多路人工细胞微环境阵列的制备

这种方法可以帮助解决干细胞工程领域的一个关键问题，例如细胞微环境如何改变细胞表型和功能。这项技术的主要优点是它为单个板中的细胞提供了多个人工创建的环境，这是您无法在微接触板中使用常规方法进行的，我们实验室的 Koki Yoshimoto 和 Risako Sakai 技术人员将证明该程序。根据文本协议从微流体结构创建纳米纤维阵列和模具的掩模的 3D 图像后。

使用 3D 打印机打印口罩和模具。为了制备用于静电纺丝的聚合物溶液，将 13% 的 PMGI 液体与四氢呋喃稀释至 9%。将 0.08 克 PS 溶解在 THF 与二甲基甲酰胺的 1：1 体积比中，并使用液体再生剂使体积达到最后 1 毫升，每体积重量为 8% 的 PS 溶液。

0.1 克 GT 溶于水、酸性酸和乙酸乙酯中，并使用混合溶剂溶液使体积达到最终的 1 毫升 10% 重量比的 GT 溶液。接下来，使用磁控溅射机，在聚苯乙烯底板上沉积一层 5 纳米厚的铂层，该底板用作静电纺丝装置中的阴极。将每种聚合物溶液装入配备 23 号不锈钢钝针的 5 毫升注射器中。

然后将注射器固定在注射泵上，距离静电纺丝装置的收集器 12 厘米。将注射器针头连接到高压电源，并将其设置为 11 kV。然后将抽速设置为每小时 20 毫升，并将温度和湿度分别保持在 30 摄氏度和小于 30%（体积）的水平。

现在将面膜放在底板上。然后通过掩模的孔，通过改变静电纺丝时间，在底板上制造具有不同密度的纳米纤维。从底板上取下口罩并重复纳米纤维制造。

阵列完成后，将其放入 25 摄氏度的干燥器中 16 小时以蒸发剩余的溶剂。为了交联 GT 纳米纤维，用 0.2 摩尔 EDC 和 0.2 摩尔 NHS 的乙醇处理它们。并将样品在 25 摄氏度下孵育 4 小时。

要冲洗 GT 纳米纤维，请使用 99.5% 乙醇两次，并在 25 摄氏度下真空干燥板 16 小时。要制造微流体结构，请混合 2 克 PDMS 固化剂和 20 克 PDMS 基料。然后将 PDMS 前的混合物倒入制造的模具中。

在干燥器中，对 pre PDMS 混合物进行脱气 30 分钟。然后将 pre PDMS 混合物在 65 摄氏度的烘箱中固化 16 小时。要组装 Macme 阵列，请从模具上剥离固化的 PDMS 结构，并使用 70% 的乙醇进行清洁。

然后在 PDMS 结构的底部排放大气电晕。使用纳米纤维阵列快速组装 PDMS 结构。然后在 65 摄氏度的烤箱中烘烤组件两天。

使用 DPBS 洗涤在 35 毫米培养皿上培养的 H9HESC。然后向培养皿中加入 0.5 毫升重组胰蛋白酶，并在 37 摄氏度下孵育 1 分钟。小心吸出上清液蛋白酶混合物。

立即加入 HPSC 培养基，并将培养基轻轻地重复分配到培养皿表面以解离细胞。然后将分离的细胞转移到 15 毫升锥形管中。将试管以 200 倍重力离心 3 分钟。

吸出上清液并将细胞悬浮在预热的 HPSC 培养基中。然后将 12 微升细胞悬液移液到每个微流体室中。根据文本方案对细胞进行荧光标记后，从 Macme 阵列中剥离 PDMS 微流体结构。

然后从 Macme 阵列中取出残留的 PBMS，向染色细胞中加入 90% 甘油的 PBS 溶液，并盖上盖玻片。最后，将板倒置在倒置荧光显微镜的载物台上。并使用显微镜成像软件获取 12 位彩色图像。

这里显示的是 H9HPSCs 的免疫荧光图像，这些细胞在明胶纳米纤维上以高初始接种密度培养，并用 3 个细胞表型标记物染色。采用 SOM 分析将高维多参数数据集转换为低维 2D 图，以比较每个数据集中 4 个表型标记物表达水平的同质性和异质性，并对 SOM 节点进行无监督分层聚类。如此处所示，所有组的 OCT4 表达均高于在基底膜凝胶基质 （MG） 上观察到的表达。第 1 组显示高 EdU 信号，表明大多数细胞正在积极增殖。

因此，第 1 组中的微环境适合 HPSC 维持，因为当细胞周期间隙期缩短时，未分化的 HPSCs 会迅速增殖。第 2 组包括以初始密度不足接种的细胞和在不支持 HPSC 自我更新的 2D GT 支架上生长的细胞。例如，该样品的 EdU 信号丢失，膜联蛋白 V 水平略有增加，表明细胞已失去干性并逐渐凋亡。

来自第 3 组的 PMGI MidNF HighCD 代表由 PMGI 纳米纤维基质组成的微环境，与其他条件相比，OCT4 和 EdU 信号的变化更大。经过开发，这项技术为 STEM 细胞领域的研究人员探索组织工程和高级筛选铺平了道路。