一种简单而有效的隔离混合原代培养成人肝细胞巨噬细胞的方法

以下实验的总体目标是从大鼠肝细胞的混合原代培养物中获得多种巨噬细胞培养物，而无需复杂的设备或技能。首先通过胶原酶灌注解离成年大鼠肝细胞，然后分离实质肝细胞组分来实现。接下来，将细胞在 T 75 组织培养瓶中与生长培养基一起孵育，以建立肝细胞的混合原代培养物。

然后在培养 10 到 12 天后，摇动培养瓶以促进巨噬细胞转移到塑料培养皿中，然后在短暂的孵育期后通过选择性粘附从中收获巨噬细胞。最后，可以从同一个 T 75 组织培养瓶中重复收获 6 个细胞中的 10 多个，间隔 2 到 3 天，持续两周以上。肝脏巨噬细胞的分离方法已经得到了很好的描述。

然而，前面的大多数方法都需要精密的设备，例如离心插画师和精湛的技术技能。在这里，我们提出了一种简单而新颖的方法，可以从成体包裹的肝细胞的混合原代培养物中获得足够数量和纯度的肝巨噬细胞，该方法不需要特殊设备或高级实验室技能。动物解剖、肝脏灌注和细胞制备将由国立动物卫生研究所的 Norco、Yamanaka 和 Miko yoshioka 医生演示。

然后，国立农业生物科学研究所的 Taketo Takeno 博士将展示从培养风险中分离和纯化肝巨噬细胞。那么让我们开始吧。为了准备大鼠肝脏的大量繁殖，首先要预热一瓶洗涤液和一瓶胶原酶溶液。

然后，通过皮肤捏合确认镇静后，将麻醉的成年雄性大鼠放入不锈钢锅中，并将 70% 乙醇喷洒在其腹部和胸部。接下来，用解剖剪刀在腹部中间切一个小口，然后剥开皮肤。然后用剪刀打开腹部，确认门静脉的位置。

接下来，将手术线穿过门静脉并松散地收紧线。然后用蚊夹夹住下阴道腔和肠系膜静脉的远端部分，以防止血液回流到肝脏。用剪刀剪开隔膜打开胸腔，用眼科剪刀在门静脉上做一个小切口后露出心脏，将一根两毫米的塑料导管插入静脉，并将导管周围的线牢牢拧紧。

在灌注系统中加载预热的洗涤液，然后将其连接到导管。在 C 2 中以每分钟 10 毫升的速度开始灌注。同时，用解剖剪刀在右心房墙上剪一个。

继续灌注 10 分钟，然后将灌注溶液换成胶原酶溶液并灌注 10 至 20 分钟。以每分钟 10 毫升的速度，在无菌烧杯中加入 25 毫升胶原酶溶液。然后取出并小心地将灌注肝脏放入烧杯中。

用剪刀将肝脏切成小块。将 75 毫升冷 MEM 添加到所得细胞悬液中。轻轻移液后，通过 100 微米的池过滤器过滤悬浮液。

要去除未消化的组织碎片中的结缔组织，请将滤液收集到 50 毫升锥形管中。将滤液转移到 50 mL 锥形管中，首先在 4 摄氏度下以 50 G 离心细胞 1 分钟，洗涤细胞 4 次。分离后，小心丢弃上清液，然后将沉淀重悬于冷 MEM 中，并在最后一次洗涤后再次旋转细胞。

肝细胞重悬于生长培养基中。现在将细胞接种在 5 至 10 T 75 组织培养瓶中，密度为 6.7 乘以 10 至每平方厘米的第四个细胞。将培养瓶放入培养箱中，每两到三天更换一次生长培养基。

培养一天后，实质肝细胞在培养瓶表面扩散，并显示出典型的多边形柯巴石状形态，具有一个或两个圆形细胞核。在培养的几天内，实质肝细胞失去其上皮细胞形态并转化为更扁平的成纤维细胞 大约第 6 天，相差、明亮的圆形巨噬细胞样细胞开始在成纤维细胞片上增殖。巨噬细胞样细胞的生长在第 12 天左右达到最高水平。

当成纤维细胞片开始退化时，巨噬细胞样细胞的数量在第 19 天左右下降。因此，在培养大约 7 到 10 天后，我们在重悬巨噬细胞后，通过倒动培养瓶 30 分钟，将细胞片上增殖的巨噬细胞悬浮到培养基中。用两个 T 75 培养瓶中的培养基播放每个 100 毫米非组织培养级塑料培养皿。

用生长培养基重新填充培养瓶，然后将其放回培养箱中。孵育期后将塑料培养皿孵育 30 分钟，吸出培养基并用 PBS 轻轻冲洗塑料培养皿 3 次，如图所示，最早在将巨噬细胞样细胞接种到培养皿表面后 10 分钟，而其他污染的成纤维细胞保持悬浮状态。PBS 冲洗后，获得高度纯化的巨噬细胞群。

如图所示，细胞在培养 40 分钟后获得典型的巨噬细胞形态，并且经常观察到有丝分裂细胞，如箭头所示。为了收集这种新的高度纯化的巨噬细胞群，将 1 毫升 LE Express 溶液收集到洗涤后的细胞中，并将培养皿放回培养箱中再放置 10 分钟。孵育期后，加入 9 毫升生长培养基，然后用细胞刮刀轻轻刮掉附着的巨噬细胞，转移到 15 毫升锥形管离心机中，弃去上清液。

加入 1 毫升生长培养基，用剧烈移液将重悬的细胞团块解离成单个细胞，用血细胞计数器计数细胞数，如图所示，6 个细胞中的 10 个以上可以从 T 75 培养瓶中重复收获，间隔 2 至 3 天，持续两周以上， 使每个 T 75 培养瓶的总细胞产量为 10 比 7。如这些图像所示，分离的细胞用针对大鼠巨噬细胞抗原（如 CD 68 或 ED one 和 CD 1 72 A 或 OX 41）的单克隆抗体进行免疫染色。这些细胞具有巨噬细胞的功能特性，例如 FITC 标记的微珠的活性吞噬作用。

在本视频中，我们介绍了一种从成年红肝细胞的混合原代培养物中获得巨噬细胞的简单有效的方法。我们的程序不需要复杂的设备或技能，但提供足够数量的纯巨噬细胞，可以从相同的黄铜培养物中重复收获。这种方法可以应用于其他哺乳动物物种。

感谢您观看视频，祝您未来的实验好运。干杯。