稀有细胞群体的核糖体亲和纯化技术（TRAP-rc） 黑腹果蝇 胚胎

本实验的总体目标是以细胞类型特异性的方式分离果蝇胚胎中正在进行翻译的RNA。首先，从转基因果蝇品系中收集胚胎，使目标细胞类型（本例中为slouch肌细胞）特异性表达GFP标记的核糖体亚基。第二步是制备裂解液，以获得包含标记与未标记核糖体混合物的多聚核糖体组分。

接下来，估计裂解液中的蛋白质浓度，并使用偶联了GFP抗体的磁珠进行亲和纯化，以从目标细胞类型中捕获核糖体RNA复合物。最后一步是进行三醇、RNA的提取与纯化。最终，分别使用生物分析仪和实时定量PCR对RNA的质量和特异性进行评估。

随后，RNA可用于RNA测序或微阵列进行全局定量分析。与VX分选等现有方法相比，该技术的主要优势在于无需进行细胞解离的实验室步骤，可在实验台上直接完成。

该方法快速且能够直接鉴定极少量细胞群体中翻译的RNA，这对于理解细胞特性的获得具有重要意义。尽管该方法可为约瑟芬胚胎中的肌生成研究提供见解，但也可应用于其他组织或现代生物体，如植物、斑马鱼或小鼠，并有助于在病理情况下追踪治疗对蛋白质合成的影响。本实验操作将由本实验室的博士生Benjamin Berta进行演示。在按照方案书面部分的说明构建两种转基因品系并杂交获得捕获双杂合转基因品系后，首先准备八个大型圆柱形群体培养笼，每笼放入约40克的年轻果蝇，相当于每笼约180,000只果蝇，以此扩增该品系。

准备直径为11厘米的培养皿，其中含有凝固的琼脂与葡萄汁的混合物，并在表面三分之一区域覆盖新制备的酵母糊，让果蝇在这些培养皿上产卵一小时。在另外两组新鲜的葡萄汁培养皿上重复此过程，以使果蝇完全排空其生殖道。所需的双转基因胚胎将由杂交果蝇在第四块培养皿上产下。

从培养笼中取出含有目标胚胎的培养皿，于室温下继续孵育至所需发育阶段。此处采用13小时的孵育时间。随后用刷子将培养皿中的内容物加入约50毫升水中重新悬浮。

通过孔径分别为700、355和112微米的三层筛网过滤液体，将胚胎与死亡的果蝇分离。用去离子水冲洗收集在最小孔径筛网中的胚胎。在去离子水中用4.5%次氯酸钠溶液对胚胎进行表面消毒2分钟，然后用去离子水彻底冲洗30至60秒。

将胚胎置于含0.01% T的PBS中孵育，浓度为每毫升20至100微克。在室温下振荡孵育环孢素5到10分钟。用纤维素吸水纸吸干胚胎后，将其转移至微量离心管中，称量离心管重量，然后通过浸入液氮中快速冷冻胚胎。

在此阶段，干燥的胚胎可在零下80摄氏度条件下保存数月。将1.5克干燥胚胎转移至预冷的15毫升离心管中，每管加入4毫升多核糖体提取缓冲液，并使用无菌的10毫升血清移液管进行匀浆。

然后将匀浆后的胚胎分装至两个预冷的2毫升离心管中，并在多向高速珠磨机中研磨胚胎。设置研磨程序为5000转/分钟，每次运行10秒，重复两次，每次循环之间暂停15秒。在2000 × g条件下离心10分钟后，将裂解液转移至冰上预冷的干净微量离心管中。

向S上清液中加入10%非离子型P40，使其终浓度为0.1%，通过倒置试管轻轻混匀。加入300微摩尔的DHPC，使其终浓度为30毫摩尔，并通过倒置试管轻轻混匀。将混合物置于冰上孵育5分钟，孵育期间多次倒置混匀。

冰上孵育后，在4°C条件下以20,000 G离心10分钟，制备线粒体后上清液。采用Bradford法测定蛋白浓度，当蛋白浓度达到60至80毫克/毫升时，将上清液转移至预冷的新微量离心管中，并立即进入预吸附步骤。轻轻振荡重悬磁珠，然后每毫升裂解液加入30微升磁珠至微量离心管中。

将珠子置于磁铁上收集，用移液器吸除上清液，然后将珠子重悬于500 µL多核糖体提取缓冲液中。接着，再次将珠子置于磁铁上收集。随后加入胚胎裂解物，在4°C条件下于旋转仪中孵育1小时。

去除磁珠，将上清液置于冰上，直至进行免疫纯化步骤。保留100微升上清液作为全RNA样本，用于与免疫纯化后收集的样本进行比较。为进行免疫纯化，将1毫升预吸附的裂解液加入含有90微升与GFP抗体偶联的封闭磁珠的无RNA酶离心管中。在4°C下孵育样本，于旋转仪上轻轻颠倒混匀，孵育时间为两小时或过夜。

洗涤磁珠时，首先将剩余的磁珠在小型离心机中离心沉淀，然后置于磁力架上收集，加入500 µL洗涤缓冲液重悬，并在低温室中孵育，同时混合10分钟，随后再次将磁珠置于磁力架上收集。

将磁珠转移至新的无RNase污染的预屏蔽管中，再清洗两次。最后，将磁珠置于磁力架上收集后，加入1毫升TRIOL试剂，按照生产商说明书进行RNA提取。随后使用RNEZ Micro试剂盒，根据生产商说明书进行RNA纯化。

为了检测被捕获RNA的特异性，按照标准操作流程，对三纳克经免疫纯化的RNA和输入RNA进行逆转录。然后使用获得的cDNA与基因特异性引物组进行定量PCR。该16期胚胎的共聚焦图像显示RPL10A-E-G-F-P在每个半节段中的六个slouch肌细胞中特异性表达，且观察到RPL10A-E-G-F-P与通用肌细胞标志物beta three tubulin存在共定位现象。

将捕获的RNA在生物分析仪上进行质量控制检测。注意18S和28S核糖体RNA完整性良好。该图展示了对三个16期胚胎生物学重复样本进行逆转录定量PCR分析的结果，证明了捕获所得mRNA具有高度特异性。

与输入样本相比，FO 的变化通过 RPL32 基因甲基化进行归一化计算。与输入样本相比，所有肌系中均存在的两种转录本富集了 2.3 倍，而表达范围更局限的 slouch 转录本则富集了 5.6 倍；表达 prospero 的神经细胞以及 socks 基因分别减少了 2.2 倍和 5.5 倍。该技术为研究人员，特别是在发育生物学领域，探索 doof 胚胎分化过程中细胞命运的自我决定及细胞特性的获得奠定了基础。