Name: 使用急性海马脑片啮齿动物突触标记/捕获和交叉捕获的研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: 学习使用啮齿动物急性海马脑片研究突触标记、捕获与交叉捕获机制。本方法通过电生理记录CA1锥体神经元场电位，揭示长时程可塑性与记忆巩固的分子基础，为神经科学研究提供关键技术。

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本视频文章由Cerebos Pacific Limited赞助。本研究得到新加坡国家医学研究委员会协作研究基金（NMRC-CBRG-0041/2013）和教育部学术研究基金（MOE AcRF- Tier 1 - T1-2012 Oct -02）的支持。

所有动物实验程序均经新加坡国立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。
1. 人工脑脊液（ACSF）的制备
<ol>
	<li>配制人工脑脊液（ACSF），其成分为（单位：mM）124 NaCl、3.7 KCl、1.0 MgSO4·7H2O、2.5 CaCl2·2H2O、1.2 KH2PO4、24.6 NaHCO3 和 10 D-葡萄糖。当用 95% O2 和 5% CO2 混合气（碳合气）饱和吹气时，确保 ACSF 的 pH 值维持在 7.2–7.4 之间21。该 ACSF 用于组织分离、脑片制备以及电生理记录期间的灌流。&#160; 
	注意：用于测量和盛装 ACSF 的器具必须清洁。使用不洁器具可能导致溶液浑浊或沉淀物形成。所有配制过程均应使用去离子水。</li>
	<li>在容量瓶中配制 2 L 不含 NaHCO3 和 D-葡萄糖的 10 倍浓缩 ACSF 储存液。按以下顺序将试剂加入去离子水中：NaCl（144.96 g）、KCl（5.52 g）、MgSO4·7H2O（4.92 g）、CaCl2·2H2O（7.56 g）、KH2PO4（3.28 g），然后加水定容至 2 L。使用磁力搅拌器持续搅拌至少 30 分钟&#160;，以确保所有试剂完全溶解。将储存液保存于 4 °C，并在两周内使用完毕。</li>
	<li>在进行组织分离和实验前，将 ACSF 储存液用容量瓶稀释，并加入所需量的 NaHCO3 和 D-葡萄糖。配制 1 L 工作液时，先加入 2.07 g NaHCO3 和 1.802 g D-葡萄糖，再将 100 ml 储存液稀释至 1 L。最终的 ACSF 溶液应澄清透明，无任何沉淀或未溶解颗粒。</li>
	<li>将约 200–300 ml ACSF 冰上预冷，用于组织分离过程。确保用于分离的 ACSF 温度保持在 2–4 °C。剩余 ACSF 用于电生理实验。所有 ACSF 溶液均需持续用碳合气（5% CO2、95% O2）饱和吹气。在等待 ACSF 冷却期间，准备分离操作区域和脑片孵育室。</li>
</ol>
2. 界面室的制备 &#160;
注意：用于孵育脑片并在电生理记录期间维持其活性的界面式脑片孵育室（图2B）由两个部分组成。下部腔室含有蒸馏水，由温度控制器维持在32 °C，并持续通入碳氧混合气（carbogen）进行鼓泡。
<ol>
	<li>打开温度控制器，并将其预设为 32 °C。通过进液管路通入蒸馏水，对上层腔室冲洗 10 至 15 分钟&#160;。放置网架前，确保上层腔室清洁。检查下层腔室中的水位，确保其约为总体积的 70%，并装有蒸馏水。</li>
	<li>将网架放入上层腔室中，为脑片提供支撑表面（图 2C）。调节出液管路，使灌流液液面充分润湿网架的整个区域。将盖子置于网架上方，以在上层腔室内维持湿润的碳氧混合气体环境。</li>
	<li>调节流速至 1 ml/min，并在整个脑片孵育期和实验过程中保持该流速。开始对新配制的 1x ACSF 进行碳氧混合气体饱和处理，并将进液管路浸入 ACSF 中。让 ACSF 持续通入碳氧混合气体 20 分钟&#160;，以确保其充分饱和，同时使上层腔室完全充满该溶液。</li>
</ol>
3. 急性海马脑片的制备 &#160;
注意：解剖方案包括（1）将动物脑组织取出并置于冰冷的人工脑脊液（ACSF）中，以及（2）分离并切片海马体。为保持神经元的活性，需迅速分离脑组织并放入冰冷的ACSF中，并在3至5分钟内完成包括切片在内的全部操作。
<ol>
	<li>将脑组织移入冷的ACSF中
	<ol>
		<li>按照图示方式摆放解剖工具 图1A按照使用顺序摆放工具，以方便解剖过程。开始前，确保所有解剖工具均已备齐。</li>
		<li>将经乙酸乙酯、无水乙醇和蒸馏水清洗过的剃须刀片安装到手动组织切片机上图1B），将其牢固固定，并确保刀刃边缘对齐均匀。用滤纸试切一次，以确认刀片已牢固固定。将滑动游标卡尺调至起始位置。</li>
		<li>使用二氧化碳（CO₂）安乐死动物2在诱导室中麻醉小鼠，使用绷带剪刀或断头器进行断头。用虹膜剪去除颅骨上方的皮肤和毛发。从后部剪开以去除脑干。沿颅骨右侧做一小切口，左侧做一较长切口。 
		注意！仅在用于实验的一侧做小切口，以避免损伤。插入剪刀时，确保施加的力向上，以避免损伤脑组织。</li>
		<li>使用骨钳从颅骨左侧开始向右侧小心去除颅骨，以暴露大脑皮层。可见一层薄薄的硬脑膜。用骨钳小心移除额骨骨板，并连同大部分硬脑膜一并去除。 
		注意！务必小心，以免硬脑膜切穿脑组织。</li>
		<li>如有残留的硬脑膜，需用解剖刀的扁平端特别清除大脑皮层与小脑交界处的硬脑膜。在执行步骤 3.1.5 和 3.1.6 时，应持续向上施加压力。 即， 远离大脑以避免损伤。用解剖刀轻轻将大脑舀入盛有冰冷且通入碳合气体的任氏液（ACSF，2-4 °C）的培养皿中，培养皿置于铝制冷却块上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>海马体的分离
	<ol>
		<li>使用解剖刀，沿正中线做一浅切口，并做一直线切口以去除小脑，再做另一切口以去除脑的前部（约四分之一）。</li>
		<li>使用镰状刮匙从正中线开始小心去除皮层，以暴露背侧海马。移除海马上方的皮层组织。用手指或角度镊子支撑脑组织。对海马连合进行小切口。从背侧海马开始，使用镰状刮匙以滚动动作轻柔地取出海马。 
		注意！操作需轻柔，避免拉伸和撕裂海马体。</li>
		<li>用弯形刮匙去除分离出的海马体周围的皮层和结缔组织。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>切取海马组织并将切片转移至界面式孵育室
	<ol>
		<li>将一片浸有ACSF的滤纸（Grade 1，30 mm）放置在手动切片机的切片台上。用工具舀取海马组织并置于滤纸上。移动滤纸，使海马相对于切片刀处于适当的方向，以便以约70°的角度对海马进行切片o 到纤毛。</li>
		<li>用折叠的滤纸（1号，85 mm）吸去海马组织周围多余的溶液，使海马保持微湿状态。开始对海马进行横向切片。从海马末端形态不清晰的区域切下并弃去最边缘的组织。</li>
		<li>将剩余组织切成400 µm厚的切片。使用带有柔软刷毛的刷子，以轻柔的拂拭动作从刀片上小心拾取海马切片，并将切片放入盛有冷的通入碳合气的ACSF的小烧杯中。尽快完成步骤3.3.1–3.3.3，因为海马组织暴露在空气中。 &#160; 
		注意：通常可切出海马体的三分之二，制备出4–6片形态清晰的脑片。</li>
		<li>使用剪去尖端2-3 cm的宽口洁净塑料巴氏吸管，将脑片轻柔转移至切片孵育室的网格上。用带弯曲尖端的小型注射器小心调整脑片在网格上的位置，使其便于电极定位和记录。检查确认脑片周围有足够人工脑脊液（ACSF）浸润，但未完全浸没或漂浮。图2C-D)。盖上培养 chamber，将脑片孵育 2–3 小时。 &#160; 
		注意：健康脑片中的锥体细胞层应呈现一定的透明度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. CA3-CA1 突触反应的记录 &#160;
注意：用于场电位记录的电生理装置设置如图2A所示。如果在正确接地后仍存在超出控制的电干扰，强烈建议使用法拉第屏蔽笼。市面上有多种不同类型的浸没式和界面式记录舱可供选择。然而，更推荐使用界面式记录舱，因为脑片在其中表现出更强健的突触反应。
<ol>
	<li>电极定位
	<ol>
		<li>开启将要使用的电生理设备（刺激器和放大器）。将刺激电极和记录电极安装并固定在显微操作仪的有机玻璃支架上。&#160; 
		注：我们使用电阻为5 MΩ的单极漆包不锈钢电极，同时用于刺激和记录。</li>
		<li>使用前，将这些电极插入拉制的玻璃毛细管中，并用环氧树脂胶固定，仅暴露电极尖端的一小部分（图2E）。这可以增强原本细长电极的机械强度，并有助于将其牢固地固定在电极夹持器中。</li>
		<li>在显微镜引导下，将刺激电极置于CA1区辐射层以刺激Schaffer侧支纤维，将记录电极置于CA1区顶树突区域以记录场兴奋性突触后电位（fEPSP）反应。&#160; 
		注：当电极接近脑片上方液面时会产生声音信号（前提是放大器连接了扬声器），有助于快速定位脑片表面。</li>
		<li>在突触标签与捕获实验中，根据实验需求，在记录电极两侧放置两个或三个刺激电极（S1、S2或S3），以刺激两个或多个独立但存在重叠的输入通路。刺激电极与记录电极之间的距离约为200 µm。</li>
		<li>如有必要，可在锥体细胞层（stratum pyramidale）放置另一个记录电极以记录群体峰电位（图3A）。当两个电极均接触脑片后，使用采集软件给予测试性刺激，以确认获得良好的fEPSP信号。&#160; 
		注：测试刺激采用双相恒流脉冲（脉冲持续时间0.1 msec/半波）。</li>
		<li>一旦获得稳定的fEPSP信号，使用操作仪的微调旋钮将电极缓慢下移约200 µm深度。让脑片恢复20分钟&#160;。使用成对脉冲易化方案测试各通路的独立性27,28。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>输入-输出关系
	<ol>
		<li>通过在不同电流强度范围内测量fEPSP斜率，确定每个输入通路的输入-输出关系（传入刺激强度 vs. fEPSP斜率）。测试范围为20 µA至100 µA。随后将每个通路的刺激强度设定为产生最大fEPSP斜率的40%。在整个实验过程中保持该强度不变。</li>
		<li>15–20分钟后开始记录基线。在此期间密切监测fEPSP斜率，若斜率波动超过设定值的10%，则重新调整刺激强度并重新建立基线。在继续实验前，至少记录30分钟&#160;或1小时的稳定基线。&#160; 
		注：对于测试或基线刺激，我们每5分钟给予4次0.2 Hz的双相恒流脉冲（每相0.1 msec），共四次扫描。这四次反应的平均斜率视为一次重复。信号由差分放大器滤波和放大，通过模数转换器数字化，并使用自定义软件在线监测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用刺激方案诱导LTP/LTD 
	注：根据是否依赖蛋白质合成，LTP和LTD均可分为早期和晚期形式；其中晚期LTP/LTD的维持需要翻译和/或转录过程[综述见4]。多种电刺激范式可特异性地诱导不同形式的LTP和LTD。
	<ol>
		<li>WTET：100 Hz，21个双相恒流脉冲（每相0.2 msec）。</li>
		<li>STET：每10分钟一次，共三组，每组1秒内100个脉冲（100 Hz）（脉宽&#160;每相0.2 msec）。</li>
		<li>在15分钟内给予900组脉冲。每组包含3个脉冲（脉宽0.2 msec），组内脉冲间隔50 msec（20 Hz）。&#160;组间间隔为1秒（总脉冲数2,700）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 切片室和灌流系统的清洗
<ol>
	<li>记录结束后，收集海马脑片用于进一步的生化分析，或按规定妥善弃置。关闭碳氧混合气体供应和温度控制器。用蒸馏水清洗碳氧混合气体鼓泡器。</li>
	<li>用刷子和蒸馏水彻底清洁网具。将装置冲洗15-20分钟。&#160;以更高的流速用蒸馏水冲洗。每隔3-4天更换一次腔室下部的蒸馏水，并定期使用3%过氧化氢溶液清洗腔室，以防止真菌生长。</li>
</ol>

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</ol>

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急性海马脑片是研究长时程增强（LTP）及其他功能可塑性过程（如STC和交叉捕获）的优良模型系统。该模型保留了海马环路的大部分层状结构网络，允许精确定位电极，同时提供一个开放平台，可在无血脑屏障干扰的情况下快速进行神经药理学操作。
本文描述了制备年轻成年大鼠急性海马脑片并利用其研究突触可塑性（STC）和交叉标记的实验方法。既往研究表明，动物的性别和年龄是电生理学研究中需要考虑的重要因素27,28。因此，本研究选用具有完全表达的成体受体功能的年轻成年动物（5至7周龄的雄性Wistar大鼠）23。已有研究指出，啮齿类动物左右侧海马之间的连接存在不对称性29，并且NMDA受体表达水平也存在显著差异34。为了与我们先前的长时程增强（LTP）研究保持一致，本实验采用右侧海马23,32。然而，只要保持一致性，任一侧海马均可使用。
与任何实验方案一样，进行组织分离和切片操作时，必须迅速完成，同时注意避免组织被拉伸、损伤、变干或缺氧。溶液的pH值、温度和离子成分的变化可能对切片的存活率和实验结果产生显著影响，因此应尽量避免这些变化。已有研究观察到，在制备过程中发生的谷氨酸受体依赖性钙释放可能不可逆地影响神经组织中的蛋白质合成35,36,37。使用手动组织切片器有助于最大限度减少此类影响，因为它比振动切片机（vibraslicer）能更快地完成操作。然而，许多实验室也通过采取必要的预防措施，有效地使用振动切片机来保持切片的活性。另一个需要考虑的重要因素是在开始实验前进行长时间的孵育。已有研究指出，这一过程对于恢复制备过程中受到干扰的切片代谢状态和激酶活化水平的稳定性至关重要23。这种稳定性是实现长期记录一致性的必要条件。我们再次强调这一观察结果，并建议孵育时间长达约3小时。
已知多种刺激参数可诱导长时程增强（LTP），但在不同情况下引发的分子机制可能并不相同（综述见38）。这可能影响LTP的持续时间及其他特性，进而影响突触标记与捕获实验的结果。因此，重要的是在实验实验室的特定条件下验证所采用的刺激范式以及诱导LTP的特征，并保持一致性。
我们通常不考虑具有非常大的突触前纤维群体放电且最大fEPSP小于0.5 mV的实验，记录过程中纤维群体放电发生显著变化的实验也被排除。此外，在进行双通路或三通路实验时，必须确保各通路之间的独立性，这可通过成对脉冲易化方案28来验证。
界面记录系统的一个缺点是在长时间记录过程中，由于记录室与周围环境之间的温度和湿度差异，电极上会形成冷凝水滴。这些水滴需要不时小心吸除，否则可能滴落到脑片上，导致信号干扰甚至信号丢失。我们通常在显微镜下用细长的滤纸灯芯小心吸除水滴，同时避免触碰电极。然而，最佳解决方案是使用集中加热系统，例如由爱丁堡大学研究人员开发的ETC系统。
最后需要指出的是，目前全球各地的实验室中存在多种用于制备海马脑片以满足不同实验目的的方法学。每种方法都具有各自的优点。研究人员需要根据实验的具体目标，仔细优化实验方案中的各个细微环节。我们希望本文能够有助于改进研究晚期关联过程（如STC和交叉捕获）的方法学中某些方面。

大脑中信息的编码与存储仍是神经科学领域最重要且备受关注的挑战。多年来，长时程增强（LTP）和长时程抑制（LTD）已成为记忆最主要的细胞相关机制1,2。这些依赖于神经活动的变化具有输入特异性和关联性，可导致神经元网络中记忆痕迹的稳定1,3,4。维持这两种突触可塑性形式需要合成可塑性相关产物（PRPs）5-10。突触特异性涉及新合成的蛋白质仅与特定的、表达LTP或LTD的激活突触相互作用，这对记忆至关重要。这一特异性可通过“突触标记与捕获”（STC）概念加以解释，即PRPs与近期处于活跃状态并被“标记”的突触相互作用11,12。STC过程为记忆的关联特性提供了细胞层面的理论框架，使我们能够理解短时可塑性如何以关联性和时间依赖的方式转化为持久的可塑性形式13。
在突触标签捕获（STC）过程中，某一输入通路中的强直刺激可诱导产生依赖蛋白质合成的晚期长时程增强（late-LTP），从而将另一独立输入通路中诱导出的不依赖蛋白质合成的早期长时程增强（early-LTP）强化为持续性的LTP13。短暂神经活动在局部突触设置“突触标签”，以及强神经活动诱导可扩散的蛋白质合成产物（PRPs）的生成，是STC过程中的两个关键事件13,14。近期被增强的“标记”突触对PRPs的捕获，是维持长时程增强的关键机制。已有大量研究证实了STC现象的存在15-17，并鉴定了可能的“标签”18和“PRPs”19。钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CaMKII）和细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）被认为是潜在的“标签”分子，而CaMKIV、蛋白激酶M（PKM）和脑源性神经营养因子（BDNF）则被认为是可能的“PRP”分子19-21。突触标签模型进一步扩展至包括LTP与LTD之间的正向协同相互作用，即“突触交叉标签”（synaptic cross-tagging）22。在突触交叉标签过程中，某一突触输入通路中的晚期LTP或LTD可将另一独立输入通路中相反类型的、不依赖蛋白质合成的早期LTD或LTP转化为持久形式，反之亦然22。
海马脑片制备是研究长时程突触可塑性最常用的模型23,24。关于突触标记和交叉标记概念的大部分认识均来源于对海马CA1区的研究，但由于技术复杂，许多实验室至今仍难以开展此类过程的研究。制备大鼠海马脑片并进行长时间稳定的晚期长时程增强（LTP）/长时程抑制（LTD）记录的实验条件，对于研究突触标记/交叉标记至关重要23,25,26。本文详细描述了利用急性分离的大鼠海马脑片进行稳定、长期场电位记录，以研究CA1区锥体神经元中STC和交叉标记等长时程可塑性过程的实验步骤。

<table><tbody><tr><td>一、解剖工具</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1. 绷带剪</td><td>KLS Martin，德国</td><td>21-195-23-07</td><td></td></tr><tr><td></td><td>B-Braun/Aesculap，德国</td><td>LX553R</td><td></td></tr><tr><td>2. 睫状剪</td><td>B-Braun/Aesculap，德国</td><td>BC140R</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>BC100R</td><td></td></tr><tr><td>3. 咬骨钳</td><td>World Precision Instruments (WPI)，德国</td><td>14089-G</td><td></td></tr><tr><td>4. 手术刀</td><td>World Precision Instruments (WPI)，德国；</td><td>500236-G</td><td></td></tr><tr><td></td><td>B-Braun/Aesculap，德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>BB73</td><td></td></tr><tr><td>5. 手术刀片#11</td><td>B-Braun/Aesculap，德国</td><td>BB511</td><td></td></tr><tr><td>6. 镰形洁治器</td><td>KLS Martin，德国</td><td>38-685-00</td><td></td></tr><tr><td>7. 弯头镊子</td><td>B-Braun/Aesculap，德国</td><td>BD321R</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8. 麻醉/诱导室</td><td>MIP Anesthesia Technologies（现为 Patterson Scientific），俄勒冈州</td><td>AS-01-0530-LG</td><td></td></tr><tr><td>二、人工脑脊液（ACSF）组分化学品</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1. 氯化钠（NaCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>2. 氯化钾（KCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>3. 七水合硫酸镁（MgSO4·7H2O）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>4. 二水合氯化钙（CaCl2·2H2O）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>5. 磷酸二氢钾（KH2PO4）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>6. 碳酸氢钠（NaHCO3）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>7. 无水D-葡萄糖（C6H12O6）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>三、电生理仪器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1. 显微镜</td><td>Olympus，日本</td><td>型号 SZ61</td><td></td></tr><tr><td>2. 温度控制器</td><td>Scientific Systems Design Inc.，加拿大</td><td>PTC03</td><td></td></tr><tr><td>3. 差分交流放大器</td><td>AM Systems，美国</td><td>型号 1700</td><td></td></tr><tr><td>4. 隔离脉冲刺激器</td><td>AM Systems，美国</td><td>型号 2100</td><td></td></tr><tr><td>5. 示波器</td><td>Rhode &amp; Schwarz</td><td>HM0722</td><td></td></tr><tr><td>6. 数模转换器</td><td>Cambridge Electronic Design Ltd.，剑桥，英国</td><td>CED-Power 1401-3</td><td></td></tr><tr><td>7. 脑片界面记录室</td><td>Scientific Systems Design Inc.，加拿大</td><td>BSC01</td><td></td></tr><tr><td>8. 蠕动泵</td><td>Ismatec，Idex Health &amp; Science，德国</td><td>REGLO-Analog</td><td></td></tr><tr><td>9. 碳氧混合气流量计</td><td>Cole-Parmer</td><td>03220-44</td><td></td></tr><tr><td>10. 光纤光源照明器</td><td>Dolan-Jenner Industries</td><td>Fiber Lite MI-150</td><td></td></tr><tr><td>11. 微操纵器</td><td>Marzhauser Wetzlar，德国</td><td>00-42-101-0000（MM-33）</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>00-42-102-0000（MM-32）</td><td></td></tr></tbody></table>

利用啮齿类动物急性海马脑片研究突触标记/捕获及交叉捕获

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

突触标记与捕获（STC）以及交叉标记是细胞水平上的两种重要机制，用于解释在特定时间范围内神经元中如何实现突触特异性和关联性。这些与长时程可塑性相关的过程是目前在细胞水平上研究记忆形成与维持机制的主要候选模型。STC 和交叉标记均包含两个连续的过程：（1）由特定刺激模式触发的突触标记的建立，以及（2）突触捕获，即突触标记与新合成的可塑性相关蛋白（PRPs）相互作用。目前对 STC 和交叉标记概念的理解主要来源于对海马 CA1 区的研究，由于技术上的复杂性，许多实验室仍难以开展此类研究。制备海马脑片以及记录稳定的晚期长时程增强（LTP）/长时程抑制（LTD）的实验条件，对于研究突触标记/交叉标记至关重要。本视频文章描述了利用大鼠急性海马脑片的稳定长时程场电位记录，研究 CA1 锥体神经元中 STC 和交叉标记等长时程可塑性过程的实验操作步骤。

该方法已用于研究成年大鼠急性海马脑片中长时程增强（LTP）和长时程抑制（LTD）的持久形式，以及突触标记和交叉捕获等关联性相互作用23。该技术在大鼠（Wistar品系）和多种小鼠品系的实验中均已被证明有效30,31。该方法已成功实现持续8-12小时的稳定LTP记录32。
通过弱四乙基化刺激一个输入通路（S1）所设置的“标记”，能够捕获由另一个独立但重叠的输入通路（S2）经强四乙基化刺激诱导产生的“持久性反应产物”（PRPs）（图3B，实心圆），从而将S1中原本会衰减的长时程增强效应（早期LTP）转化为持久形式（图3B，空心圆）（关于WTET诱导的早期LTP的比较，参见20,33）。被弱四乙基化刺激所设置的标记所捕获的PRPs，不一定必须来源于STET诱导的晚期长时程增强（late-LTP），也可以来源于SLFS诱导的晚期长时程抑制（late-LTD）。这种LTP与LTD之间的正向关联性相互作用被称为“交叉标记/捕获”。S1中由WTET诱导的早期LTP通过捕获S2中SLFS诱导的late-LTD所提供的PRPs而被增强为晚期LTP（图3C，空心圆）（图3C，实心圆）。在两种情况下，与各自基线相比，S1和S2中的显著增强或抑制效应均具有统计学意义（Wilcoxon检验；P &lt; 0.05）。
只要两个事件之间的时间间隔保持在30-60分钟范围内，标签化PRP相互作用的发生并不要求事件的时间顺序必须为弱刺激先于强刺激或强刺激先于弱刺激。建议增加第三个独立但存在重叠的突触输入，并将其用作基线对照，以监测记录的稳定性。用于诱导早期和晚期LTP/LTD的电刺激方案必须在单输入实验中验证其一致性和可靠性后，方可用于STC实验。我们还想强调本方案中所述脑片制备方法的重要性，因为这些实验的成功在很大程度上依赖于脑片的质量。
<img alt="手术器械设置、解剖与切口方法示意图；解剖学研究工具。" src="/files/ftp_upload/53008/53008fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. (A) 海马体解剖所用工具：(a) 绷带剪 (b) 眼科剪 (c) 咬骨钳 (d) 细刮匙 (e) 11号手术刀 (f) 镰形刮匙 (g) 软毛画笔 (h) 塑料巴斯德移液管 (i) 滤纸（85 mm）(j) 滤纸（30 mm）(k) 玻璃烧杯 (l) 可容纳培养皿和烧杯的铝制冷却块 (m) 培养皿。 (B) 手动组织切片机。(a) 平台 (b) 带刀片夹持器的切割臂 (c) 游标千分尺，分辨率为10 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53008/53008fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="电生理工作站设置；膜片钳设备；神经元分析准备。" src="/files/ftp_upload/53008/53008fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 用于场电位记录的电生理装置，包括 (A) 刺激器 (b) 差分放大器 (c) 模数转换器 (d) 示波器 (e) 配备采集软件的计算机 (f) 抗振实验台 (g) 具有 >4x 放大倍数的显微镜 (h) 脑切片界面式记录室 (i) 用于人工脑脊液（ACSF）和碳酰气供应的灌流系统 (j) 温度控制器 (k) 照明光源 (l) 带有电极夹持器的操纵器。(B) 界面式脑切片记录室。(C) &amp; (D) 界面室中的海马脑切片。(E) 密封于玻璃毛细管中的不锈钢电极。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53008/53008fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="海马通路示意图与突触可塑性图、场EPSP测量、电生理结果。" src="/files/ftp_upload/53008/53008fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. (A) 横切海马脑片及场电位记录电极位置示意图：在此图示中，两个刺激电极（S1 和 S2）置于CA1区辐射层，用于刺激CA1锥体神经元上两个独立但部分重叠的突触输入。两个细胞外记录电极分别置于辐射层和锥体细胞层，用于记录来自顶树突区的场兴奋性突触后电位（field-EPSP）和来自锥体细胞胞体的群体峰电位。CA1—阿蒙角区1，CA3—阿蒙角区3，DG—齿状回，SC—Schaffer侧支纤维，S1—刺激电极1，S2—刺激电极2。(B) “弱-强”刺激范式用于研究突触标记与捕获（STC）：首先对S1通路施加弱四联刺激（WTET，空心圆）以诱导早期长时程增强（early-LTP），30分钟后对S2通路施加强四联刺激（STET，实心圆）以诱导晚期长时程增强（late-LTP）。S1通路的早期LTP被增强为晚期LTP，表明存在标记与捕获的相互作用（n = 6）。(C) “弱-强”范式用于研究交叉标记：S1通路通过WTET（空心圆）诱导早期LTP，30分钟后在S2通路施加短时间低频刺激（SLFS）以诱导晚期长时程抑制（late-LTD）。在S1通路中，早期LTP被转化为持续6小时的晚期LTP，表明存在交叉标记与捕获现象（n = 6）。单箭头表示用于诱导早期LTP的弱四联刺激；三重箭头表示用于诱导晚期LTP的强四联刺激；虚线箭头表示对代表性突触输入施加SLFS以诱导晚期LTD的时间点。误差线表示标准误（SEM）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53008/53008fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本视频文章介绍了利用啮齿类动物急性海马脑片研究CA1锥体神经元中长期可塑性及其相关联的突触标记、捕获和交叉标记等过程的实验方法。

突触标记与捕获（synaptic tagging and capture, STC）以及交叉标记（cross-tagging）是两个在细胞水平上解释突触特异性和关联性的重要机制……

本实验的总体目标是利用啮齿类动物的Q型海马脑片，研究CA1区锥体神经元中的长时程可塑性及其相关联的机制，例如突触标记、捕获以及交叉标记现象。该目标通过以下步骤实现：首先解剖大脑，并迅速将海马组织分离至冰冷的含氧人工脑脊液中；第二步是使用手动组织切片机制备急性海马脑片，并将其置于界面式孵育室中孵育。接下来，在CA1区放置两对刺激电极和记录电极，用于记录来自两个突触输入的场兴奋性突触后电位（fEPSP）和群体峰电位反应。最后一步是在特定时间窗口内，诱导其中一个突触输入产生短暂形式的可塑性，而在另一个输入中诱导持久形式的可塑性。最终，长时间记录来自两个输入的场兴奋性突触后电位反应，以研究突触标记捕获和交叉捕获机制。突触标记与捕获为特定时间范围内短期记忆如何转化为长期记忆提供了概念性基础。由于该实验方法涉及对多个突触输入的刺激与记录，学习起来较为困难，因此对其进行可视化演示至关重要。本次实验操作将由我实验室的研究生 Mahesh Shira、Machete 和 Maima Sharma 进行示范。开始此操作时，准备人工脑脊液（aCSF）并用95%氧气和5%二氧化碳混合气体饱和。将蒸馏水注入界面式孵育槽底部，至其容量的约70%。然后开启温度控制器，并预设为32摄氏度。接下来，通过进样管以高流速通入蒸馏水 10 至 15 分钟，清洗上室，然后切换至以每分钟 1 毫升流速灌注人工脑脊液（A CSF）。随后在上室中放置一张网，为脑片提供一个静置表面。启动下室的碳合气（carbogen）通气，并将进样管浸入持续通碳合气的人工脑脊液（A CSF）中。让人工脑脊液（A CSF）与碳合气体（carbogen）充分饱和并填满上层腔室，此过程需时约20分钟。在此步骤中，将剃须刀片安装至组织切片机上，并确保刀刃边缘对齐均匀。通过切割一小片滤纸进行测试，以确认刀片已牢固固定。然后将游标卡尺调至起始位置。取一只已处死的大鼠头部，使用虹膜剪在后颅骨处剪开，以去除脑干。接着在颅骨右侧做一小切口，在左侧做一较长切口。从颅骨左侧开始，使用骨钳向右侧小心去除颅骨。为暴露大脑皮层及其表面覆盖的薄层硬脑膜，需用细刮匙小心剥离硬脑膜，随后连同颅骨一并去除额骨骨板。接着，使用刮匙的平头端特别清除大脑皮层与小脑交界处残留的硬脑膜，操作时应向上施加压力，以避免损伤脑组织。使用解剖刀轻轻将脑组织舀入一个置于充满冰冷且含碳酸盐的aCSF的铝制冷却块上的培养皿中，以分离海马体。使用11号手术刀，先做一垂直切口以去除小脑，再做另一切口以去除脑前部的四分之一。然后沿中线做一浅的矢状切口，从中线开始。使用镰状刮匙小心地去除皮层，以暴露背侧海马体。随后，去除海马体上方的皮层组织。在海马连合处做一个小切口。使用弯头刮匙从背侧开始，以滚动动作轻柔地取出海马体。随后，用弯头刮匙的弯曲端去除分离出的海马体周围的皮层和结缔组织。为了切片海马体组织，将一片浸有脑脊液的30毫米沃特曼滤纸放置在手动切片器的切片台上。将海马组织转移至滤纸上。使用弯月形手术刀的平端移动滤纸，使海马相对于切片机刀片处于适当的方向，以便以约70度的角度对海马进行切片。随后，吸去海马组织周围多余的溶液。使用折叠的滤纸横向切取海马体，并弃去海马体末端切片形态不清晰的组织。随后，每次切割后调节游标千分尺，将剩余组织切成400微米厚的切片。每次切割后，用软毛刷轻轻将切片从刀片上转移至盛有冷碳酸化人工脑脊液（aCSF）的小烧杯中。然后使用干净的塑料移液管将切片轻轻转移到切片孵育室的网架上。用宽头移液管小心调整切片的位置，以便于电极定位和记录检测，确保切片被一层 aCSF 充分包围，但不要完全浸没。之后，盖上孵育室，在突触标记与捕获实验中孵育切片 2 至 3 小时。在显微镜下，将两个刺激电极置于CA1区的辐射层（stratum radiatum），以刺激Schaffer侧支纤维，同时将记录电极置于CA1区顶树突区域，位于两个刺激电极之间的中点位置。为记录F-E-P-S-P反应，另将一个记录电极置于锥体细胞层（stratum pyramidale）的颗粒下层（stratum oriens），用于记录群体峰电位。当所有电极均接触脑片后，给予一次测试性刺激，以确认两个输入通路均能获得良好的场兴奋性突触后电位（fEPSP）信号。一旦获得理想的fEPSP信号，使用操纵器的微调旋钮，小心地将电极再下降约200微米。随后让脑片恢复20分钟。随后，通过测量场兴奋性突触后电位（fEPSP）在20微安至100微安范围内的不同电流强度下的斜率，确定输入-输出关系。然后，针对每个输入通路，将诱发最大fEPSP斜率40%的刺激强度设定为整个实验过程中恒定的刺激参数。在稳定15至20分钟后，开始记录基线，至少持续30至60分钟，确保基线稳定，然后在一个通路中诱导长时程增强（LTP）或长时程抑制（LTD）。通过弱四脉冲刺激协议诱导早期LTP，该协议包含一次高频刺激。在另一输入通道持续记录早期长时程增强（LTP）诱导后30分钟的基线的同时，对输入通道S2使用强直刺激方案诱导晚期LTP，该方案包括重复的高频刺激，串间间隔为10分钟。随后延长记录场兴奋性突触后电位（fEPSP）反应的时间，以揭示突触标记与捕获机制如何将输入通道S1中的早期LTP转化为晚期LTP。类似地，在交叉捕获实验中，首先在一个输入通道诱导早期LTP，30分钟后在另一输入通道使用强低频刺激方案诱导晚期长时程抑制（LTD），该方案由15分钟内共900次刺激串组成。然后长时间记录场EPSP反应，以揭示通过交叉捕获将通路S1的早期LTP转化为晚期LTP的过程。在此示意图中，将两个刺激电极置于CA1区辐射层，以刺激两个独立但存在重叠的突触输入。在CA1区锥体神经元上放置两个细胞外记录电极。一个用于记录来自顶端树突区室的F-E-P-S-P，另一个用于记录来自位于辐射层和傍层的锥体细胞胞体的群体峰电位。该图显示了用于研究突触标记与捕获的强范式前的一周实验设计。对通路一施加弱四次刺激以诱导早期长时程增强（LTP），30分钟后对通路二施加强四次刺激以诱导晚期LTP。该图显示了在强刺激范式之前的实验设计，用于研究交叉标记。通过在通路一施加弱四次刺激诱导早期LTP，随后在通路二使用强低频刺激方案诱导晚期长时程抑制（LTD）。30分钟后，在通路一中，早期LTP转化为持续六小时的晚期LTP，表明存在交叉标记与捕获现象。掌握该解剖与切片制备技术后，可在三到五分钟内快速完成操作，从而保持切片的活性，适用于长期记录。利用该方法，还可检测不同药理学试剂对突触标记与捕获过程的影响。观看本视频后，您应能够充分理解如何开展长期功能性可塑性实验，以及突触标记与捕获的过程。

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使用急性海马脑片啮齿动物突触标记/捕获和交叉捕获的研究

本文概述了制备大鼠和转基因小鼠海马脑片的实验步骤，用于研究与脑衰老及年龄相关性神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）相关的突触改变。...

用于研究衰老和淀粉样蛋白病变期间突触改变的大鼠和转基因小鼠急性海马脑片制备

本文描述了从分离的海马体制备急性脑切片的方法，以及在刺激Schaffer侧支的同时，对辐射层中的星形胶质细胞和神经元进行同步电生理记录的技术。同时演示了药理学分离星形胶质细胞钾离子和谷氨酸转运体电流的方法。...

急性海马脑片中突触激活的星形胶质细胞与神经元反应的双通道电生理记录

本视频演示了一种在大鼠海马脑片上记录CA3-CA1突触反应的方法。该方法概述了将刺激电极和记录电极放置于海马脑片上的步骤，并通过测量场兴奋性突触后电位（fEPSP）来评估突触反应强度。...

记录大鼠海马脑片中CA3-CA1突触反应

来源：McLeod, F., 等. 海马啮齿类脑切片中突触密度的评估. J. Vis. Exp.

使用免疫荧光法对小鼠海马脑片中突触进行显微分析

蛋白质的定位与分布为其细胞功能的研究提供了重要信息。电子显微镜（EM）具有较高的空间分辨率，可用于免疫组织化学后特定抗原亚细胞定位的确定。对于中枢神经系统（CNS）组织而言，在电子显微镜研究中同时保持结构完整性和抗原性尤为困难。本文采用一种已用于保存CNS中结构与抗原的方法，以研究和表征大鼠海马CA1区锥体神经元中的突触蛋白。...

海马脑片培养中突触蛋白的包埋后免疫金标记

我们提供了一种详细的方案，用于在海马CA1区诱导长时程增强效应，并随后从已强化的脑片区域分离出核富集组分。该方法可用于在学习与记忆的细胞模型中确定活动依赖性的核蛋白入核过程。...

从海马脑片中分离CA1区核富集组分以研究突触-核信使蛋白的活性依赖性核转运

本方案描述了在小体积循环缓冲液中稳定氧浓度的方法，以及在浸没式急性海马脑片中记录活动依赖性突触可塑性的技术要点。...

在小型循环灌流浸没式切片记录系统中记录急性海马脑片的突触可塑性

本文概述了一种利用免疫荧光技术在海马切片中准确识别和分析突触的实验方案。...

海马体啮齿类动物脑切片中突触密度的评估

本文旨在描述一种系统性的方案，用于获取小鼠的水平脑切片。该方法的目的是保持海马纤维通路（如穿通通路和苔藓纤维束）的完整性，以评估与齿状回相关的神经过程。...

小鼠脑水平海马切片

我们介绍一种制备小鼠背侧-中间海马区急性脑片的方案。我们将这种横向切片制备方法与冠状切片在记录质量以及所记录神经元形态特征的保存方面进行比较。...

成年小鼠背侧海马急性脑片制备用于全细胞记录及齿状回神经元重建

学习使用啮齿动物急性海马脑片研究突触标记、捕获与交叉捕获机制。本方法通过电生理记录CA1锥体神经元场电位，揭示长时程可塑性与记忆巩固的分子基础，为神经科学研究提供关键技术。

利用啮齿类动物急性海马脑片研究突触标记/捕获及交叉捕获

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