微流控采用共培养开发设备牙胚支配分析

该程序的总体目标是展示如何分离和共培养发育中的三叉神经节和牙胚。这是通过首先对微流体设备进行消毒、安装和涂层来实现的。第二步是从感兴趣的小鼠的特定发育阶段解剖三叉神经节和牙胚。

接下来，将三叉神经节和牙胚放入微流体装置中并共培养。最后一步是固定细胞并使用免疫荧光对其进行染色。最终，显微镜用于显示共培养结果的神经支配模式。

现有方法（如常规共培养）的这种技术的主要优点是，该方法允许不同器官和组织在各自的最佳培养中共培养。中等。这种方法可以帮助回答人工创新领域的关键问题，例如不同分子对牙齿创新的作用以及牙齿发育中的创新规则。首先对解剖工具进行高压灭菌，其中包括一对显微解剖钳和一把剪刀。

接下来，将一批 24 毫米 x 24 毫米的玻璃盖玻片放入轨道摇床上以 37 摄氏度的温度滴定的一摩尔盐酸溶液中 24 小时，对它们进行消毒。然后用无菌蒸馏水清洗盖玻片 3 次，然后在 99% 乙醇中漂洗 3 次，干燥后在无菌流罩下晾干，打开罩内紫外线灯 30 分钟。然后将盖玻片储存在 70% 乙醇中，直到需要为止。

接下来，使用无菌镊子小心地从包装中取出轴突分离微流体装置，并使用无菌的一毫米活检打孔器将它们放入无菌培养皿中。在设备上为每个样品创建一个孔。与培养室通信。

小心不要冲得太靠近微槽，因为它们可能会因压力而损坏。接下来，通过在 70% 乙醇中出质对设备进行消毒。注意清除所有滞留的空气。

然后从乙醇中取出装置，并在无菌流罩下完全干燥。此外，从 70% 乙醇溶液中取出盖玻片，让它们在无菌流动罩下干燥。请至少等待 3 小时，然后再继续。

将每个盖玻片放入六孔板内的孔中。然后将微流体装置放在盖玻片上，用镊子轻轻但用力按压，以使隔离装置和玻璃盖玻片之间完全粘附。接下来，将 150 微升每毫升 0.1 毫克的聚 D 赖氨酸移液到每个培养室中。

然后将微流体装置置于真空下 5 分钟，以去除腔室中的所有空气。如果腔室内仍可见空气。将 poly D 赖氨酸溶液重复放入腔室中。

第二天，将装置与 poly de 赖氨酸在 37 摄氏度下孵育过夜。用无菌蒸馏水清洗腔室 3 次，然后用 150 微升（每毫升 5 微克）的核纤层蛋白工作溶液填充腔室，并在 37 摄氏度下孵育过夜。接下来，如随附的文本方案中所述，修复三叉神经节和牙齿胚芽培养物的培养基。

用 70% 乙醇清洁解剖区域和立体镜，并在处死后放置解剖器械。解剖具有 E 14.5 至 E 17.5 期小鼠胚胎的怀孕小鼠下腹部周围的皮肤。然后用剪刀小心地打开腹部。

找到子宫，取出子宫，然后将其放入装满冰块的管子中。冷 PBS 解剖出胚胎并将它们单独放入装满冰冷 PBS 的新培养皿中。从额外的胚胎组织中取出所有胚胎后，用剪刀将它们斩首。

使用显微解剖、剪刀将下颌与头部其他部分分开，注意不要损坏三叉神经节。接下来，取头部并将其放在冷藏的解剖玻璃培养皿上。使用镊子去除皮肤和颅骨。

然后将镊子放在头骨下方并提起。要切除头颅和小脑，请定位三叉神经节，并使用镊子和解剖针将三叉神经节与三叉神经分离并清洁神经节。使用解剖针作为刀将它们保存在冷的 PBS 中。

去除舌头和下巴周围的皮肤。沿下颌中线切割，将左半颌和右半颌分开。然后找到牙菌，并在解剖三叉神经节和牙胚后使用解剖针分离它们，从微流控装置中取出层粘连蛋白，并用 200 微升的相应培养基填充腔室。

用镊子轻轻地将解剖的三叉神经节和牙胚转移到活检打孔器形成的孔中。确保牙菌不会漂浮，并且它们会下沉，直到接触到盖玻片。培养，样品在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的培养箱中。

每 48 小时更换一次培养基，持续 10 天以更换培养基。首先，将移液器指向孔的外侧，去除培养基。然后在培养期间，在位于腔室对面的焊边一侧加入新鲜的预热培养基。

使用光学显微镜随时对共培养物进行成像。培养期后，将 150 微升 PBS 移液到每个腔室的一个孔中，让 PBS 流过腔室，从而清洗腔室。最后一次洗涤后，总共重复洗涤 3 次。

将 PBS 中的 150 微升 4% 多聚甲醛移液到每个腔室的一个孔中，并使其流过另一个腔室，从而去除 PBS 并固定样品。将设备在室温下孵育 15 分钟。然后用 PBS 洗涤腔室两次，并继续进行进一步分析，例如免疫荧光染色和生长物成像。

在煤培养过程中，来自三叉神经节的神经突从其培养室中分出并延伸到发育中的牙胚。在更高的放大倍率下，可以看到神经突穿过轴突腔和微流体装置中的微凹槽。可以随着时间的推移跟踪神经生长的进度以描述创新发展。

在此程序之后，可以执行其他方法，如 RNA 或蛋白质化，以研究例如创新后靶组织中基因表达或蛋白质分泌的变化。