一种从成年肝细胞混合原代培养物中分离巨噬细胞的简单高效方法

以下实验的总体目标是从大鼠肝细胞的混合原代培养物中获得多种巨噬细胞培养物，且无需使用复杂的设备或技术。该目标首先通过胶原酶灌注法解离成年大鼠肝细胞，随后分离实质性的肝细胞组分来实现。接着，将细胞在T 75组织培养瓶中用生长培养基孵育，以建立肝细胞的混合原代培养物。

培养10至12天后，轻轻振荡培养瓶，以促进巨噬细胞转移到塑料培养皿中，随后通过短时间孵育后的选择性贴壁法收集细胞。最后，可在两周以上的时间内，每隔两到三天从同一T75培养瓶中重复收获超过10的六次方个细胞。肝脏巨噬细胞的分离方法已有详尽描述。

然而，以往大多数方法需要复杂的设备（如离心机）以及精细的技术操作。本文介绍一种简单且新颖的方法，可从成年包裹肝细胞的混合原代培养物中获得数量充足、纯度较高的肝巨噬细胞，且无需特殊设备或高级实验技能。动物解剖、肝脏灌注及细胞制备过程将由国家动物卫生研究所的 Norco、Yamanaka 和 Miko yoshioka 博士进行演示。

接下来，日本农业生物科学研究所的Dr. Taketo Takeno将展示如何从培养风险中分离和纯化肝巨噬细胞。现在让我们开始。为准备大鼠肝脏的灌注，首先将一瓶洗涤液和一瓶胶原酶溶液预热。

然后，通过夹捏皮肤确认麻醉效果后，将一只已麻醉的成年雄性大鼠置于不锈钢托盘中，并向其腹部和胸部喷洒70%乙醇。接着，用解剖剪在腹部中央做一个小切口，并将皮肤向两侧推开。随后用剪刀打开腹腔，确认门静脉的位置。

接下来，将手术线穿过门静脉下方并轻轻收紧。然后用蚊式钳夹闭下腔静脉和肠系膜静脉的远端，以防止血液反流至肝脏。用剪刀剪开膈肌以打开胸腔，并用眼科剪在门静脉上做一小切口后暴露心脏，将一根2毫米的塑料导管插入静脉中，并将手术线在导管周围牢固扎紧。

将预热的灌注洗涤液装入灌注系统，然后将其连接至导管。以每分钟10毫升的流速开始在C两处进行灌注。同时，使用解剖剪在右心房壁上做一切口。

继续灌注10分钟，然后将灌注液更换为胶原酶溶液，再灌注10至20分钟。以每分钟10毫升的速度，将25毫升胶原酶溶液注入无菌烧杯中。随后取出灌注后的肝脏，并小心地放入烧杯中。

用剪刀将肝脏剪成小块。向所得细胞悬液中加入75毫升冷MEM。轻轻吹打混匀后，将悬液通过100微米细胞滤网过滤。

为了去除未消化组织碎片中的结缔组织，将滤液收集到50毫升锥形管中。将滤液转移至50毫升锥形管，并通过以下步骤洗涤细胞四次：首先在4摄氏度下以50 ×g离心1分钟使细胞沉淀。离心结束后，小心弃去上清液，然后将沉淀重悬于冷的MEM培养基中，并在最后一次洗涤后再次离心沉淀细胞。

用生长培养基重悬肝细胞。随后将细胞以每平方厘米6.7×10⁴个细胞的密度接种至5到10个T75组织培养瓶中。将培养瓶置于培养箱中，并每隔两到三天更换一次生长培养基。

培养一天后，实质性肝细胞在培养瓶表面铺展，呈现典型的多边形、类似铺路石的形态，含有一到两个圆形细胞核。培养数天内，实质性肝细胞逐渐失去上皮细胞形态，转变为更为扁平的成纤维样细胞。大约在第6天，相差显微镜下可见明亮的圆形、类似巨噬细胞的细胞开始在成纤维样细胞层上增殖。类似巨噬细胞的细胞增殖在第12天左右达到高峰。

当成纤维细胞层在第19天左右开始退化时，类巨噬细胞的数量会下降。因此，在培养约7至10天后，将巨噬细胞重新悬浮，通过来回摇动培养瓶30分钟，使在细胞层上增殖的巨噬细胞释放到培养基中。将两个T75培养瓶中的培养基加入每个100毫米非组织培养级塑料培养皿中。

用培养基重新填充培养瓶，并将其放回培养箱中。在培养结束后，将塑料培养皿继续孵育30分钟；随后吸去培养基，并用PBS轻轻冲洗培养皿三次，如图所示，在接种巨噬细胞样细胞后仅10分钟即可进行此操作，此时贴附于培养皿表面的是巨噬细胞样细胞，而其他污染性的成纤维样细胞仍处于悬浮状态。经过PBS冲洗后，即可获得高度纯化的巨噬细胞群体。

如图所示，细胞在培养40分钟后呈现出典型的巨噬细胞形态，箭头所示为经常观察到的有丝分裂细胞。为收集这一新获得的高纯度巨噬细胞群体，向洗涤后的细胞中加入1毫升trip LE Express溶液，并将培养皿放回培养箱中继续孵育10分钟。孵育结束后，加入9毫升生长培养基，然后用细胞刮轻轻刮下贴壁的巨噬细胞，转移至15毫升锥形管中，离心后弃去上清液。

加入1毫升培养基，通过剧烈吹打将重悬的细胞团块解离为单个细胞，使用血细胞计数板对细胞数量进行计数，如图所示，从一个T75培养瓶中可反复每2至3天收获超过10个六孔板量的细胞，持续超过两周，总细胞产量可达每T75培养瓶10的7次方个。如图中所示，分离得到的细胞经免疫染色检测，可表达针对大鼠巨噬细胞抗原（如CD68或ED1以及CD172A或OX41）的单克隆抗体。这些细胞具有巨噬细胞的功能特性，例如能够有效吞噬FITC标记的微珠。

在本视频中，我们介绍了一种从成年红肝细胞的混合原代培养物中获取巨噬细胞的简单高效方法。该方法无需复杂的设备或技术，即可从同一培养物中反复获得足量的纯化巨噬细胞。此方法可应用于其他哺乳动物物种。

感谢观看本视频，祝您未来的实验顺利。干杯。