枯否细胞分离的纳米粒子毒性测试
2015年8月18日
肝巨噬细胞，称为库普弗细胞，负责捕获循环纳米颗粒。我们在这里描述了一种高细胞纯度和产量的 Kupffer 细胞分离方法。这里使用改良的 LDH 测定法来测量碳纳米管在 Kupffer 细胞中诱导的毒性。
以下实验的总体目标是分离和纯化小鼠杯中的大量细胞，以研究纳米颗粒的毒性。这是通过用 H-B-S-S-E-G-T-A 溶液和胶原蛋白（一种温和消化肝组织的溶液）灌注小鼠肝脏来实现的。接下来，通过密度、离心和选择性粘附纯化肝细胞，以获得细胞纯化杯的培养物。
然后进行流式细胞术分析，以确认细胞杯的纯度和 F 酸性。获得的结果表明，功能化碳纳米管的毒性可以用细胞杯来测量。基于改进的 L-D-H-S-A 支持，该模型可应用于纳米颗粒毒性测试。
我们今天旨在向您展示的方法可以帮助回答纳米毒理学领域的关键问题，例如评估最近开发的药物载体的毒性，这非常重要，因为使用的大多数永生化细胞系都显示出与它们来源的组织截然不同的特性。这种方法的可视化演示至关重要。如果该方法成功执行，将获得高产量和高纯度的 ke 细胞，然后可以将其用作模型来筛选一系列纳米颗粒的毒性。
新鲜制备随附文本方案所含材料和试剂表中列出的所有试剂后，在 40 摄氏度下加热 E-G-T-A-H-B-S-S 溶液和胶原酶溶液 30 分钟，使用 70% 乙醇冲洗泵软管。然后将 40 毫升 E-G-T-A-H-B-S-S 溶液倒入浸入水浴中的离心管中，并使用预热的 E-G-T-A-H-B-S-S 冲洗泵软管。对 CD one 小鼠实施安乐死后，根据文本方案，剃掉腹部毛发并使用 70% 乙醇对腹部表面进行消毒。
通过捏脚趾确认麻醉。切开腹腔，通过将肠道横向移动到腹部左侧，露出门静脉和下腔静脉。用 E-G-T-A-H-B-S-S 溶液以每分钟 1 到 3 毫升的速度启动泵，并用 23 号蝶针插管门静脉，夹住门静脉的插管部分，然后在打开的小鼠腹部表面翻转正弦镊子。
肝脏应在灌注的前 30 秒内变得苍白，迅速切开下腔静脉的下部，以避免肝脏中压力过大，并在灌注的第一分钟内逐渐增加流速至每分钟 7 毫升。当离心管中残留的 E-G-T-A-H-B-S-S 溶液少于 5 毫升时。在溶液中加入 40 至 50 毫升胶原蛋白，然后在 30 秒内逐渐将流速增加到每分钟 10 毫升。
使用镊子定期对下腔静脉施加压力 10 至 32 次，使肝脏肿胀。这将改善细胞解离并缩短胶原酶的灌注时间。当离心管内残留的胶原酶溶液少于 10 毫升时，向离心管中额外添加 40 至 50 毫升预热胶原酶溶液。
然后，一旦灌注了 70 至 80 毫升，使用镊子对表面施加轻微的压力。凹陷标记表示肝细胞已解离。将肝脏从腹腔中取出一块，放入装有 20 至 30 毫升杯子的离心管中，用于细胞分离。中等。
将肝细胞在冰上放置长达三个小时，并汇集最多三个肝脏进行纯化，以纯化细胞的杯子。将一个灌注的肝脏放入装有 15 毫升杯子的培养皿中用于细胞分离，用剪刀或镊子配制培养基。破裂闪闪发光的胶囊，并将所有肝细胞释放到培养基中。
通过 100 微米的细胞过滤器将溶液过滤到离心管中。然后将细胞悬液在 50 GS 和 4 摄氏度下离心 2 分钟。薄壁细胞将位于沉淀中，非薄壁细胞将位于上清液中。
将上清液收集在干净的离心管中，并以 50 g 离心 2 分钟。重复总共四次传输和旋转。接下来离心机。
上浆在 1， 350 GS 下放置 15 分钟。要沉淀非实质细胞，弃去上级并将沉淀重悬于 10 毫升杯子中用于细胞分离培养基，将非实质细胞溶液添加到先前根据文本方案制备的不连续 25 50% 等渗梯度中，并以 850 GS 离心 15 分钟，不要加速或中断。使用 10 毫升血清移液管吸出约 12 毫升富集杯，用于在 25% SIP 组分中靠近 25 50%SIP 界面的 25% SIP 组分中出现浑浊的细胞组分。
将细胞转移到含有 35 至 40 毫升杯子的离心管中，用于细胞分离、培养基并轻轻混合，然后在 1， 350 GS 和 4 摄氏度下离心以沉淀细胞，丢弃超级命名，并使用 5 至 10 毫升预热培养基用血细胞计数器重悬细胞。计数细胞并使用 trian 蓝染色测量活力板。在 24 孔板中以 5 倍/孔 10 至第 5 个细胞的密度在 24 孔板中纯化的非实质细胞。
将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 30 分钟。然后轻轻去除培养基。使用预热 HBSS 洗涤细胞，并用每孔 500 微升新鲜预热杯代替细胞培养基。
将细胞放回 37 摄氏度至少四个小时，让细胞粘附，然后再用纳米颗粒颗粒处理。在表征细胞 C 的纯度和吞噬活性并按照文本方案中概述与功能化碳纳米管或 fct 孵育后，弃去上清液，每孔加入 200 微升裂解缓冲液。在 37 摄氏度下孵育 30 至 60 分钟，进行剧烈移液，并将躺着的杯子收集在微量离心管中的细胞。
然后在 20， 000 GS 离心 10 分钟，以提取细胞碎片上细胞吸收的 fcn ts。将上清液收集到微量离心管中，并在负 20 摄氏度下储存。或者，将 50 μL 转移到 96 孔板中，并从乳酸脱氢酶试剂盒中加入等体积的底物混合物溶液。
包括一式三份的空白孔，其中包含 50 μL 裂解缓冲液和 50 μL 底物混合物溶液。然后盖上板并在室温下孵育 15 分钟，然后加入 50 μL 终止液。最后，在酶标仪中读取 490 纳米处的吸光度，并使用以下公式计算细胞活力百分比。
该图表明，纯化的非实质细胞的数量在每只小鼠和 trian 的 6 个细胞的 8 到 14 乘以 10 到 10 之间。蓝色染色显示大约 95% 的细胞活力。细胞贴壁杯在孵育后 30 分钟内呈圆形，4 小时后，细胞扩散并开始形成簇状，如图所示。
用 F four 80 抗体对细胞进行染色，以证明杯子的细胞纯度，通过流式细胞术测得细胞纯度高于 95%。此外，在培养 12 小时后，低位细胞术分析表明，85% 的细胞能够吸收 1 微米荧光珠，从而具有 PHA 酸性活性。然而，这个数字在培养 72 小时时下降，此时只有 40% 的细胞是吞噬细胞的，如图所示。
与初始细胞相比，与初始细胞相比，与功能化碳纳米管孵育 24 小时和 72 小时的细胞杯具有相似的形态。相比之下，用 10% DMSO 作为阳性对照孵育的细胞杯在对用 10% DMSO 处理 24 小时和 72 小时的改良 LDH 检测杯进行分析后显示坏死形态，相比之下，FCTS 仅在细胞暴露于 50 μg/mL/mL 72 小时时诱导细胞活力轻微但显着降低。按照这种方法，可以使用分离的 ke 细胞来测试其他基于细胞的 SC 和所有类型的纳米颗粒。
这样可以收集可靠的数据，同时最大限度地减少动物的使用。我们希望这项技术可以帮助纳米技术心理学领域的研究人员筛选许多正在开发的有前途的纳米载体的安全性。
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概述
本研究侧重于小鼠库普弗细胞的分离和纯化，以调查纳米粒子的毒性。采用肝脏灌流和密度离心的方法来实现高细胞纯度和产量。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 毒理学
背景
- 库普弗细胞是肝脏巨噬细胞，能捕获循环中的纳米粒子。
- 了解纳米粒子毒性对生物医学应用至关重要。
- 高纯度细胞分离技术对于准确的毒性测试至关重要。
- 修改后的LDH测定法是评估细胞毒性的可靠方法。
研究目的
- 从小鼠肝脏中分离和纯化库普弗细胞。
- 研究碳纳米管在这些细胞中的毒性。
- 验证库普弗细胞在纳米粒子毒性测试中的使用。
使用的方法
- 用H-B-S-S-E-G-T-A溶液灌流小鼠肝脏。
- 使用胶原酶溶液进行温和的肝组织消化。
- 密度离心用于细胞纯化。
- 流式细胞术分析以确认细胞纯度和功能性。
主要结果
- 成功获得高纯度的库普弗细胞培养物。
- 碳纳米管毒性在库普弗细胞中是可测量的。
- 修改后的LDH测定法有效评估了细胞毒性。
- 该模型支持进一步的纳米粒子毒性测试。
结论
- 分离方法为研究库普弗细胞提供了可靠的方法。
- 可以在这个模型中测试功能化碳纳米管的毒性。
- 研究结果有助于理解纳米粒子在肝脏中的相互作用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Isolating primary Kupffer cells addresses a key limitation in nanotoxicology where immortalized cell lines yield discrepant results, improving predictive confidence in nanoparticle safety assessment. This method supports target validation by providing a physiologically relevant model of liver macrophage function, critical for de-risking nanoparticle-based drug carriers. High-yield, high-purity isolation enables reproducible screening of nanomaterials, aligning with early discovery goals for translational biomarker alignment and mechanistic de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by modeling nanoparticle-Kupffer cell interactions in a disease-relevant system.
- Operational Value: Provides a purified primary cell source (>95% purity) for consistent target engagement and pathway clarification studies.
- Predictive Value: Supports lead identification by measuring functional outcomes like phagocytic activity and viability after nanoparticle exposure.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers a standardized biological system for quantitative LDH-based toxicity readouts, enabling reliable compound evaluation.
- Operational Value: Uses accessible equipment (centrifuge, perfusion pump) to ensure scalability and cross-lab reproducibility.
- Assay Readiness: Generates sufficient cell yield (up to 14×10⁶ cells/mouse) for multi-well plate screening of nanoparticle libraries.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges discovery and preclinical workflows by using primary cells that reflect human liver macrophage biology more closely than immortalized lines.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions through consistent toxicity measurement (e.g., LDH release) across nanoparticle doses and exposure times.
- Translational Continuity: Enables biomarker-aligned screening where Kupffer cell activation or dysfunction predicts in vivo nanoparticle clearance and safety.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, providing a reproducible assay for nanoparticle toxicity screening before preclinical commitment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on nanoparticle uptake and macrophage activation via flow cytometry confirmation of F4/80+ phagocytic cells.
- Screening: Enables assay standardization through density gradient purification and selective adhesion steps that yield homogeneous Kupffer cell populations.
- Analytics: Generates quantitative viability data via modified LDH assay, allowing dose-response modeling and cross-condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling RES-mediated nanoparticle capture, a key determinant of biodistribution and clearance.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation platform applicable to diverse nanomaterials (e.g., functionalized CNTs, drug carriers) across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by using primary cells that maintain native phagocytic and cytokine signaling functions.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized perfusion, digestion, and purification steps yielding >95% pure Kupffer cells.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early predictive confidence in nanoparticle biocompatibility, reducing late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of nanocarriers based on liver macrophage toxicity profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent surgery, perfusion techniques, and primary cell handling.
- Dependent on centrifugation equipment, cell strainers, and flow cytometry for validation.
- Necessitates standardization across teams for collagenase digestion times and gradient preparation to ensure consistency.
- Adaptation considerations include adjusting mouse weight (35-45 g) to optimize yield and cannulation success.
- Practical limitations include cell viability decline in culture (phagocytic activity drops from 85% to 40% over 72 hours), requiring timely assay execution.
