Name: 枯否细胞分离的纳米粒子毒性测试 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 学习从小鼠肝脏中分离纯化枯否细胞的方法，用于研究碳纳米管等纳米粒子的毒性。该方法通过肝脏灌注、密度梯度离心和选择性贴壁获得高纯度细胞，为纳米毒理学研究提供可靠的体外模型。

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本工作由欧盟第七框架计划（FP7-ITN）玛丽·居里网络项目RADDEL资助。MB和KAJ谨感谢Joe Varguese和Rui Serra Maia在优化库普弗细胞分离过程中的帮助与建议。

所有动物实验均严格遵守相关指南、法规及监管机构的要求。本视频所展示的实验方案是在英国政府内政部法规的指导和批准下进行的
1. 灌注与细胞收集（图1）
<img alt="肝脏灌注示意图：使用HBSS/EGTA和胶原酶溶液在40°C水浴中进行；使用蠕动泵。" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1：肝脏灌注。 对小鼠实施麻醉后，将消化道向腹腔左侧横向移位，以暴露门静脉（PV）。使用低流速（1–3 ml/min）的EGTA/HBSS溶液对门静脉进行插管，同时立即切破下腔静脉（IVC），以防止肝脏内压力过高。在灌注开始后的第一分钟内，逐渐将流速提高至7 ml/min。随后以10 ml/min的流速灌注胶原酶溶液，直至肝脏完全消化。
<ol>
	<li>根据材料表中所述，所有试剂均需新鲜配制。</li>
	<li>将 EGTA（乙二醇四乙酸）/HBSS（Hank's 平衡盐溶液）溶液（每只小鼠 50 ml）和胶原酶溶液（每只小鼠 100 ml）于 30 分钟内预热至 40 °C.</li>
	<li>先用70%乙醇冲洗泵的软管。将40 ml EGTA/HBSS溶液倒入置于水浴中的离心管内，用预热的EGTA/HBSS溶液冲洗泵的软管。</li>
	<li>使用巴比妥类药物进行终末麻醉，以在呼吸抑制和死亡前可靠地诱导无意识状态。向雌性或雄性CD1小鼠（35-45 g）腹腔注射1 mg/kg的苯巴比妥钠。通过脚趾夹捏法确认麻醉效果。</li>
	<li>剃除腹部毛发，并使用70%乙醇溶液对腹部表面进行消毒。</li>
	<li>切开腹腔，将肠道向腹部左侧外侧移动，暴露门静脉和下腔静脉。</li>
	<li>以1-3 ml/min的流速启动泵，使用EGTA/HBSS溶液经23号蝶形针（剪去针翼）插管门静脉。用夹子固定23 G针头插管的门静脉段，然后翻转位于打开的小鼠腹腔表面的止血钳。在EGTA/HBSS溶液灌注的前30秒内，肝脏应迅速变苍白。</li>
	<li>迅速切开下部的下方部分 下腔静脉 为避免肝脏内压力过高，灌注开始后的第一分钟内，逐渐将流速增加至7 ml/min。动物因腔静脉穿刺导致的继发性出血而死亡。 </li>
	<li>当离心管中EGTA/HBSS溶液剩余量少于5 ml时，用胶原酶溶液补足至40–50 ml。在30秒内将流速逐渐增加至10 ml/min。</li>
	<li>通过按压下腔静脉使肝脏肿胀 下腔静脉使用镊子夹住，每次5-10秒，间隔进行（消化过程中可重复5-10次）。此步骤有助于提高肝细胞的解离效果，并减少胶原酶灌注时间。</li>
	<li>当离心管中剩余的胶原酶溶液体积少于10 ml时，向离心管中加入40–50 ml预热的胶原酶溶液。</li>
	<li>灌注10-15分钟后，当约70-80 ml胶原酶溶液通过肝脏时，用镊子轻轻按压肝脏表面。若出现压痕，表明肝细胞已解离。</li>
	<li>将肝脏完整地从腹腔中取出，放入含有 20–30 ml 库普弗细胞分离培养基的离心管中。将肝细胞置于冰上或 4 °C 最长处理时间为3小时，以避免影响肝细胞活力。</li>
	<li>如有需要，可对多只动物重复灌注操作，同时将已灌注的肝脏置于冰上保存。将一至三只肝脏合并用于纯化，并进行第3阶段操作。</li>
</ol>
2. 离心用密度梯度的制备（图2）
<img alt="SIP 溶液梯度制备示意图；离心管；液体分层技术。" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2：密度梯度的制备。 所有操作均在无菌条件下进行。通过将 15.3 ml 涂层二氧化硅颗粒溶液与 1.7 ml 10 × PBS 混合制备 SIP。取 5 ml SIP 与 15 ml PBS 混合，配制成 20 ml 的 25% SIP 溶液。取 10 ml SIP 与 10 ml PBS 混合，配制成 20 ml 的 50% SIP 溶液。将装有 50% SIP 溶液（20 ml）的离心管倾斜，使用 25 ml 血清移液管缓慢加入 25% SIP 溶液（20 ml）。
<ol>
	<li>在无菌条件下进行以下步骤（第2、3和5节），并将细胞置于冰上或4 °C保存。通过将15.3 ml包被二氧化硅颗粒溶液与1.7 ml 10倍浓度PBS混合，制备等渗包被二氧化硅颗粒溶液（SIP）。</li>
	<li>配制20 ml 25% SIP溶液：将5 ml SIP与15 ml PBS混合。配制20 ml 50% SIP溶液：将10 ml SIP与10 ml PBS混合。</li>
	<li>取一支离心管，加入20 ml 50% SIP溶液。将离心管倾斜至接近90°角，使用25 ml血清移液管沿管壁缓慢加入25% SIP溶液（20 ml），注意不要触碰50% SIP液层的表面。在加入25% SIP溶液的过程中，逐渐减小离心管的倾斜角度。将密度梯度液置于冰上保存，直至使用。</li>
</ol>
3. 枯否细胞纯化（图3）
<img alt="经密度梯度离心和细胞贴壁法纯化库普弗细胞；肝细胞过滤。" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3：通过密度梯度离心和细胞贴壁法纯化库普弗细胞。所有操作均在无菌条件下进行。（A）在破裂格利森氏囊后，肝细胞通过100 µm滤网过滤。将悬液以50 × g离心，弃去肝实质细胞（沉淀），收集非实质细胞组分（上清液）。此步骤重复3次。将非实质细胞置于不连续等渗梯度上，以800 × g离心15分钟。从25% SIP垫层收集的库普弗细胞进一步通过细胞贴壁筛选进行纯化。（B）将细胞接种于24孔板中，在37 °C、5% CO2条件下孵育30分钟。用500 µl HBSS洗涤非贴壁细胞一次。接种4小时后，库普弗细胞呈现其典型的贴壁形态，此时可向细胞中加入f-CNTs。比例尺表示25 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52989/52989fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol>
	<li>将一个灌注过的肝脏放入含有15 ml库普弗细胞分离培养基的培养皿中。使用剪刀撕破格利森氏囊（肝脏的膜），并将所有肝细胞释放到库普弗细胞分离培养基中。通过100 µm细胞筛过滤溶液，收集至离心管中。对其他灌注过的肝脏重复灌注操作，并将细胞汇集至同一离心管中（一只小鼠可得15 ml，最多三只小鼠可得45 ml）。</li>
	<li>在4 °C条件下，以50 × g离心细胞悬液2分钟。实质细胞（肝细胞）将形成沉淀，而非实质细胞（包括库普弗细胞）则保留在上清液中。</li>
	<li>将上清液转移至洁净的离心管中，以50 × g离心2分钟。重复此步骤三次。</li>
	<li>以1,350 × g离心15分钟，使非实质细胞沉淀。弃去上清液，并将沉淀重悬于10 ml库普弗细胞分离培养基中。</li>
	<li>将非实质细胞悬液加至25/50%不连续等渗梯度液（如2.3节所述）。以850 × g离心15分钟，离心过程中不启用加速或刹车功能。</li>
	<li>在25% SIP组分中靠近25/50% SIP界面处，可观察到呈浑浊状的富集库普弗细胞组分（图3）。使用10 ml移液管，吸取约12 ml富集的库普弗细胞组分，转移至含有35–40 ml库普弗细胞分离培养基的离心管中。轻轻混匀后，在4 °C条件下以1,350 × g离心15分钟，使细胞沉淀。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞重悬于5–10 ml预温的库普弗细胞培养基中。进行细胞计数（血细胞计数板），并使用台盼蓝染色法测定细胞活力。</li>
	<li>将纯化的非实质细胞以每孔5 × 105个细胞的密度接种于24孔板中。将细胞置于37 °C、5% CO2条件下培养（图3）。30分钟后，轻轻吸除培养基，用预温的Hank's平衡盐溶液（HBSS）洗涤一次，然后每孔加入500 µl新鲜且预温的库普弗细胞培养基。</li>
	<li>在给予纳米颗粒处理前，将库普弗细胞在37 °C、5% CO2条件下静置至少4小时，以使其获得贴壁形态。</li>
</ol>
4. 表征
<ol>
	<li>库普弗细胞纯度
	<ol>
		<li>配制新鲜的PBS/BSA溶液以维持库普弗细胞活性。用500 µl PBS/BSA溶液洗涤细胞一次。吸除PBS/BSA溶液后，加入500 µl新鲜PBS/BSA溶液，轻轻刮取以使库普弗细胞脱落。当细胞接种于24孔板时，可用剪刀剪短刮刀边缘，以便更顺利地完成细胞脱落操作。将细胞转移至流式细胞管中。</li>
		<li>使用血细胞计数板计数库普弗细胞，并取1 × 105个细胞在1,350 × g条件下离心。将细胞重悬于30 µl F4/80抗体（原液）中，充分混匀后室温孵育30分钟。将未染色细胞（未与抗体孵育）置于冰上保存。</li>
		<li>向染色后的细胞中加入2 ml PBS/BSA溶液，在1,350 × g条件下离心5分钟，弃去上清液。将沉淀的细胞重悬于200 µl PBS/BSA溶液中。</li>
		<li>进行流式细胞术分析时，根据未染色库普弗细胞的大小（前向散射）和颗粒度（侧向散射）设门，采集10,000个细胞。在FL-1通道中分析设门后细胞的荧光信号。</li>
		<li>对染色后的库普弗细胞重复上述操作，保持与未染色细胞流式分析相同的仪器设置。通过检测染色细胞的荧光强度，评估库普弗细胞的纯度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>库普弗细胞吞噬活性
	<ol>
		<li>将培养基更换为含0.5%（v/v）荧光微球的库普弗细胞培养基，在37 °C、5% CO2条件下孵育4小时。</li>
		<li>为去除未被细胞内化的微球，将库普弗细胞在1,350 × g条件下离心，弃去上清液，并将细胞重悬于500 µl PBS/BSA溶液中。重复此步骤2次。</li>
		<li>用500 µl PBS/BSA溶液刮取库普弗细胞，并将细胞转移至流式细胞管中。</li>
		<li>将库普弗细胞在1,350 × g条件下离心，弃去上清液，再将细胞重悬于200 µl PBS/BSA溶液中。</li>
		<li>进行流式细胞术分析时，根据未染色库普弗细胞的大小（前向散射）和颗粒度（侧向散射）设门，采集10,000个细胞。在FL-2通道中分析设门后细胞的荧光信号。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 化学功能化碳纳米管（f-CNTs）的孵育
<ol>
	<li>制备分散液 f使用前将水中的碳纳米管（1 mg/ml）超声处理15分钟。 f-碳纳米管为实验室自制22.</li>
	<li>制备2倍浓缩液 f-CNTs Kupffer细胞培养基中的分散 超声处理 f-CNTs 在进行步骤 5.3 之前，需在培养基中分散 2 分钟。</li>
	<li>每个孔中，更换 250 µl 旧培养基的更换 250 µl 2x f-碳纳米管分散液。未经处理的孔250 µl 条件培养基 + 250 µl 分别以新鲜的库普弗细胞培养基和含10% DMSO的培养基作为阴性对照和阳性对照。</li>
	<li>孵育库普弗细胞 37 °C 和5% CO₂2 24 或 72 小时。</li>
</ol>
6. 毒性评估 f 改良乳酸脱氢酶（LDH）检测法检测库普弗细胞中的碳纳米管
<ol>
	<li>弃去上清液。</li>
	<li>每孔（24 孔板）加入 200 µl 裂解缓冲液，在 37 °C 孵育 30 分钟至 1 小时。</li>
	<li>充分吹打混匀后，将裂解的库普弗细胞收集至微量离心管中，在 40,000 × g 离心 10 分钟，以沉淀被细胞摄取的 f-CNTs 及细胞碎片。</li>
	<li>收集上清液（不含 ƒ-CNT）至微量离心管中，于 -20 °C 保存，或直接进行步骤 6.5。</li>
	<li>取 50 µl 加入 96 孔板中，向每孔加入等体积的底物混合液（LDH 试剂盒），盖上板子，在室温孵育 15 分钟后，加入 50 µl 终止液（LDH 试剂盒）。设置三复孔空白孔，每孔含 50 µl 裂解缓冲液、50 µl 底物混合液和 50 µl 终止液。</li>
	<li>使用酶标仪在 490 nm 处读取吸光度，并利用以下公式计算细胞活力（%）。</li>
</ol>
<img alt="细胞存活率公式，%=(处理组A490-空白组)/(未处理组A490-空白组)×100，用于分析的方程。" src="/files/ftp_upload/52989/52989eq1.JPG" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="方程 1">

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

以下步骤对于获得高产量和高活力的库普弗细胞至关重要。应采用无菌条件以降低细菌和真菌污染的风险。所有器械在使用前均需灭菌。试剂应在进行分离操作前新鲜配制。
选择胰酶活性较低的胶原酶IV至关重要。同一供应商的不同批次其酶活性可能不同，因此在最初需要进行比较，以选出最适合库普弗细胞分离的批次。可通过评估细胞得率和细胞活力来判断其适用性。建议联系供应商，提供曾用于类似应用的批次。一旦确定所用批次，应预留该批次以供后续使用。
插管操作需要经过训练。建议使用多只动物进行练习，以熟练掌握门静脉插管技术。随着操作熟练，成功插管将变得容易，并可由一人独立完成。需要注意的是，使用体重较大的动物可增加门静脉的直径，从而有利于操作。当门静脉后壁被穿破时，再次进入静脉在技术上较为困难，尤其是对于初次操作者而言，因此建议更换新的动物重新开始。
HBSS 和胶原酶溶液的 pH 值应调整至 7.4，并在 40 °C 预热，以使蠕动泵输出的温度达到 37 °C。需要用含 EGTA 的 EGTA/HBSS ...

纳米毒理学研究领域旨在表征纳米颗粒的生物学效应。基于纳米颗粒的毒理学研究 体内 检查仍然是最准确的方法。然而，其应用受到成本、人力和时间需求的限制1作为替代方案， 体外 由于其操作简便且易于实现高通量，已广泛应用于各类检测 体外 检测平台2 - 因而扩展了所测试条件的数量。大多数纳米毒理学研究均采用 体外 使用永生化细胞系进行的实验。然而，人们对于将这些实验结果外推至 体内 毒理学效应3确实，永生化细胞系的特性可能与其来源组织存在显著差异， 例如 遗传转化4关键形态特征的退化5细胞极性丧失6 以及功能改变，例如炎症介质的调控7.
库普弗细胞是体内数量最多的巨噬细胞群体，通过附着于肝窦壁而直接与血液接触。作为网状内皮系统（RES）的一部分，这些巨噬细胞负责捕获循环中的纳米颗粒，因此是研究纳米颗粒毒性的理想模型。体内8 和体外9关于库普弗细胞暴露于纳米颗粒后引发炎症反应的研究已有报道。库普弗细胞还参与多种肝脏疾病的发生发展，如酒精性肝病10、肝纤维化11和病毒性肝炎12。已有研究报道，分离得到的库普弗细胞有助于揭示肝脏功能紊乱过程中涉及的细胞机制13,14。
已有多种方法被报道用于分离和纯化库普弗细胞。细胞分离可通过机械或酶解离实现15。胶原酶消化在保持库普弗细胞功能完整性方面具有优势，同时可获得较高的库普弗细胞得率16。已有多种实验方法被用于将库普弗细胞与其他肝细胞群体分离，这些方法在复杂性和成本上各不相同。例如，可通过免疫亲和法17、流式电泳法18、选择性贴壁法16或离心技术16来实现库普弗细胞的纯化，后者依据细胞的大小和密度进行筛选。可结合使用上述方法以提高细胞群体的纯度16。目前尚无关于库普弗细胞分离的理想方法的统一共识，因为最佳方法主要取决于具体应用和可用设备。然而，在纳米颗粒毒性检测的应用中，该技术的简便性、高得率以及对库普弗细胞功能的保留显得尤为适合。
本文报道的库普弗细胞分离方法基于两步灌注法，随后通过密度梯度纯化。该方法是在Smedsrød et al.16 建立的用于大鼠肝细胞分离的原始方案基础上改进而来。大多数已报道的研究均描述了从大鼠肝脏中分离库普弗细胞的方法。本文中，我们介绍一种从小鼠肝脏中高得率、高纯度分离库普弗细胞的方法。使用小鼠可降低实验成本，并允许同时处理多个肝脏，以获得足量的库普弗细胞用于纳米颗粒毒性测试。
在以下实验方案中，将Kupffer细胞与功能化碳纳米管（functionalized carbon nanotubes,f-碳纳米管（CNTs）。碳纳米管独特的理化性质——即 高长径比和大比表面积使碳纳米管成为有潜力的治疗和诊断载体。然而，人们也对碳纳米管的毒性问题提出了担忧19以及新方法的开发 体外 检测旨在加深对碳纳米管生物学效应的理解。库普弗细胞的毒性与细胞膜结构完整性的丧失有关，这通过细胞质酶LDH从细胞释放到上清液中的程度来衡量。因此，该方法的原理是去除已释放的LDH，测定细胞内剩余的LDH含量20优先采用此方法而非测定上清液中释放的LDH，因为上清液中碳纳米管的存在会干扰检测。21.
我们建议采用这种简单且经济高效的库普弗细胞分离方法，以获得大量具有功能活性的库普弗细胞。这使得能够在相关的原代巨噬细胞模型中，对多种纳米颗粒的毒性进行筛选。

<table><tbody><tr><td>戊巴比妥钠</td><td>Merial</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD1小鼠</td><td>Charles River&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>-</td><td>小鼠体重应在35至45克之间。建议使用雄性CD1小鼠，因其体重增长迅速（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;，7周龄的雄性CD1小鼠体重即超过35克）。建议提前联系动物供应商，以便安排提供年龄较大的动物。或者，也可在本单位饲养动物至所需体重。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HBSS（无Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;和Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;，含碳酸氢盐）&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>14175-053</td><td>HBSS必须无Ca&amp;nbsp;&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸（EGTA）四钠盐&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>E8145&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>也可使用EDTA，但EGTA的优势在于可选择性螯合Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES（1 M）&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>15630-056&amp;nbsp;</td><td>100 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>IV型胶原酶&amp;nbsp;</td><td>Worthington&amp;nbsp;</td><td>CSL-4&amp;nbsp;</td><td>建议测试不同批次的胶原酶，或至少向供应商说明该产品需适用于肝细胞分离&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;低糖DMEM&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>D5523&amp;nbsp;</td><td>500 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI（含丙酮酸钠和Glutamax）&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>12633-012&amp;nbsp;</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>15140-122</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>胎牛血清&amp;nbsp;</td><td>First-Link&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>60-00-850&amp;nbsp;</td><td>500 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>台盼蓝溶液&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>T8154&amp;nbsp;</td><td>100 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>包被二氧化硅颗粒溶液（Percoll）</td><td>GE Healtcare&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>17-0891-02&amp;nbsp;</td><td>Percoll&amp;reg;非常稳定，可保存数年&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1×磷酸盐缓冲液&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>10010-023</td><td>500 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>10×磷酸盐缓冲液&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>70011-036</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>二甲基亚砜&amp;nbsp;</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>D/4120/PB08&amp;nbsp;</td><td>500 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>LDH试剂盒（CytoTox 96）&amp;nbsp;</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>G1781&amp;nbsp;</td><td>避光保存&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>无酚红DMEM</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>31053-028&amp;nbsp;</td><td>500 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>F4/80抗体（Alexa 488）</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA497A488</td><td>无需稀释，直接用于流式细胞术</td></tr><tr><td>荧光微球</td><td>Sigma</td><td>L2778</td><td>乳胶微球，胺基修饰聚苯乙烯，红色荧光。1 ml</td></tr><tr><td>试剂名称</td><td>公司&amp;nbsp;</td><td>货号&amp;nbsp;</td><td>备注/说明&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>蝶形采血套装（23 G/305 mm长管）&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>367288</td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器（0.22 &amp;mu;m 蓝边）&amp;nbsp;</td><td>Minisart&amp;nbsp;</td><td>16534-K&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>离心管（50 ml 蓝盖）&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences, Falcon&amp;nbsp;</td><td>35 2070&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（90 × 15 mm）&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BSN 101VR20&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m 细胞筛&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BD&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵&amp;nbsp;</td><td>Watson Marlow&amp;nbsp;</td><td>SciQ 300&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>每次使用前后用无菌PBS和70%乙醇冲洗管路。</td></tr><tr><td>24孔板</td><td>Corning&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>96孔板&amp;nbsp;</td><td>Corning&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>离心机&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>BMG Labtech</td><td>FLUOstar Omega</td><td></td></tr><tr><td>血管夹</td><td>Hammacher GmbH&amp;nbsp;</td><td>Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051</td><td>血管夹可在灌流过程中夹住插入23 G针头的血管，无需手动持夹。网址：(http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>流式细胞术管</td><td>BD Biosciences, Falcon&amp;nbsp;</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管（1.5 ml）</td><td>Elkay</td><td>&amp;nbsp; 000-MICR-150</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮</td><td>BD Biosciences, Falcon</td><td>353086</td><td>用剪刀剪去刀片两端，以便在24孔板中刮取细胞。</td></tr><tr><td>试剂名称</td><td>公司&amp;nbsp;</td><td>货号&amp;nbsp;</td><td>备注/说明&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;EGTA（乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸）/HBSS（Hank平衡盐溶液）溶液&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>含0.5 mM EGTA和25 mM HEPES的HBSS。调节pH至7.4。每灌流一个肝脏准备50 ml。&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胶原酶溶液&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>含100 U/ml IV型胶原酶、15 mM HEPES和1%青霉素/链霉素（v/v）的低糖DMEM。调节pH至7.4。每灌流一个肝脏准备100 ml。加入胶原酶后，建议将溶液预热30分钟再使用，以确保胶原酶活性达到最佳。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>枯否细胞分离培养基&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>含1%非必需氨基酸（v/v）、1% Glutamax&amp;reg;（v/v）和1%青霉素/链霉素（v/v）的RPMI。每1-3个肝脏至少准备100 ml。&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>枯否细胞培养基&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸（v/v）、1% Glutamax&amp;reg;（v/v）和1%青霉素/链霉素（v/v）的RPMI。每1-3个肝脏至少准备100 ml。&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SIP（等渗包被二氧化硅颗粒溶液）</td><td></td><td></td><td>将1.7 ml 10×磷酸盐缓冲液&amp;nbsp;与15.3 ml Percoll&amp;reg;混合，得到17 ml SIP。</td></tr><tr><td>25% SIP溶液&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>将5 ml SIP与15 ml 1×磷酸盐缓冲液&amp;nbsp;&amp;nbsp;混合</td></tr><tr><td>50% SIP溶液&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>将10 ml SIP与10 ml 1×磷酸盐缓冲液&amp;nbsp;混合</td></tr><tr><td>裂解缓冲液</td><td></td><td></td><td>含0.9% Triton X-100的DMEM培养基</td></tr><tr><td>PBS/BSA溶液</td><td></td><td></td><td>新鲜配制pH 7.4的磷酸盐缓冲液，含1%牛血清白蛋白。&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

库普弗细胞分离用于纳米颗粒毒性检测

Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing

绝大多数 体外 纳米毒理学研究因其实用性而常使用永生化细胞系。然而，纳米颗粒毒性检测在永生化细胞系与原代细胞中的结果存在差异，凸显了有必要扩大原代细胞的应用 体外 检测方法。本方案描述了小鼠肝脏巨噬细胞（称为库普弗细胞）的分离及其在纳米颗粒毒性研究中的应用。库普弗细胞是体内最丰富的巨噬细胞群体，属于网状内皮系统（RES），负责捕获循环中的纳米颗粒。本文报道的库普弗细胞分离方法基于两步灌注法，随后通过密度梯度进行纯化。该方法结合胶原酶消化与密度梯度离心，改编自Smedsrød最初建立的方案。 等专为大鼠肝细胞分离设计，可提供高产量（高达 14 x 106 每只小鼠的细胞数）和高纯度（&#62;95%）的库普弗细胞。该分离方法无需复杂或昂贵的设备，因此在操作复杂性与细胞得率之间实现了理想的平衡。使用体重较大的小鼠（35–45 g）可提高细胞分离得率，同时也显著便利了门静脉插管操作。功能化碳纳米管的毒性 f-在此模型中，通过改良的LDH检测法测定CNTs。该方法通过检测库普弗细胞与样品共孵育后细胞膜结构完整性的缺失来评估细胞活力 f-碳纳米管。由其诱导的毒性 f- 使用该检测方法可对碳纳米管（CNTs）进行一致性测量，表明分离的库普弗细胞可用于纳米颗粒毒性测试。此类模型有助于增进对纳米毒理学的整体理解，从而提高临床转化过程中纳米颗粒筛选的效率。

未纯化的实质细胞数量一致，每只小鼠可获得8至14 × 106个细胞（共进行了17次分离）。每次小鼠细胞分离所得细胞足以接种16至28个孔。台盼蓝染色显示细胞活力约为95%。库普弗细胞在37 °C孵育30分钟内呈圆形，与其不完全贴壁的形态相关（图4A）。在孵育4小时及之后，细胞开始铺展并形成细胞簇。
随后对库普弗细胞进行表征，以确认其纯度和吞噬活性。使用F4/80抗体对细胞进行染色，以检测库普弗细胞的纯度。流式细胞术分析显示，库普弗细胞纯度高于95%（图4B）。细胞接种12小时后，与1 µm荧光微球共同孵育，以验证其摄取大颗粒的能力。流式细胞术分析显示，超过85%的库普弗细胞具有吞噬活性，即能够摄取1 µm微球（i.e.，图4C）。培养72小时后，40%的库普弗细胞仍具有吞噬活性，表明库普弗细胞部分丧失了其吞噬功能。
将库普弗细胞与 f-CNTs 共孵育 24 小时和 7...

肝脏巨噬细胞，称为库普弗细胞，负责捕获循环中的纳米颗粒。本文介绍一种高纯度和高得率的库普弗细胞分离方法。此处采用改良的乳酸脱氢酶（LDH）检测法来测定碳纳米管在库普弗细胞中诱导的毒性。

绝大多数体外纳米毒理学研究出于实用性考虑，均采用永生化细胞系。然而，纳米颗粒的研究结果……

以下实验的总体目标是大量分离和纯化小鼠库普弗细胞，以研究纳米颗粒的毒性。该过程通过使用 H-B-S-S-E-G-T-A 溶液和胶原酶溶液灌注小鼠肝脏，轻柔地消化肝组织。随后，通过密度梯度离心和选择性贴壁法对肝细胞进行纯化，从而获得高纯度的库普弗细胞培养物。然后进行流式细胞术分析，以确认杯状细胞的纯度及其酸性特性。获得的结果表明，功能化碳纳米管的毒性可以在杯状细胞中进行测定。基于改良的乳酸脱氢酶释放实验（L-D-H-S-A）结果支持该模型可用于纳米颗粒毒性测试。我们今天要向您展示的方法有助于回答纳米毒理学领域的关键问题，例如评估新开发的药物载体的毒性。这一点非常重要，因为目前使用的大多数永生化细胞系与其来源组织具有显著不同的特性。该方法的可视化演示至关重要。如果该方法成功实施，将能够获得高产量和高纯度的角膜上皮细胞，这些细胞可作为模型用于筛选多种纳米颗粒的毒性。根据随附文本方案中列出的材料与试剂表，将所有试剂新鲜配制后，将 E-G-T-A-H-B-S-S 溶液和胶原酶溶液在 40 摄氏度下预热 30 分钟，用 70% 乙醇冲洗泵的软管。然后将 40 毫升 E-G-T-A-H-B-S-S 溶液倒入置于水浴中的离心管中，并用预热的 E-G-T-A-H-B-S-S 溶液冲洗泵的软管。按照文本方案处死一只 CD1 小鼠后，剃除腹部毛发，并用 70% 乙醇对腹部表面进行消毒。通过夹捏脚趾确认麻醉效果。切开腹腔，将肠道向腹部左侧横向移开，暴露门静脉和下腔静脉。使用 E-G-T-A-H-B-S-S 溶液，以每分钟一至三毫升的速度启动泵，用 23 号蝶形针穿刺门静脉，夹闭已插管的门静脉段，然后翻转开口小鼠腹部表面的弯头镊。灌注开始后的前30秒内，肝脏应迅速变苍白，此时需快速切开下腔静脉下部，以避免肝脏内压力过高，并在灌注第一分钟内逐渐将流速提高至每分钟7毫升。当离心管中剩余的EGTA-HBSS溶液少于5毫升时，加入40至50毫升胶原酶A溶液，然后在30秒内将流速逐渐增加至每分钟10毫升。使用镊子定期对下腔静脉施加压力，持续10至32秒，使肝脏膨胀。这将有助于细胞解离，并缩短胶原酶灌注时间。当离心管中胶原酶溶液剩余不足10毫升时，向管中额外加入40至50毫升预热的胶原酶溶液。当灌注量达到 70 至 80 毫升时，用镊子轻轻按压肝脏表面，若出现凹陷痕迹，表明肝细胞已解离。将肝脏完整地从腹腔中取出，并置于含有 20 至 30 毫升细胞分离培养基的离心管中。将肝细胞置于冰上最多三小时，并可合并最多三个肝脏进行细胞纯化。将一个灌流后的肝脏放入含有15毫升细胞分离用培养基的培养皿中，使用剪刀或镊子操作。撕破肝脏的包膜，使所有肝细胞释放到培养基中。将溶液通过100微米细胞滤筛过滤至离心管中。随后在4°C条件下以50 ×g离心2分钟。实质细胞将位于沉淀中，而非实质细胞则位于上清液中。将上清液收集到一个干净的离心管中，在50 ×g 条件下离心2分钟。重复操作，共进行四次转移和离心。接下来进行离心。在1,350 ×g下离心15分钟。为沉淀非实质细胞，弃去上清液，将沉淀物重悬于10 mL用于细胞分离的培养基中，将非实质细胞悬液加入先前根据文本方案制备的不连续25%-50%等渗梯度液中，在无加速和无刹车条件下于850 ×g离心15分钟。使用10 mL血清移液管，从25% SIP组分内靠近25%-50% SIP界面处、呈浑浊的富集杯状细胞组分中吸取约12 mL液体。将细胞转移至含有35至40毫升细胞分离杯中的培养基中，轻轻混匀，然后在4°C条件下以1,350 ×g离心，使细胞沉淀。弃去上清液，加入5至10毫升预热的培养基，用血细胞计数板重悬细胞。计数细胞，并使用台盼蓝染色法测定细胞活力。将纯化的非实质细胞以每孔5×10⁵个细胞的密度接种于24孔板中。将细胞在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下孵育 30 分钟。然后轻轻吸去培养基。用预热的 HBSS 洗涤细胞，并更换为每孔 500 微升预热的新鲜细胞培养培养基。将细胞放回 37 摄氏度环境中至少 4 小时，以使细胞充分贴壁，然后再进行纳米颗粒处理。在根据文本方案完成对 C 细胞的纯度和吞噬活性表征，并与功能化碳纳米管（fcts）共孵育后，弃去上清液，每孔加入 200 µL 裂解缓冲液。在 37 °C 下孵育 30 至 60 分钟，进行剧烈的移液吹打，将裂解后的细胞收集至微量离心管中。然后以 20,000 ×g 离心 10 分钟，使细胞碎片沉淀，从而分离出被细胞摄取的 fcn ts。收集上清液至微量离心管中，并在 -20 摄氏度下保存。或者，将 50 微升上清液转移至 96 孔板中，并加入等体积的乳酸脱氢酶试剂盒中的底物混合溶液。设置三份空白孔，每孔包含 50 微升裂解缓冲液和 50 微升底物混合溶液。然后覆盖培养板，在室温下孵育 15 分钟，随后加入 50 微升终止液。最后，在酶标仪中于 490 纳米处读取吸光度，并使用以下公式计算细胞存活率百分比。该图显示，每只小鼠和三联体纯化的非实质细胞数量在八至十四乘以十的六次方个细胞之间。蓝色染色表明细胞活力约为95%。细胞在培养30分钟内贴壁并呈圆形，4小时后细胞开始铺展并形成如图所示的细胞簇。采用F四80抗体对细胞进行染色，以检测细胞纯度，经流式细胞术测定，细胞纯度高于95%。此外，在培养12小时后，流式细胞分析显示，85%的细胞具有吞噬酸性活性，表现为能够摄取1 µm荧光微球。然而，当培养时间延长至72小时时，仅40%的细胞仍保持吞噬活性，如图所示。与经功能化碳纳米管孵育24小时和72小时的细胞相比，其细胞形态与未处理细胞相似。相比之下，以10% DMSO作为阳性对照孵育的细胞在改良LDH检测分析中呈现坏死形态；经10% DMSO处理24小时和72小时的细胞杯显示毒性显著升高。相比之下，fcts仅在细胞暴露于50微克/毫升浓度达72小时时，才引起轻微但显著的细胞活力下降。采用该方法，可利用分离的ke细胞对其他基于细胞的SC及各类纳米颗粒进行测试。这能够在减少动物使用的同时获得可靠的数据。我们希望该技术能够帮助纳米科技心理学领域的研究人员，为日益增多的新型纳米载体的安全性筛选铺平道路。

kupffer-cell-isolation-for-nanoparticle-toxicity-testing

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

枯否细胞分离的纳米粒子毒性测试

本文介绍了一种从大鼠肝细胞原代培养中获取巨噬细胞的新方法。该方法利用巨噬细胞在培养过程中的增殖特性，随后通过振荡培养瓶并利用巨噬细胞对塑料培养皿的特异性贴附能力进行纯化。该技术无需复杂设备和操作技能，即可高效地获得肝脏巨噬细胞。...

一种从成年肝细胞混合原代培养物中分离巨噬细胞的简单高效方法

本文描述了分离小鼠肺泡巨噬细胞（肺部固有先天免疫细胞）并检测其在与聚酐纳米颗粒共培养后活化反应的实验方案。...

收获小鼠肺泡巨噬细胞及评估聚酸酐纳米颗粒诱导的细胞活化

在本视频中，我们演示从小鼠肝脏中分离库普弗细胞（即肝脏巨噬细胞）的方法。通过灌注消化液对肝脏进行处理，随后进行密度梯度离心分离。所获得的贴壁库普弗细胞可用于后续分析。...

小鼠库普弗细胞的分离与培养

本视频演示了从人肝组织中分离淋巴细胞（包括自然杀伤细胞或NK细胞）以进行选择性扩增的方法。通过酶消化和机械消化，随后进行密度梯度分离，可有效促进包括NK细胞在内的淋巴细胞分离。所获得的淋巴细胞可用于NK细胞的选择性扩增。...

从肝组织中分离自然杀伤细胞以实现选择性扩增

通过流式细胞术分析纳米颗粒与免疫细胞特定亚群的相互作用。...

通过流式细胞术检测荧光纳米颗粒与主要免疫细胞亚群的相互作用

采用氧化铜纳米颗粒（CuO-NPs）处理生产性渗滤液（PBW），并在培养的人源细胞中评估其细胞毒性。本实验方案的目的是将天然环境样品整合到细胞培养体系中，以评估经CuO-NP处理后毒性变化情况。...

氧化铜纳米颗粒去除铀中痕量元素 原位 回收渗出液及其对细胞活力的影响

本文描述了一种从同一供体分离人类肝细胞和非实质肝脏细胞的技术。不同类型的肝脏细胞构成了功能性肝脏模型和组织工程的基础。该新方法旨在以高得率和高活性分离肝脏细胞。...

原代人肝细胞及其主要非实质肝细胞群的分离方案

小胶质细胞（大脑的免疫细胞）可作为替代性生物传感器，用于确定纳米颗粒对神经毒性的影...

小胶质细胞作为替代性生物传感器用于评估纳米颗粒的神经毒性

该方案旨在用于体外构建先进的三维肝细胞培养模型，可对纳米材料在急性或长期重复剂量暴露条件下相关的遗传毒性危害进行更符合生理状况的评估。...

用于长期纳米材料暴露后体外遗传毒性检测的先进三维肝脏模型

本文旨在提供一种从三阴性乳腺癌同源小鼠模型中分离和培养原代癌症相关成纤维细胞的实验方案，并介绍其在针对肿瘤微环境的新型纳米颗粒临床前研究中的应用。...

从小鼠同源性乳腺癌模型中分离原代癌症相关成纤维细胞用于靶向纳米颗粒研究

本文介绍一种非遗传学方法，利用从稳态外周血中分离的单个核细胞生成人自体肝类球体。...

用于肝脏疾病研究的外周血来源人肝类球体

学习从小鼠肝脏中分离纯化枯否细胞的方法，用于研究碳纳米管等纳米粒子的毒性。该方法通过肝脏灌注、密度梯度离心和选择性贴壁获得高纯度细胞，为纳米毒理学研究提供可靠的体外模型。

库普弗细胞分离用于纳米颗粒毒性检测

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