP::RpL10A; Slouch Gal4/TM6B。大规模扩增该品系，并收集所需发育阶段的胚胎。</li>
</ol>
2. 胚胎收集
<ol>
	<li>准备8个大型圆柱形种群培养笼，每个笼中放入约40克年轻果蝇（约180,000只果蝇/笼）。</li>
	<li>进行所谓的预产卵处理，以使果蝇排出输卵管中正在发育的胚胎。具体操作为：将果蝇置于两个直径11 cm的培养皿中，每个培养皿内含有凝固的琼脂与葡萄汁混合物，让果蝇产卵1小时，并用盖子盖好 &#8531; 用新鲜制备的酵母糊涂抹表面。在更换三次葡萄汁培养基平板后，将真正的胚胎收集到类似的、新鲜制备的平板上。 
	注意：孵育时间将根据所研究的发育时间窗口而变化。</li>
	<li>从笼中取出培养板，置于相同温度下，孵育至达到所需正确发育阶段所需的时间例如，产卵3小时后额外继续孵育10小时，可获得产卵后10-13小时（AEL）的胚胎。用50 ml水加入毛刷搅拌，重悬平板中的内容物（包括胚胎、酵母糊和死亡的果蝇）。</li>
	<li>通过一系列筛子（700 &#181;米，355 &#181;米，112 &#181;m) 使用筛网分离胚胎与死亡的果蝇及残留组织，收集滞留在孔径较小筛网上的胚胎，随后用去离子水短暂冲洗。每次收集所用培养皿不得超过18个，以免堵塞筛网。</li>
	<li>用去离子水配制的4.5%次氯酸钠溶液脱绒毛膜胚胎，处理2分钟，随后用去离子水彻底冲洗30–60秒。将胚胎置于含0.01%吐温20的PBS缓冲液中孵育，100 &#181;g/ml 环己酰亚胺，室温下振荡处理 5–10 分钟。</li>
	<li>将胚胎置于纤维素吸水纸上干燥，然后转移至微量离心管中。称量离心管，通过浸入液氮中快速冷冻胚胎。在此阶段，干燥的胚胎可在−80℃保存数月 &#176;C.</li>
</ol>
3. 准备受体抗体偶联的磁珠
<ol>
	<li>通过轻轻振荡，将蛋白G磁珠在原瓶中充分重悬。</li>
	<li>将90 µl磁珠转移至无RNase的离心管中，并置于磁力架上收集磁珠（30–60秒）。进行免疫沉淀（IP）时，每1 ml含60–80 mg/mL蛋白的裂解液需使用90 µl磁珠。请遵循比例以避免磁珠饱和。根据蛋白量使用多个离心管。</li>
	<li>用500 µl含0.01% Tween 20的1× PBS缓冲液洗涤磁珠，置于磁力架上收集磁珠并弃去上清液。向磁珠中加入30 µg GFP抗体溶于350 µl含0.01% Tween 20的PBS缓冲液中，室温下缓慢翻转混匀孵育30分钟。</li>
	<li>将磁珠置于磁力架上收集（30–60秒），弃去上清液，用500 µl多聚核糖体提取缓冲液（Hepes 10 mM, KCl 150 mM, MgCl2 5 mM, DTT 0.5 mM, Triton 1%, Cycloheximide 100 µg/ml, 蛋白酶抑制剂1×, RNase抑制剂100 U）冲洗磁珠。</li>
	<li>将磁珠置于磁力架上收集，加入500 µl封闭缓冲液（BSA 0.1 µg/µl, 酵母tRNA 0.1 µg/µl, 糖原0.1 µg/µl，溶于多聚核糖体提取缓冲液中）。</li>
	<li>室温孵育30分钟，并用新鲜封闭缓冲液重复此步骤一次。</li>
	<li>将磁珠置于磁力架上收集，用500 µl多聚核糖体提取缓冲液冲洗，再次收集磁珠后立即进入免疫纯化步骤（第6节）。</li>
</ol>
4. 裂解液制备
<ol>
	<li>开始前，设置多方向高速珠磨机的程序：2&#215;5,000 rpm 离心 10 秒，暂停 15 秒。将干燥的胚胎（1.5 g）转移至预冷的含有多聚核糖体提取缓冲液的 15 ml 离心管中，立即进行匀浆。在 4 ml 多聚核糖体提取缓冲液中匀浆 1.5 g 胚胎。</li>
	<li>将匀浆后的胚胎分装至两个预冷的2 mL离心管中，运行匀浆程序研磨胚胎。将裂解物转移至冰上预冷的新的微量离心管中，于4 ℃离心，制备去核上清液。 &#176;C，2,000 转/分钟，离心 10 分钟 g.</li>
	<li>将上清液转移至预冷的离心管中，置于冰上，向上清液中加入终浓度为0.1%的10% Nonidet P-40（添加量为样品体积的1/100），轻轻翻转混匀。</li>
	<li>用微量离心机短时离心样品，使液体聚集于管底，加入1/9体积的300 mM 1,2-二庚酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DHPC）（终浓度为30 mM），通过轻柔颠倒管子混匀，冰上孵育5分钟（孵育期间颠倒混匀数次）。</li>
	<li>通过在 4 ℃ 下离心制备线粒体后上清液 &#176;C，10 分钟，20,000 g采用Bradford法测定蛋白浓度：裂解液中的蛋白浓度应在60–80 mg/ml之间。将上清液转移至预冷的干净微量离心管中，并立即进行预吸附步骤（第5节）。</li>
</ol>
5. 预吸附
<ol>
	<li>轻轻振荡充分重悬磁珠，并在室温下将30 µl磁珠转移至微量离心管中（每1 ml胚胎裂解液使用30 µl磁珠）。</li>
	<li>将磁珠置于磁力架上收集，吸弃上清液，然后用多聚核糖体提取缓冲液（500 µl）重悬磁珠。再次将磁珠置于磁力架上收集，加入胚胎裂解液，并在4 °C下旋转孵育1小时。
	<ol>
		<li>将磁珠去除后，将上清液置于冰上，用于后续免疫纯化步骤。在进行免疫纯化前，保留100 µl上清液（输入样品），以便通过RT-qPCR等方法，与免疫纯化后获得的RNA样品进行全局RNA比较。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 免疫纯化
<ol>
	<li>将1 ml预吸附裂解液（对应蛋白浓度为60–80 mg/ml）加入含有90 µl与GFP抗体偶联的封闭磁珠的无RNase离心管中。在4 °C下，使用管式旋转仪轻柔翻转混合孵育2小时；或者，可在4 °C下过夜孵育。</li>
	<li>孵育结束后，将磁珠置于磁力架上收集。使用微型离心机离心沉淀磁珠，然后用500 µl洗涤缓冲液（含Hepes 10 mM、KCl 350 mM、MgCl2 5 mM、Nonidet P-40 1%、DTT 0.5 mM、环己酰亚胺100 µg/ml、RNase抑制剂100 U）重悬磁珠，并再次置于磁力架上收集。重复此步骤两次。</li>
	<li>将磁珠转移至新的预冷无RNase离心管中，洗涤两次。磁珠在磁力架上收集后，直接加入1 ml TRiZol进行RNA提取，并按照试剂盒说明书操作。</li>
</ol>
7. RNA 的纯化与质量评估
<ol>
	<li>按照试剂盒生产商的说明使用RNeasy Micro试剂盒。操作完成后，用(x) µl无RNase的水洗脱RNA。在60 °C下孵育2分钟，将速冻样品储存于-80 °C。使用生物分析仪检测RNA质量（遵循生产商的说明）。</li>
	<li>为检测TRAP富集RNA的特异性，取3 ng纯化的RNA（input和IP样品）按照生产商的说明（Superscript III）进行逆转录。将获得的cDNA用于qPCR，使用基因特异性的引物组。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种改良的核糖体亲和纯化技术（称为“TRAP-rc”），专用于研究稀有细胞群体 黑腹果蝇 胚胎。提供了成功分离特定RNA的关键步骤信息，所获得的RNA产量适用于微阵列或RNA测序分析。 即1）胚胎裂解和多聚核糖体提取所需的生物材料数量及优化步骤；2）用于最佳免疫沉淀的磁珠/抗体与裂解液的比例；3）降低背景信号的步骤，包括洗涤缓冲液的组成，以实现高特异性和高灵敏度的TRAP-rc实验。
该方案可产生可重复的数据，因而可轻松应用于其他任何细胞类型。该技术能够分析活跃翻译的 mRNA 水平上的差异基因表达，从而为理解特定时间窗口内特定细胞类型的蛋白质表达奠定基础。但需注意，蛋白质丰度取决于翻译和降解过程的速率。TRAP 方法的一个主要局限性在于其无法以准确的定量方式测量蛋白质含量，也无法检测翻译后修饰。通过测量 mRNA 序列上的核糖体密度，并以细胞类型特异性的方式进行定量优化，可使 TRAP 与核糖体足迹分析相结合成为一种非常强大的工具。在最近的一项研究34中，该组合方法已在人胚胎肾 293 细胞中实现。作者首先进行核酸酶足迹分析，随后使用链霉亲和素磁珠对可诱导的生物素化 RpL10A 蛋白进行亲和纯化。这证明了在整体生物体中针对特定细胞类型开展核糖体足迹分析在原理上是可行的，但其局限性在于所需生物材料的量较大。
并行开展TRAP实验与全局转录组分析，将能够追踪新转录RNA与正在活跃翻译的RNA之间的比例关系。这将深入揭示特定发育背景下或特定细胞群体中可能存在的转录后调控机制——例如由microRNA介导的调控机制。
总之，TRAP 是一种高效、特异且灵敏的方法，可用于以细胞类型特异性的方式鉴定与正在活跃翻译的核糖体结合的 RNA。该方法可广泛应用于多种生物体和组织类型。本文所述的新型 TRAP-rc 方案针对稀有细胞群体（占总细胞数不到 1%）进行了优化，并可获得足量终产物，适用于后续全基因组水平的分析。
该方法的一个可能局限性在于，需要一个强驱动元件以在目标细胞类型中产生足量的标记核糖体，从而与内源的未标记核糖体竞争。在最近的一项研究25中，作者估计标记核糖体与未标记核糖体的比例为10%至30%。
为解决这一问题，增加UAS-RpL10A-EGFP的拷贝数将显著改善这种平衡。或者，在所述遗传背景下引入一个UAS-GAL4转基因，可增强GAL4蛋白的表达，从而间接提高RpL10A-EGFP的表达水平，这将有利于标记核糖体在mRNA上的更充分占据。
需要注意的是，通过采用互补的方法，可以进一步增强这一本已高效的技术，使其更具量化特征，或用于发现和阐明基因表达调控所必需的分子机制。

了解细胞在发育过程中如何获得特定特性，对于理解器官的复杂性及其向病理状态演化的潜在机制至关重要。目前，科研领域正大力推动解析基因调控网络的研究，旨在揭示全局基因表达谱、RNA聚合酶II结合状态、转录因子在调控序列上的占据情况以及组蛋白的翻译后修饰等关键过程。
为了在全基因组水平上评估基因表达，通常采用微阵列（microarrays）和RNA测序（RNA-seq）技术。微阵列可用于检测mRNA的丰度，而RNA-seq则更适用于分析各类RNA，包括编码RNA以及非编码RNA，如微小RNA（microRNAs）、长链非编码RNA（lncRNAs）和小核RNA（snRNAs）。然而，这些技术均无法区分处于活跃转录状态的mRNA、稳态mRNA、正在活跃翻译的mRNA以及进入降解过程的mRNA。已知稳态mRNA水平的测量结果并不能准确反映蛋白质组的组成1-3。相反，鉴定正在活跃翻译的mRNA能够更准确地反映蛋白质的合成情况。
然而，转录组学研究主要是在全 organism 水平上进行的，通过比较特定因子的功能获得或功能缺失与野生型条件之间的差异4-7，或基于显微解剖组织开展，这使得基因表达谱难以解释。近年来，细胞靶向技术、亲和纯化方法以及检测灵敏度的提升，使得在活体生物中对少量细胞群体甚至单个细胞进行全基因组范围的分析成为可能。
在Drosophila中，大量的转基因品系可通过GAL4/UAS系统实现对不同组织和细胞亚群的特异性时空靶向8-10，从而更准确地量化细胞功能所必需的分子机制。
在新近发展的方法中，通过分级分离进行多聚核糖体分析谱型被描述为一种捕获活跃翻译RNA的方法11。该方法基于蔗糖梯度离心，当结合微阵列或深度测序分析时，可实现多聚核糖体组分的筛选，并在全基因组范围内确定正在翻译的mRNA。多聚核糖体的分离可与核酸酶消化相结合，以鉴定对应于翻译过程中核糖体保护的RNA片段的核糖体足迹12。核糖体足迹技术提高了RNA翻译定量的准确性以及RNA序列水平的分辨率和核糖体定位能力，使得翻译速率的测量成为可能。然而，迄今为止，该技术尚未应用于细胞特异性的翻译组分离，主要原因是核糖体足迹实验流程末端所获得的RNA产量显著降低。鉴于RNA的大小筛选可能因其他核糖核蛋白复合物（RNPs）以类似方式保护RNA而产生潜在的假阳性结果，仍需进一步改进核糖体足迹技术，并将其适配于细胞特异性的研究策略。
其中一种方法称为核糖体亲和纯化技术（Translating Ribosome Affinity Purification, TRAP），由Heiman et al. 于2008年首次描述，并用于从小鼠特定神经元亚群中分离转译组。通过以细胞类型特异性的方式对核糖体蛋白进行表位标记，可选择性地纯化多聚核糖体，而无需进行繁琐的细胞解离与分选步骤。在此方法中，核糖体表面的60S核糖体蛋白L10a被标记了eGFP13。自2008年以来，已有多个研究在不同物种中应用该方法，从小鼠14-19到X. laevis20,21、斑马鱼22,23以及拟南芥Arabidopsis thaliana24。TRAP方法还被适配于果蝇（Drosophila）模型，用于从神经元细胞25和星形胶质细胞26中纯化细胞类型特异性的mRNA。该方法利用灵活的双元GAL4/UAS系统，以组织特异性方式表达GFP标记的RpL10A。通过解剖成年果蝇头部，从神经元细胞（由泛神经元Elav-Gal4驱动子靶向）中进行多聚核糖体筛选，并对分离的RNA进行测序。大量上调基因与已知在神经系统中表达的基因一致，表明该方法具有良好的特异性，促使我们将其应用于发育中果蝇胚胎中稀有细胞群体（占细胞总数不到1%）的研究。
在 Drosophila 模型中，胚胎阶段是研究发育过程的首选模型，因为其分子参与者和形态发生运动在进化上是保守的。迄今为止，该模型中仅有的组织特异性转录组学研究方法依赖于细胞或细胞核分选技术，仅能研究稳态转录组27-31，因此亟需适用于果蝇胚胎中特定组织/细胞的翻译组分析方法。本文报道了首个专为 Drosophila 胚胎设计的TRAP（翻译核糖体亲和纯化）实验方案。利用该方法，我们成功地从每枚胚胎中约100个肌肉细胞组成的极有限细胞群体中，高质量且高特异性地分离出正在进行翻译的mRNA。本方法采用二元GAL4/UAS系统驱动GFP标记的RpL10A蛋白在特定肌肉亚群中表达，此前研究已证实该表达无毒性，不引起明显表型或发育延迟25。Drosophila 胚胎每个半节段含有30块肌肉，这些肌肉将发育为幼虫的肌肉系统。通过利用位于slouch身份基因附近发现的调控区域，可靶向30块多核肌肉中的6块。在本实验中，使用翻译延伸抑制剂环己酰亚胺（cycloheximide）将核糖体固定在mRNA上。随后利用GFP抗体包被的磁珠对细胞质提取物进行亲和纯化。纯化所得RNA的质量通过生物分析仪验证。采用定量反转录PCR（RT-qPCR）评估mRNA分离的特异性和灵敏度，结果表明我们优化后的实验方案具有很高的效率。

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>H4034-1006</td><td></td></tr><tr><td>1,2-二庚酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱&amp;nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850306P</td><td></td></tr><tr><td>糖原</td><td>thermo scientific&amp;nbsp;</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>纯化BSA 100X&amp;nbsp;</td><td>Biolabs</td><td>B9001</td><td></td></tr><tr><td>酵母tRNA&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R5636</td><td></td></tr><tr><td>Super RNase In&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>抗体GFP克隆N86/38</td><td>UC DAVIS/NIH Neuromab Faculty Antibodies Incorporated</td><td>75-132&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11754595001</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24 裂解均质化&amp;nbsp;</td><td>Bertin Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水&amp;nbsp;</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads ProteinG</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>Applied Biosystem&amp;nbsp;</td><td>AM96406</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁（MgCl₂）&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystem&amp;nbsp;</td><td>AM95306</td><td></td></tr><tr><td>未漂白纤维素棉&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>115-2597&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>筛网 112、355、710 μm&amp;nbsp;</td><td>Retsch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRiZol&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>MagRack 6</td><td>GE HealthCare&amp;nbsp;</td><td>28948964</td><td></td></tr><tr><td>低吸附滤芯吸头&amp;nbsp;</td><td>ClearLine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无RNase离心管 1.5 ml&amp;nbsp;</td><td>ClearLine</td><td>390689DD</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&amp;nbsp;</td><td>Fischer Bioreagent&amp;nbsp;</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>放线菌酮&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>C1985</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂片剂，Mini-Complete，无EDTA&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr></tbody></table>

稀有细胞群体的核糖体亲和纯化技术（trap-rc） 黑腹果蝇 胚胎

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

在单个细胞中测量处于翻译过程的mRNA水平，可提供特定时间点参与细胞功能的蛋白质相关信息。这种被称为翻译核糖体亲和纯化（Translating Ribosome Affinity Purification, TRAP）的技术，能够以细胞类型特异性的方式捕获mRNA的翻译过程。TRAP基于对带有标签的核糖体亚基所结合的多聚核糖体进行亲和纯化，可应用于单个细胞的翻译组分析，从而能够在发育过程中比较不同细胞类型，或在分子水平上追踪疾病进展及潜在治疗手段的影响。本文报道了一种优化后的TRAP技术版本，称为TRAP-rc（稀有细胞），专门用于从稀有细胞群体中鉴定正在进行翻译的RNA。TRAP-rc利用Gal4/UAS靶向系统，在果蝇（Drosophila）胚胎中特定的少量肌细胞群体中得到了验证。该新方法能够回收足量的细胞类型特异性RNA，用于微阵列或RNA-seq等全局基因表达分析。由于该技术具有良好的稳健性，且存在大量可用的Gal4驱动品系，TRAP-rc成为一种高度通用的方法，具有开展细胞特异性全基因组研究的广泛潜力。

果蝇 胚胎体肌系统由每个半节段中的30块肌肉组成，每块肌肉具有一组特定的特性：身份基因编码、位置、融合事件次数、附着位点以及神经支配。在特定肌肉亚群中鉴定出已翻译的mRNA，将提供形成这些特定肌肉特征所需蛋白质的信息。利用基于TRAP的方法，从表达身份基因 slouch 的肌肉亚群中纯化了RNA（图1A-B）。该方法的一个主要关注点是所分离RNA的质量和特异性。本文报道的优化方案通过生物分析仪检测，实现了高质量RNA的系统性回收。所得图谱显示RNA无降解迹象（图1C）。
在围绕TRAP方法开展的其他研究中，人们对该方法数据的特异性提出了质疑。本文通过优化洗涤缓冲液并抑制RNA与磁珠或离心管之间的非特异性结合，改进了该方法以降低背景信号。为了评估背景水平及分离表达slouch基因细胞的效率，我们对同一胚胎发育阶段的3个重复样本进行了RT-qPCR实验。对4个不同基因的富集倍数进行了检测，mef2、slouch、prospero、soxNeuro与输入量相比计算，并相对于 RpL32 基因图 1D）。这些结果表明泛肌肉基因富集了2.3倍 mef2 和5.6倍富集的 驼背 基因。相比之下，在神经系统中表达的两个基因则较输入样本有所减少。在3个生物学重复中观察到非常相似的倍数变化值，表明该方案具有良好的稳健性。使用Slouch-Gal4驱动子并从1.5 g起始，可获得约1.5×10^6个胚胎，每个胚胎含有100个GFP标记细胞（总计约1.5×10^8个阳性细胞）。
完成TRAP实验后，根据所关注的发育阶段不同，可获得约25–45 ng的特异性RNA。该材料足以用于微阵列分析或RNA测序，但需采用扩增方案构建RNA-seq文库。实验效率在很大程度上取决于用于表达RpL10A-EGFP的驱动子的强度。
<img alt="基因表达分析、GFP成像、RNA质量色谱图、mRNA富集条形图。" src="/files/ftp_upload/52985/52985fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. Slouch-GAL4&gt;UASRpL10A-EGFP胚胎中TRAP分离RNA的质量与特异性评估。
（A-B）16期胚胎的共聚焦图像显示，RpL10A-EGFP 特异性表达于每个半体节的六个 Slouch 肌肉细胞中（A）。在合并图像中可见 RpL10A-EGFP 与通用肌肉标记物 Beta3tubulin 共定位（B）。（C）TRAP 分离 RNA 的生物分析仪检测结果，显示 rRNA 的 18S 和 28S 条带完整性良好。（D）对 16 期胚胎的三个生物学重复样本进行 RT-qPCR 分析，表明 TRAP 分离 mRNA 实验具有高度特异性。以输入样本为对照，并以 RpL32 基因为内参进行归一化计算，得到倍数变化。在所有肌肉谱系中均存在的 Mef2 转录本相对于输入样本富集 2.3 倍，而表达范围更局限的 slouch 转录本则富集 5.6 倍。表达 prospero 和 soxN 基因的神经细胞转录本分别减少至输入样本的 2.2 倍和 5.5 倍。误差条表示标准偏差（n=3）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52985/52985fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

翻译核糖体亲和纯化（Translating Ribosome Affinity Purification, TRAP）能够捕获特定细胞类型的mRNA翻译过程。本文报道了首个专门用于从果蝇（Drosophila）胚胎稀有细胞群体中分离mRNA的TRAP实验方案。

稀有细胞群体的核糖体亲和纯化技术（TRAP-rc） 黑腹果蝇 胚胎

在单个细胞中测量处于翻译过程中的mRNA水平，可提供有关特定条件下参与细胞功能的蛋白质的信息。

本实验的总体目标是以细胞类型特异性的方式分离果蝇胚胎中正在进行翻译的RNA。首先，从转基因果蝇品系中收集胚胎，使目标细胞类型（本例中为slouch肌细胞）特异性表达GFP标记的核糖体亚基。第二步是制备裂解液，以获得包含标记与未标记核糖体混合物的多聚核糖体组分。接下来，估计裂解液中的蛋白质浓度，并使用偶联了GFP抗体的磁珠进行亲和纯化，以从目标细胞类型中捕获核糖体RNA复合物。最后一步是进行三醇、RNA的提取与纯化。最终，分别使用生物分析仪和实时定量PCR对RNA的质量和特异性进行评估。随后，RNA可用于RNA测序或微阵列进行全局定量分析。与VX分选等现有方法相比，该技术的主要优势在于无需进行细胞解离的实验室步骤，可在实验台上直接完成。该方法快速且能够直接鉴定极少量细胞群体中翻译的RNA，这对于理解细胞特性的获得具有重要意义。尽管该方法可为约瑟芬胚胎中的肌生成研究提供见解，但也可应用于其他组织或现代生物体，如植物、斑马鱼或小鼠，并有助于在病理情况下追踪治疗对蛋白质合成的影响。本实验操作将由本实验室的博士生Benjamin Berta进行演示。在按照方案书面部分的说明构建两种转基因品系并杂交获得捕获双杂合转基因品系后，首先准备八个大型圆柱形群体培养笼，每笼放入约40克的年轻果蝇，相当于每笼约180,000只果蝇，以此扩增该品系。准备直径为11厘米的培养皿，其中含有凝固的琼脂与葡萄汁的混合物，并在表面三分之一区域覆盖新制备的酵母糊，让果蝇在这些培养皿上产卵一小时。在另外两组新鲜的葡萄汁培养皿上重复此过程，以使果蝇完全排空其生殖道。所需的双转基因胚胎将由杂交果蝇在第四块培养皿上产下。从培养笼中取出含有目标胚胎的培养皿，于室温下继续孵育至所需发育阶段。此处采用13小时的孵育时间。随后用刷子将培养皿中的内容物加入约50毫升水中重新悬浮。通过孔径分别为700、355和112微米的三层筛网过滤液体，将胚胎与死亡的果蝇分离。用去离子水冲洗收集在最小孔径筛网中的胚胎。在去离子水中用4.5%次氯酸钠溶液对胚胎进行表面消毒2分钟，然后用去离子水彻底冲洗30至60秒。将胚胎置于含0.01% T的PBS中孵育，浓度为每毫升20至100微克。在室温下振荡孵育环孢素5到10分钟。用纤维素吸水纸吸干胚胎后，将其转移至微量离心管中，称量离心管重量，然后通过浸入液氮中快速冷冻胚胎。在此阶段，干燥的胚胎可在零下80摄氏度条件下保存数月。将1.5克干燥胚胎转移至预冷的15毫升离心管中，每管加入4毫升多核糖体提取缓冲液，并使用无菌的10毫升血清移液管进行匀浆。然后将匀浆后的胚胎分装至两个预冷的2毫升离心管中，并在多向高速珠磨机中研磨胚胎。设置研磨程序为5000转/分钟，每次运行10秒，重复两次，每次循环之间暂停15秒。在2000 × g条件下离心10分钟后，将裂解液转移至冰上预冷的干净微量离心管中。向S上清液中加入10%非离子型P40，使其终浓度为0.1%，通过倒置试管轻轻混匀。加入300微摩尔的DHPC，使其终浓度为30毫摩尔，并通过倒置试管轻轻混匀。将混合物置于冰上孵育5分钟，孵育期间多次倒置混匀。冰上孵育后，在4°C条件下以20,000 G离心10分钟，制备线粒体后上清液。采用Bradford法测定蛋白浓度，当蛋白浓度达到60至80毫克/毫升时，将上清液转移至预冷的新微量离心管中，并立即进入预吸附步骤。轻轻振荡重悬磁珠，然后每毫升裂解液加入30微升磁珠至微量离心管中。将珠子置于磁铁上收集，用移液器吸除上清液，然后将珠子重悬于500 µL多核糖体提取缓冲液中。接着，再次将珠子置于磁铁上收集。随后加入胚胎裂解物，在4°C条件下于旋转仪中孵育1小时。去除磁珠，将上清液置于冰上，直至进行免疫纯化步骤。保留100微升上清液作为全RNA样本，用于与免疫纯化后收集的样本进行比较。为进行免疫纯化，将1毫升预吸附的裂解液加入含有90微升与GFP抗体偶联的封闭磁珠的无RNA酶离心管中。在4°C下孵育样本，于旋转仪上轻轻颠倒混匀，孵育时间为两小时或过夜。洗涤磁珠时，首先将剩余的磁珠在小型离心机中离心沉淀，然后置于磁力架上收集，加入500 µL洗涤缓冲液重悬，并在低温室中孵育，同时混合10分钟，随后再次将磁珠置于磁力架上收集。将磁珠转移至新的无RNase污染的预屏蔽管中，再清洗两次。最后，将磁珠置于磁力架上收集后，加入1毫升TRIOL试剂，按照生产商说明书进行RNA提取。随后使用RNEZ Micro试剂盒，根据生产商说明书进行RNA纯化。为了检测被捕获RNA的特异性，按照标准操作流程，对三纳克经免疫纯化的RNA和输入RNA进行逆转录。然后使用获得的cDNA与基因特异性引物组进行定量PCR。该16期胚胎的共聚焦图像显示RPL10A-E-G-F-P在每个半节段中的六个slouch肌细胞中特异性表达，且观察到RPL10A-E-G-F-P与通用肌细胞标志物beta three tubulin存在共定位现象。将捕获的RNA在生物分析仪上进行质量控制检测。注意18S和28S核糖体RNA完整性良好。该图展示了对三个16期胚胎生物学重复样本进行逆转录定量PCR分析的结果，证明了捕获所得mRNA具有高度特异性。与输入样本相比，FO 的变化通过 RPL32 基因甲基化进行归一化计算。与输入样本相比，所有肌系中均存在的两种转录本富集了 2.3 倍，而表达范围更局限的 slouch 转录本则富集了 5.6 倍；表达 prospero 的神经细胞以及 socks 基因分别减少了 2.2 倍和 5.5 倍。该技术为研究人员，特别是在发育生物学领域，探索 doof 胚胎分化过程中细胞命运的自我决定及细胞特性的获得奠定了基础。

trap-rc-translating-ribosome-affinity-purification-from-rare-cell

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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