使用急性海马脑片啮齿动物突触标记/捕获和交叉捕获的研究
2015年9月4日
这篇视频文章描述了使用啮齿动物的急性海马切片研究长期可塑性及其关联过程的实验程序，例如在 CA1 锥体神经元中进行突触标记、捕获和交叉标记。
该程序的总体目标是使用啮齿动物的 Q 海马切片研究 CA one 副金属神经元中的长期可塑性及其关联过程，例如突触标记、捕获和交叉标记。这是通过首先解剖大脑并快速将海马体分离成冷含氧人工脑脊髓液来实现的。第二步是使用手动组织切片机制备急性海马切片，并在界面室中孵育。
接下来，将两个刺激电极和两个记录电极放置在 CA one 区域，以记录来自两个突触输入的场 EPSP 和群体尖峰反应。最后一步是在特定时间窗口内，在一次突触输入中诱导一种瞬态形式的可塑性，在另一个输入中诱导一种持续的可塑性形式。最终，来自两个输入的场 EPSP 反应被记录较长时间，以研究突触标记捕获和交叉捕获机制。
突触标记和捕获为短期记忆如何在特定时间范围内转化为长期记忆提供了概念基础。这种方法的视觉演示至关重要，因为实验步骤很难学习，因为它们涉及来自多个突触输入的刺激和记录。演示该程序的是我实验室的 Mahesh Shira、砍刀和 maima Sharma 研究生。
要开始此过程，请准备 A CSF 并用 95% 氧气和 5% 二氧化碳鼓泡。用蒸馏水填充界面室的底部至其容量的约 70%。然后打开预设为 32 摄氏度的温度控制器。
接下来，将蒸馏水以高流速流过流入管，然后以每分钟 1 毫升的流速切换到 A CSF，清洗上腔室 10 至 15 分钟。然后在上腔室放置一个网，为切片提供一个静置表面。启动碳化物，下腔室，将流入管浸入连续碳化物的 A CSF 中。
等待 20 分钟，让 A CSF 被碳水化合物饱和，并使其充满上腔。在此步骤中，将剃须刀片安装到组织切碎机上，并确保切割边缘均匀对齐。通过切碎小滤纸进行测试，以确保刀片牢固固定。
然后将滑动游标千分尺设置到其起始位置。现在获得安乐死大鼠的头部，并使用虹膜剪刀，切开后颅骨以去除脑干。然后沿着颅骨的右侧做一个小切口，在左侧做一个较长的切口。
小心地去除头骨，用骨头 UR 从左侧开始，一直到头骨的右侧。为了露出皮层和覆盖它的薄薄的硬脑膜层，用细刮刀小心地去除硬脑膜，然后用骨头去除额板。随后，用刮刀的平端去除皮层和小脑交界处的剩余硬脑膜，并通过保持向上的压力来避免损伤大脑。
使用抹刀，轻轻地将大脑舀入装满冷和碳酸 A CSF 的铝制冷却块上的培养皿中，以使用 11 号手术刀分离海马体，做一个直切口以去除小脑，另一个切口以去除大脑前部的四分之一。然后沿中线进行浅矢状切割。从中线开始。
用镰刀洁牙机小心地去除皮质，露出背侧海马体。之后，去除海马体上方的皮层。在海马连合处做一个小切口。
用镰刀洁牙机轻轻去除海马体，从背端开始滚动。随后，使用镰刀洁牙机的弯曲端去除离体海马周围的任何皮层和结缔组织。要切片海马组织，请将一块浸有 CSF 的 30 毫米 watman 滤纸放在手动切片机的切片台上。
将海马组织转移到滤纸上。使用镰刀刮牙器的平端，移动滤纸，使海马体相对于切片机刀片的适当方向对齐，使海马体与裂隙成约 70 度角切片。接下来，吸干海马组织周围的多余溶液。
用折叠的滤纸，横向切片海马体，并从切片形态不清楚的海马体最末端丢弃组织。然后在每轮切片后通过调整游标千分尺将剩余的组织切成 400 微米厚的薄片。每次切割后，使用带有软毛的刷子将切片轻轻地从刀片上移入装满冷碳酸 A CSF 的小烧杯中。
然后使用干净的塑料移液管将切片轻轻转移到切片室中的网上。用宽尖端，以有利于电极定位和记录检查的方式小心调整切片的位置，以确保切片被一层 A CSF 充分包围，但未完全浸没。之后，盖上腔室并在突触标记和捕获实验中孵育切片 2 到 3 小时。
在显微镜下，将两个刺激电极定位在 CA one 区域的放射原子层中，以刺激 Schaffer 侧支纤维，当记录电极时，在 ca one 的顶端树突区域，位于刺激电极之间的中间。要记录 F-E-P-S-P 响应，请在层中放置另一个记录电极。DO 层，用于记录人口峰值。
当所有电极都接触切片时，提供测试刺激，以确保在两个输入中都能获得正确的场 EPSP 信号。一旦获得适当的 F-E-P-S-P 信号，使用机械手的精细移动旋钮小心地将电极进一步降低约 200 微米。然后等待 20 分钟，让切片恢复。
之后，通过测量 20 微安到 100 微安的电流强度范围内的场 EPSP 斜率来确定输入输出关系。然后对于每个输入，设置刺激强度，该刺激强度引起最大场 EPSP 斜率的 40% 作为整个实验中的恒定刺激。15 到 20 分钟后，开始记录基线，记录至少 30 到 60 分钟的稳定基线，然后在 L-T-P-L-T-D 诱导之前在一个输入中，使用由单个高频刺激组成的弱 tetin 方案诱导早期 LTP。
当另一个输入在早期 LTP 诱导后 30 分钟继续记录基线时，使用强 tetin 方案在输入 S 2 中诱导晚期 LTP，该方案涉及重复高频刺激，训练间隔为 10 分钟。然后记录延长至持续时间的场 EPSP 反应，以揭示通过突触标记和捕获将输入 S 1 中的早期 LTP 转化为晚期 LTP。同样，在交叉捕获实验中，使用由 900 次爆发组成的强低频刺激方案，在 15 分钟的持续时间内，首先诱导早期 LTP 和一个输入，然后在 30 分钟后在另一个输入中诱导晚期 LTD。
然后记录长时间的场 EPSP 响应，以揭示交叉捕获从输入 S 1 中的早期 LTP 到晚期 LTP 的转换。在这种表示中，两个刺激电极位于 CA one 区域的放射层原子中，以刺激两个独立但重叠的突触输入。在 CA 上一个寄生金属神经元，两个细胞外记录电极。
一个用于记录来自顶端树突隔室的 F-E-P-S-P。另一个记录来自寄生金属细胞体的体细胞种群尖峰分别位于放射原子层和对位层。该图显示了研究突触标记和捕获的强范式前一周。
弱 tetin 应用于 S 1 以诱导早期 LTP，然后在 30 分钟时将 S 2 的强 tetin 应用于诱导晚期 LTP，该图显示了研究交叉标记的强范式前一周。早期 LTP 由 S 1 中的弱 tetin 诱导，随后使用 Strong Low Frequency 刺激方案在 S 2 中诱导晚期 LTD。在 S 1 中 30 分钟后，早期 LTP 转变为持续 6 小时的晚期 LTP，显示交叉标记和捕获。
一旦掌握，这种解剖和切片制备技术可以在 3 到 5 分钟内非常快速地完成。因此，可以保留切片的活力以进行长期记录。使用这种方法，还可以测试不同药理学药物对突触标记和捕获过程的影响。
看完这个视频，你应该对如何进行长期的功能性塑性实验以及突触标记和捕获的过程有一个很好的了解。
概述
本视频文章描述了使用啮齿动物急性海马切片来研究CA1锥体神经元长期可塑性及其相关过程（如突触标记、捕获和交叉标记）的实验程序。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 电生理学
- 突触可塑性
背景
- 长期可塑性对记忆形成至关重要。
- 突触标记和捕获是解释记忆巩固的机制。
- CA1锥体神经元在海马功能中起关键作用。
- 急性海马切片是研究突触过程的有价值模型。
研究目的
- 调查CA1神经元的长期可塑性。
- 探索突触标记、捕获和交叉标记机制。
- 提供复杂实验程序的视觉演示。
使用的方法
- 剖离啮齿动物大脑以分离海马。
- 使用手动组织切片仪制备急性海马切片。
- 在CA1区域放置刺激和记录电极。
- 诱导短暂和持续形式的可塑性以进行分析。
主要结果
- 记录场EPSP响应以评估突触活动。
- 展示了突触标记和捕获的机制。
- 成功诱导多个突触输入的可塑性。
- 视觉方法增强了对复杂程序的理解。
结论
- 该研究为记忆形成的潜在机制提供了见解。
- 程序的演示有助于教学复杂的电生理技术。
- 研究结果有助于理解海马中的突触可塑性。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding synaptic tagging and capture mechanisms provides critical insights into memory consolidation processes, which are relevant for target validation in neurodegenerative disease research. This electrophysiological approach enables mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses by linking synaptic plasticity to functional outcomes in hippocampal circuits. The method supports predictive confidence in early discovery by establishing causal relationships between molecular interventions and long-term potentiation dynamics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to memory formation and synaptic plasticity pathways.
- Operational Value: Provides a disease-relevant system for assessing target engagement through functional readouts of LTP and LTD.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by clarifying the role of plasticity-related proteins in synaptic tagging and capture mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated hippocampal slices for downstream assay standardization and reproducibility testing.
- Operational Value: Enables quantitative measurement of field EPSP and population spike responses as dependent variables for compound screening.
- Scientific Value: Facilitates assay readiness by establishing stable baseline recordings necessary for detecting pharmacological modulation of synaptic plasticity.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Offers translational biomarker alignment by linking electrophysiological outputs to memory persistence models.
- Operational Value: Supports preclinical continuity from discovery through validation of long-term plasticity mechanisms.
- Scientific Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by demonstrating transformation of early LTP to late LTP via tagging and capture processes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification by providing mechanistic insights into synaptic plasticity that inform target selection and validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating the effects of specific stimulation patterns on synaptic tagging and capture.
- Screening: Delivers assay readiness through stable, long-term field-potential recordings that enable quantitative comparison of synaptic inputs.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (field EPSP slope, population spike) that allow teams to assess plasticity changes across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling memory consolidation processes relevant to cognitive disorder therapeutics.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiological platform for evaluating multiple pharmacological agents on synaptic tagging and capture over extended durations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through mechanistic insight into memory formation processes.
- Operational Value: Standardization and reproducibility of hippocampal slice preparation and electrode placement for consistent recordings.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing biological risk in CNS target validation through functional synaptic readouts.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of compounds based on their ability to modulate late-phase LTP via tagging and capture mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroanatomy, electrophysiology, and hippocampal slice preparation.
- Dependent on precision instrumentation including manual tissue slicers, interface chambers, and microelectrode manipulators.
- Necessitates cross-team standardization of stimulation protocols and recording parameters across laboratories.
- Involves adaptation considerations when translating protocols across rodent species or strain backgrounds.
- Limited by the technical complexity of maintaining stable long-term recordings from multiple synaptic inputs over extended durations.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:53
Preparation of Artificial Cerebrospinal Fluid (ACSF) and Interface Chamber
2:52
Preparation of Acute Hippocampal Slices
6:36
Recording of CA3-CA1 Synaptic Responses
8:13
Induction Protocols for LTP/LTD
9:25
Results: Schematic Representation of a Transverse Hippocampal Slice and Electrode Location for Field-Potential Recording
10:41
Conclusion
