Bioprinted蜂窝构造的可行性使用三分配器笛卡尔打印机
September 22nd, 2015
笛卡尔生物打印机的设计和制造允许以精确、可重复的几何形状沉积多材料，同时还允许控制环境因素。利用 3D 生物打印机，可以打印并轻松复制复杂且可行的结构。
该程序的总体目标是使用 3D 生物打印生成具有复杂几何形状的活细胞载物构建体。这是通过首先从培养物中分离人脂肪组织基质细胞来实现的。接下来，将细胞与新鲜制备的氧化 RGD 偶联海藻酸盐生物墨水混合。
在最后一步中，生物材料中的细胞 LA 通过生物打印挤出。最终，共聚焦显微镜用于分析生物打印细胞的活力、增殖和迁移。与现有程序（如支架形成和细胞接种）相比，该程序的主要优点是，通过我们的程序，您可以直接将细胞和细胞聚集体准确地放置在它们需要的位置以形成组织。
今天演示该程序的是我实验室的研究生 Sarah Grace Dennis。首先将 350， 000 个人脂肪组织基质细胞接种到经处理的 T 75 培养瓶中，在 15 mL 低葡萄糖 TMEM 中扩增，在细胞培养箱中扩增。当培养物达到 80% 共流度时，去除培养基并用 5 毫升不含钙和镁的 DPBS 冲洗细胞。
然后将细胞在 5 毫升胰蛋白酶和 DPBS 中在 37 摄氏度下孵育 2 分钟，当细胞分离时，用 3 毫升细胞培养基停止酶促反应，并将细胞转移到 50 毫升锥形管中。接下来，离心细胞并将沉淀重悬于 2 mL 细胞培养基中。然后对细胞进行计数，将 6 个细胞等分试样的 1.3 乘以 10 转移到 15 毫升锥形管中，并再次旋转细胞。
将沉淀悬浮在一毫升新鲜制备的生物墨水中，注意将细胞均匀分布在整个海藻酸盐水溶液中。然后将细胞装入与无菌打印机兼容的 3 毫升注射器中，并拧上无菌 22 号塑料尖端。现在打开 bioprint、每台分配器计算机和循环水浴。
在相关分配器计算机上手动将处理机构和每个分配器的打印参数的浴槽温度设置为 4 摄氏度。将分配体积设置为 230 纳升，将后退步骤的数量设置为零，并将分配速率设置为每秒 10 微升。然后打开设计软件和程序，在计算机上查看 USB 摄像头显示。
接下来，手动输入一个 5 x 5 点数组的坐标，液滴之间间距为 2.4 毫米。保存程序并将程序发送给机器人。然后将含有明胶二氧化钛的培养皿放在 4 摄氏度的打印机载物台上，关闭并锁上腔室门。
使用可编程逻辑控制器，初始化紫外线光源以对腔室进行消毒。90 秒后，打开腔室，将含有人脂肪组织基质细胞悬液的注射器装入一号枪中，关闭并锁上腔室门并使用可编程逻辑控制器打开风扇系统。等待 30 秒，让内部压力达到平衡，然后在整个打印过程中运行包含几何路径和打印参数的程序。
观察计算机上的 USB 摄像头显示，以确认打印准确且均匀。为了量化生物打印构建体的活力，请将它们浸入新鲜制备的染色溶液中。然后将结构物放入冰箱中避光 15 分钟，让污渍凝固。
然后使用共聚焦显微镜图像，如果细胞呈黄色或绿色，则染色的构建体将其分类为活细胞，如果细胞为红色，则细胞已死亡。正如这些结果表明的那样，生物打印有助于使用计算机软件准确、一致地将细胞辅助剂和水凝胶沉积在特定的三维位置。计算机软件确定每个液滴的位置并控制许多分配参数。
成功的生物打印技术的要求之一是细胞在这里保持活力。如刚才所示，在打印后 1 小时和 8 天对用海藻生物墨水打印的细胞进行分析，其中 98% 的细胞在第 0 天呈绿色且有活力，第 8 天呈 95%。正如红色染色所示，在任一时间点观察到的死细胞很少，证实了替代墨水适用于生物打印。
此外，RGD 偶联的海藻胶油墨增强了细胞与打印结构的结合，从而改善了细胞扩散和增殖，如在水凝胶的三个独立区域（0 和 8 上）进行量化。在这里，比较了 ginnet 生物墨水上 RGD 肽偶联的质量与第 8 天单独使用 Ginnet 生物墨水的质量。在 RGD 偶联的 ginnet 染色样品中观察到的细胞扩散表明肽成功掺入 ginnet 上，这种现象在非偶联生物印样品中明显不存在
。这项技术为组织工程领域的研究人员探索增材制造作为组装活体工程结构的一种手段铺平了道路。
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概述
本研究提出了一种使用3D生物打印机生成具有复杂几何形状的可行的细胞载体的程序。该方法涉及分离人体脂肪组织间充质细胞，并在通过生物打印机挤出之前将它们与生物墨水混合。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物打印
- 细胞生物学
- 组织工程
背景
- 3D生物打印允许精确放置细胞。
- 传统方法涉及支架形成和细胞接种。
- 直接放置细胞可以增强组织形成。
- 共聚焦显微镜用于分析细胞活力。
研究目的
- 使用3D生物打印机创建复杂的可行构造。
- 提高组织工程中的细胞放置准确性。
- 分析生物打印后的细胞行为。
使用的方法
- 分离人体脂肪组织间充质细胞。
- 制备氧化RGD结合的藻酸盐生物墨水。
- 通过生物打印挤出细胞载体生物材料。
- 使用共聚焦显微镜分析细胞活力、增殖和迁移。
主要结果
- 成功生成可行的细胞载体构造。
- 与传统方法相比，对细胞放置有更强的控制。
- 展示了生物打印细胞的活力和增殖。
- 共聚焦显微镜确认了细胞迁移模式。
结论
- 3D生物打印机允许精确和可重复的细胞放置。
- 这种方法可能推进组织工程应用。
- 未来的研究可能探索这种生物打印技术的进一步应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
This bioprinting method enables precise spatial organization of cells within complex 3D geometries, addressing a key challenge in tissue engineering for regenerative medicine and disease modeling. By maintaining high cell viability and supporting proliferation, the approach provides a reproducible platform for evaluating therapeutic candidates in physiologically relevant constructs. This capability supports early-stage target validation and mechanistic de-risking by allowing direct placement of bioactive agents in defined microenvironments.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through spatially controlled cell deposition in biomimetic architectures.
- Operational Value: Supports functional target validation by maintaining cell viability (>95% at day eight) and proliferation in printed constructs.
- Predictive Value: Enhances confidence in target engagement by replicating native tissue-like organization for compound screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, viable cell-laden constructs with quantifiable outputs via confocal microscopy for viability, proliferation, and migration.
- Operational Value: Enables assay reproducibility through controllable printing parameters and computer-aided design manufacturing.
- Scalability: Facilitates platform reuse for downstream compound evaluation via precise droplet placement and environmental control.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports progression from discovery to preclinical validation by maintaining cell function in RGD-conjugated alginate bio ink.
- Mechanistic De-risking: Improves predictive confidence through enhanced cell adhesion and spreading due to RGD peptide conjugation.
- Disease-Relevant System: Generates biomimetic tissue constructs that closely mimic native extracellular matrix organization.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification by providing reproducible, quantifiable biological readouts in engineered tissues.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via precise placement of cells and hydrogels in defined 3D locations.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized construct production and quantitative confocal imaging of cell behavior.
- Analytics: Enables comparative analysis of conditions using viability, proliferation, and migration metrics from stained constructs.
- Translational Research: Connects to preclinical work by maintaining cell function in bio ink over eight days post-printing.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for generating complex geometries across multiple projects via programmable dispensing and software control.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduced mechanistic ambiguity in cell-environment interactions.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via controlled dispensing parameters and sterile chamber environment.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by enabling early assessment of cellular responses in tissue-like contexts.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through quantitative viability and proliferation data supporting advancement criteria.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell isolation, bio ink preparation, and confocal microscopy for viability assessment.
- Dependent on bioprinter hardware, sterile syringe systems, and temperature-controlled printing stages.
- Necessitates cross-team standardization of CAD designs, dispensing rates, and environmental controls.
- Adaptation considerations include bio ink composition and cell type compatibility with alginate-based matrices.
- Practical limitations include nozzle clogging risks and the need for post-print staining protocols to quantify viability.
