微流控采用共培养开发设备牙胚支配分析
2015年8月14日
共培养物代表了研究神经与靶组织器官之间相互作用的有价值的方法。微流控系统允许在不同的培养基中共培养神经节和整个发育中的器官或组织，因此是体外研究神经元与其靶标之间串扰的宝贵工具。
该程序的总体目标是展示如何分离和共培养发育中的三叉神经节和牙胚。这是通过首先对微流体设备进行消毒、安装和涂层来实现的。第二步是从感兴趣的小鼠的特定发育阶段解剖三叉神经节和牙胚。
接下来，将三叉神经节和牙胚放入微流体装置中并共培养。最后一步是固定细胞并使用免疫荧光对其进行染色。最终，显微镜用于显示共培养结果的神经支配模式。
现有方法（如常规共培养）的这种技术的主要优点是，该方法允许不同器官和组织在各自的最佳培养中共培养。中等。这种方法可以帮助回答人工创新领域的关键问题，例如不同分子对牙齿创新的作用以及牙齿发育中的创新规则。首先对解剖工具进行高压灭菌，其中包括一对显微解剖钳和一把剪刀。
接下来，将一批 24 毫米 x 24 毫米的玻璃盖玻片放入轨道摇床上以 37 摄氏度的温度滴定的一摩尔盐酸溶液中 24 小时，对它们进行消毒。然后用无菌蒸馏水清洗盖玻片 3 次，然后在 99% 乙醇中漂洗 3 次，干燥后在无菌流罩下晾干，打开罩内紫外线灯 30 分钟。然后将盖玻片储存在 70% 乙醇中，直到需要为止。
接下来，使用无菌镊子小心地从包装中取出轴突分离微流体装置，并使用无菌的一毫米活检打孔器将它们放入无菌培养皿中。在设备上为每个样品创建一个孔。与培养室通信。
小心不要冲得太靠近微槽，因为它们可能会因压力而损坏。接下来，通过在 70% 乙醇中出质对设备进行消毒。注意清除所有滞留的空气。
然后从乙醇中取出装置，并在无菌流罩下完全干燥。此外，从 70% 乙醇溶液中取出盖玻片，让它们在无菌流动罩下干燥。请至少等待 3 小时，然后再继续。
将每个盖玻片放入六孔板内的孔中。然后将微流体装置放在盖玻片上，用镊子轻轻但用力按压，以使隔离装置和玻璃盖玻片之间完全粘附。接下来，将 150 微升每毫升 0.1 毫克的聚 D 赖氨酸移液到每个培养室中。
然后将微流体装置置于真空下 5 分钟，以去除腔室中的所有空气。如果腔室内仍可见空气。将 poly D 赖氨酸溶液重复放入腔室中。
第二天，将装置与 poly de 赖氨酸在 37 摄氏度下孵育过夜。用无菌蒸馏水清洗腔室 3 次，然后用 150 微升（每毫升 5 微克）的核纤层蛋白工作溶液填充腔室，并在 37 摄氏度下孵育过夜。接下来，如随附的文本方案中所述，修复三叉神经节和牙齿胚芽培养物的培养基。
用 70% 乙醇清洁解剖区域和立体镜，并在处死后放置解剖器械。解剖具有 E 14.5 至 E 17.5 期小鼠胚胎的怀孕小鼠下腹部周围的皮肤。然后用剪刀小心地打开腹部。
找到子宫，取出子宫，然后将其放入装满冰块的管子中。冷 PBS 解剖出胚胎并将它们单独放入装满冰冷 PBS 的新培养皿中。从额外的胚胎组织中取出所有胚胎后，用剪刀将它们斩首。
使用显微解剖、剪刀将下颌与头部其他部分分开，注意不要损坏三叉神经节。接下来，取头部并将其放在冷藏的解剖玻璃培养皿上。使用镊子去除皮肤和颅骨。
然后将镊子放在头骨下方并提起。要切除头颅和小脑，请定位三叉神经节，并使用镊子和解剖针将三叉神经节与三叉神经分离并清洁神经节。使用解剖针作为刀将它们保存在冷的 PBS 中。
去除舌头和下巴周围的皮肤。沿下颌中线切割，将左半颌和右半颌分开。然后找到牙菌，并在解剖三叉神经节和牙胚后使用解剖针分离它们，从微流控装置中取出层粘连蛋白，并用 200 微升的相应培养基填充腔室。
用镊子轻轻地将解剖的三叉神经节和牙胚转移到活检打孔器形成的孔中。确保牙菌不会漂浮，并且它们会下沉，直到接触到盖玻片。培养，样品在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的培养箱中。
每 48 小时更换一次培养基，持续 10 天以更换培养基。首先，将移液器指向孔的外侧，去除培养基。然后在培养期间，在位于腔室对面的焊边一侧加入新鲜的预热培养基。
使用光学显微镜随时对共培养物进行成像。培养期后，将 150 微升 PBS 移液到每个腔室的一个孔中，让 PBS 流过腔室，从而清洗腔室。最后一次洗涤后，总共重复洗涤 3 次。
将 PBS 中的 150 微升 4% 多聚甲醛移液到每个腔室的一个孔中，并使其流过另一个腔室，从而去除 PBS 并固定样品。将设备在室温下孵育 15 分钟。然后用 PBS 洗涤腔室两次，并继续进行进一步分析，例如免疫荧光染色和生长物成像。
在煤培养过程中，来自三叉神经节的神经突从其培养室中分出并延伸到发育中的牙胚。在更高的放大倍率下，可以看到神经突穿过轴突腔和微流体装置中的微凹槽。可以随着时间的推移跟踪神经生长的进度以描述创新发展。
在此程序之后，可以执行其他方法，如 RNA 或蛋白质化，以研究例如创新后靶组织中基因表达或蛋白质分泌的变化。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本文展示了一种使用微流控设备分离和共培养发育中的三叉神经节和牙胚的方法。该方法允许在受控环境中研究神经元与目标组织的相互作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
- 微流控技术
背景
- 共培养对于研究神经-目标相互作用至关重要。
- 微流控系统有助于不同组织的共培养。
- 了解神经分布模式对发育研究至关重要。
- 该方法为神经元发育和组织相互作用提供了见解。
研究目的
- 分离和共培养三叉神经节和牙胚。
- 研究神经元与其目标组织之间的交流。
- 通过显微镜观察神经分布模式。
所用方法
- 微流控设备的灭菌和涂层。
- 从小鼠胚胎中分离三叉神经节和牙胚。
- 将组织置于微流控设备中进行共培养。
- 细胞的固定和免疫荧光染色。
主要结果
- 成功共培养三叉神经节和牙胚。
- 观察到神经元的神经分布模式。
- 展示了神经和目标组织之间的相互作用。
- 对神经靶向的发育过程有了新的认识。
结论
- 微流控共培养有效用于研究神经相互作用。
- 该方法可以推进对神经发育的理解。
- 未来的研究可以在这些发现基础上探索其他组织相互作用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding nerve-target tissue interactions is critical for de-risking developmental biology hypotheses in therapeutic discovery. This microfluidic co-culture method enables controlled, long-term studies of innervation patterns, supporting mechanistic validation in organogenesis models. The approach provides a reproducible platform for evaluating molecular mediators of tissue development, with direct relevance to target validation and phenotypic screening workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of neuronal influence on tooth germ morphogenesis and cytodifferentiation.
- Operational Value: Supports functional target validation by isolating nerve-tissue crosstalk in a defined microenvironment.
- Predictive Value: Facilitates assessment of molecular mediators (e.g., guidance cues, trophic factors) that modulate developmental pathways.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Establishes a standardized co-culture system for quantitative analysis of neurite outgrowth and tissue response.
- Reproducibility: Maintains stable tissue viability and native innervation patterns over extended culture periods (up to 10 days).
- Scalability: Compatible with microfluidic multiplexing for parallel condition testing in drug discovery settings.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models developmental processes applicable to congenital disorders affecting craniofacial and neural development.
- Translational Continuity: Bridges discovery-stage mechanistic insights with preclinical validation of nerve-dependent tissue regeneration.
- Risk Mitigation: Reduces ambiguity in target mechanism by enabling direct observation of neuronal influence on epithelial-mesenchymal interactions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery pipelines by providing a controlled system to validate neuronal targets prior to lead identification efforts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on the role of specific molecules in nerve-guided tissue development.
- Screening: Generates quantitative imaging outputs (neurite trajectory, branching density) for compound or genetic perturbation analysis.
- Analytics: Enables morphometric and fluorescence-based readouts to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects developmental mechanisms to regenerative strategies in craniofacial tissue engineering.
- Enterprise Reuse: Platform adaptable to other neuron-target tissue pairs (e.g., sympathetic ganglia and heart, enteric nerves and gut).
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target mechanisms by reducing reliance on inferential in vivo models.
- Operational Value: Standardizes co-culture conditions, minimizing variability from serum batch or media incompatibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing direct evidence of target engagement in developmental pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated nerve-tissue interaction data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device handling, sterile tissue dissection, and immunofluorescence microscopy.
- Depends on access to embryonic tissue sources and sterile culture infrastructure (CO2 incubator, laminar flow hood).
- Necessitates standardization of poly-D-lysine and laminin coating protocols for consistent surface adhesion.
- Adaptation to other tissue systems may require optimization of chamber geometry and media composition.
- Practical limitations include device clogging risk and the need for medium exchange without disrupting tissue positioning.
