库普弗细胞分离用于纳米颗粒毒性检测

以下实验的总体目标是大量分离和纯化小鼠库普弗细胞，以研究纳米颗粒的毒性。该过程通过使用 H-B-S-S-E-G-T-A 溶液和胶原酶溶液灌注小鼠肝脏，轻柔地消化肝组织。随后，通过密度梯度离心和选择性贴壁法对肝细胞进行纯化，从而获得高纯度的库普弗细胞培养物。

然后进行流式细胞术分析，以确认杯状细胞的纯度及其酸性特性。获得的结果表明，功能化碳纳米管的毒性可以在杯状细胞中进行测定。基于改良的乳酸脱氢酶释放实验（L-D-H-S-A）结果支持该模型可用于纳米颗粒毒性测试。

我们今天要向您展示的方法有助于回答纳米毒理学领域的关键问题，例如评估新开发的药物载体的毒性。这一点非常重要，因为目前使用的大多数永生化细胞系与其来源组织具有显著不同的特性。该方法的可视化演示至关重要。如果该方法成功实施，将能够获得高产量和高纯度的角膜上皮细胞，这些细胞可作为模型用于筛选多种纳米颗粒的毒性。

根据随附文本方案中列出的材料与试剂表，将所有试剂新鲜配制后，将 E-G-T-A-H-B-S-S 溶液和胶原酶溶液在 40 摄氏度下预热 30 分钟，用 70% 乙醇冲洗泵的软管。然后将 40 毫升 E-G-T-A-H-B-S-S 溶液倒入置于水浴中的离心管中，并用预热的 E-G-T-A-H-B-S-S 溶液冲洗泵的软管。按照文本方案处死一只 CD1 小鼠后，剃除腹部毛发，并用 70% 乙醇对腹部表面进行消毒。

通过夹捏脚趾确认麻醉效果。切开腹腔，将肠道向腹部左侧横向移开，暴露门静脉和下腔静脉。使用 E-G-T-A-H-B-S-S 溶液，以每分钟一至三毫升的速度启动泵，用 23 号蝶形针穿刺门静脉，夹闭已插管的门静脉段，然后翻转开口小鼠腹部表面的弯头镊。

灌注开始后的前30秒内，肝脏应迅速变苍白，此时需快速切开下腔静脉下部，以避免肝脏内压力过高，并在灌注第一分钟内逐渐将流速提高至每分钟7毫升。当离心管中剩余的EGTA-HBSS溶液少于5毫升时，加入40至50毫升胶原酶A溶液，然后在30秒内将流速逐渐增加至每分钟10毫升。

使用镊子定期对下腔静脉施加压力，持续10至32秒，使肝脏膨胀。这将有助于细胞解离，并缩短胶原酶灌注时间。当离心管中胶原酶溶液剩余不足10毫升时，向管中额外加入40至50毫升预热的胶原酶溶液。

当灌注量达到 70 至 80 毫升时，用镊子轻轻按压肝脏表面，若出现凹陷痕迹，表明肝细胞已解离。将肝脏完整地从腹腔中取出，并置于含有 20 至 30 毫升细胞分离培养基的离心管中。

将肝细胞置于冰上最多三小时，并可合并最多三个肝脏进行细胞纯化。将一个灌流后的肝脏放入含有15毫升细胞分离用培养基的培养皿中，使用剪刀或镊子操作。撕破肝脏的包膜，使所有肝细胞释放到培养基中。

将溶液通过100微米细胞滤筛过滤至离心管中。随后在4°C条件下以50 ×g离心2分钟。实质细胞将位于沉淀中，而非实质细胞则位于上清液中。

将上清液收集到一个干净的离心管中，在50 ×g 条件下离心2分钟。重复操作，共进行四次转移和离心。接下来进行离心。

在1,350 ×g下离心15分钟。为沉淀非实质细胞，弃去上清液，将沉淀物重悬于10 mL用于细胞分离的培养基中，将非实质细胞悬液加入先前根据文本方案制备的不连续25%-50%等渗梯度液中，在无加速和无刹车条件下于850 ×g离心15分钟。使用10 mL血清移液管，从25% SIP组分内靠近25%-50% SIP界面处、呈浑浊的富集杯状细胞组分中吸取约12 mL液体。

将细胞转移至含有35至40毫升细胞分离杯中的培养基中，轻轻混匀，然后在4°C条件下以1,350 ×g离心，使细胞沉淀。弃去上清液，加入5至10毫升预热的培养基，用血细胞计数板重悬细胞。计数细胞，并使用台盼蓝染色法测定细胞活力。将纯化的非实质细胞以每孔5×10⁵个细胞的密度接种于24孔板中。

将细胞在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下孵育 30 分钟。然后轻轻吸去培养基。用预热的 HBSS 洗涤细胞，并更换为每孔 500 微升预热的新鲜细胞培养培养基。

将细胞放回 37 摄氏度环境中至少 4 小时，以使细胞充分贴壁，然后再进行纳米颗粒处理。在根据文本方案完成对 C 细胞的纯度和吞噬活性表征，并与功能化碳纳米管（fcts）共孵育后，弃去上清液，每孔加入 200 µL 裂解缓冲液。在 37 °C 下孵育 30 至 60 分钟，进行剧烈的移液吹打，将裂解后的细胞收集至微量离心管中。

然后以 20,000 ×g 离心 10 分钟，使细胞碎片沉淀，从而分离出被细胞摄取的 fcn ts。收集上清液至微量离心管中，并在 -20 摄氏度下保存。或者，将 50 微升上清液转移至 96 孔板中，并加入等体积的乳酸脱氢酶试剂盒中的底物混合溶液。

设置三份空白孔，每孔包含 50 微升裂解缓冲液和 50 微升底物混合溶液。然后覆盖培养板，在室温下孵育 15 分钟，随后加入 50 微升终止液。最后，在酶标仪中于 490 纳米处读取吸光度，并使用以下公式计算细胞存活率百分比。

该图显示，每只小鼠和三联体纯化的非实质细胞数量在八至十四乘以十的六次方个细胞之间。蓝色染色表明细胞活力约为95%。细胞在培养30分钟内贴壁并呈圆形，4小时后细胞开始铺展并形成如图所示的细胞簇。

采用F四80抗体对细胞进行染色，以检测细胞纯度，经流式细胞术测定，细胞纯度高于95%。此外，在培养12小时后，流式细胞分析显示，85%的细胞具有吞噬酸性活性，表现为能够摄取1 µm荧光微球。然而，当培养时间延长至72小时时，仅40%的细胞仍保持吞噬活性，如图所示。

与经功能化碳纳米管孵育24小时和72小时的细胞相比，其细胞形态与未处理细胞相似。相比之下，以10% DMSO作为阳性对照孵育的细胞在改良LDH检测分析中呈现坏死形态；经10% DMSO处理24小时和72小时的细胞杯显示毒性显著升高。相比之下，fcts仅在细胞暴露于50微克/毫升浓度达72小时时，才引起轻微但显著的细胞活力下降。采用该方法，可利用分离的ke细胞对其他基于细胞的SC及各类纳米颗粒进行测试。

这能够在减少动物使用的同时获得可靠的数据。我们希望该技术能够帮助纳米科技心理学领域的研究人员，为日益增多的新型纳米载体的安全性筛选铺平道路。