TRAP-RC，翻译核糖体亲和纯化的稀有细胞群果蝇胚胎

该程序的总体目标是在果蝇胚胎中以细胞分型特异性方式分离参与翻译的 RNA。这是通过首先从转基因飞系收集胚胎来实现的，允许在目标细胞类型（在本例中为懒散的肌肉细胞）中特异性表达 A GFP 标记的核糖体亚基。第二步是生成裂解物以获得含有标记和未标记核糖体混合物的多核糖体制剂。

接下来，估计裂解物中的蛋白质浓度，并使用与 GFP 抗体偶联的珠子进行亲和纯化，以从感兴趣的细胞类型中捕获核糖体 RNA 复合物。最后一步专门用于三醇、RNA、提取和纯化。最终，分别使用生物分析仪和 R-T-Q-P-C-R 进行质量和特异性评估。

然后，可以通过 RNA 测序或微阵列将 RNA 用于全局定量分析。我们现有方法的这种技术（如 VX 分选）的主要优点是它不需要细胞解离的 labo 步骤。它可以在工作台上进行。

它速度快，并允许在非常小的细胞群中直接鉴定翻译的 RNA，这对于理解细胞特性的获得是一个衡量优势。即使这种方法可以提供对 Josephine 胚胎中肌生成的见解，它也可以应用于其他组织或现代生物体，例如植物、斑马、鱼或小鼠，并且还可以帮助跟踪治疗对病理学中蛋白质合成的影响。演示该程序的是我实验室的博士生 Benjamin Berta，工程后，根据方案书面部分的说明，两个转基因系并交叉以创建陷阱双交叉转基因系，首先准备八个大型圆柱形种群笼，每个笼子含有约 40 克幼蝇，从而扩增该系， 这相当于每个笼子大约 180， 000 只苍蝇。

11 厘米的培养皿，其中含有凝固琼脂和葡萄汁的混合物，三分之一的表面覆盖着新鲜制作的酵母糊，让苍蝇在这些盘子上产卵一小时。在另外两组新鲜葡萄汁盘上重复此过程，让果蝇完全清空它们的 ucts。来自杂交的所需双转基因胚胎将放置在第四个板上。

从笼子中取出含有所需胚胎的板，让它们在室温下孵育至所需的发育阶段。这里使用 13 小时的孵育。然后用刷子用大约 50 毫升的水重悬板内容物。

通过将液体通过三个直径分别为 700、355 和 112 微米的筛子，将胚胎与死苍蝇分离。用离子水在最小直径的筛子中冲洗收集的胚胎。将胚胎涂在离子水中 4.5% 漂白剂中 2 分钟，然后用离子水彻底冲洗 30 至 60 秒。

将胚胎在 PBS 0.01%T 中孵育，浓度为 20 至 100 微克/毫升。在室温下搅拌 5 至 10 分钟。在纤维素吸收片上干燥胚胎后，将它们转移到微量离心管中，然后称量试管并闪蒸，将胚胎浸入液氮中冷冻。

在这个阶段，干燥的胚胎可以在零下 80 摄氏度下储存几个月。趋势转移 1.5 克干燥的胚胎到预冷的 15 毫升试管中，含有 4 毫升多核糖体提取、缓冲和均质化。使用无菌 10 毫升血清移液管。

然后将匀浆的胚胎摊入两个预冷的两毫升试管中，并在多向快速珠研磨机中研磨胚胎。设置为以 5， 000 RPM 的速度运行两次，每次 10 秒，每个循环之间暂停 15 秒。以 2000 G 离心 10 分钟后，将裂解物转移到冰上新鲜的预冷微量离心管中。

将 10% 非 P 40 添加到 S 上清液中至终浓度为 0.1%，并倒置试管轻轻混合。加入 300 微摩尔的 DHPC 至终浓度为 30 毫摩尔，并通过倒置试管轻轻混合。将混合物在冰上孵育 5 分钟，在孵育过程中倒置混合数次。

在冰中孵育后。通过在 4 摄氏度下以 20， 000 G 离心 10 分钟来制备线粒体后旋压液.在通过 Bradford 方法测量蛋白质浓度并获得 60 至 80 毫克/毫升之间的蛋白质浓度后，将 SNAT 转移到新鲜的预冷微量离心管中，并立即进行预吸收步骤。轻轻搅拌重悬磁珠，然后将每毫升裂解物的 30 μL 磁珠转移到微量离心管中。

在磁力架上收集珠子，吸出 snat 并重悬珠子和 500 微升多核糖体提取缓冲液。接下来，收集磁铁上的珠子。再次加入胚胎、裂解物，并在旋转器上以 4 摄氏度孵育 1 小时。

去除珠子，将仰卧剂放在冰上，直到免疫纯化步骤。保留 100 μL 旋囊作为全局 RNA 样品，以便与免疫纯化后收集的样品进行比较 为了对样品进行免疫纯化，将 1 mL 预吸收的裂解物添加到含有 90 μL 封闭珠子的无 RNA 试管中，这些微珠与 GFP 抗体偶联。将样品在 4 摄氏度下孵育 2 小时或过夜，孵育后在试管旋转器中轻轻地端对端混合。

首先在微型离心机中旋转剩余的珠子，洗涤珠子。然后收集在磁铁上，重悬于 500 μL 洗涤液中，缓冲并反复孵育。在冷藏室中混合 10 分钟结束，然后再次收集磁珠。

将珠子转移到新的 pre shield R RNAs free 试管中，再洗涤两次。最后，在磁体上收集珠子后，向珠子中加入 1 毫升 TRIOL 并按照制造商的说明进行提取，以进行 RNA 提取。然后根据制造商的说明使用 RNEZ 微量试剂盒进行 RNA 纯化。

为了测试捕获 RNA 的特异性，根据标准程序对 3 ng 免疫纯化和输入 RNA 进行逆转录。然后将 QPCR 获得的 CDNA 与基因特异性引物组一起使用。该 16 期胚胎的共聚焦图像显示 RPL 10 A-E-G-F-P 表达，特别是在每个 HEMI 节段的六个松弛肌肉细胞中，观察到 RPL 10 A-E-G-F-P 与一般肌肉标志物 β 三个微管蛋白的共定位。

将捕获的 RNA 在生物分析仪上运行以进行质量控制。注意一个 8 s 和两个 8 s 核糖体 RNA 的完美完整性。该图显示了对 16 期胚胎的三个生物学重复的 RT QPCR 分析结果，并证明了陷阱分离的 mRNA 的高特异性。

计算 FO 变化与输入值相比，并根据 RPL 32 基因 meth 进行标准化。与输入相比，存在于所有肌肉谱系中的两个转录本富集 2.3 倍，而更受限的懒散转录本是表达 prospero 的 5.6 倍富集神经细胞，袜子和基因在发育后分别耗尽 2.2 倍和 5.5 倍。这项技术为研究人员铺平了道路，尤其是发育生物学领域的研究人员，以探索 doof 胚胎分化过程中的自助承诺和细胞特性的获得。