使用三喷头笛卡尔打印机进行细胞构建物生物打印的活性研究

本实验的总体目标是利用3D生物打印机生成具有复杂几何结构且含存活细胞的构建物。首先从培养物中分离人脂肪组织基质细胞，然后将细胞与新配制的氧化RGD偶联海藻酸盐生物墨水混合，从而实现这一目标。

在最后一步中，通过生物打印将生物材料中的细胞LA挤出。最终，使用共聚焦显微镜分析生物打印细胞的活性、增殖和迁移情况。与现有的支架成型和细胞接种等方法相比，本方法的主要优势在于，能够直接将细胞和细胞聚集体精确地放置在形成组织所需的位置。

今天由我实验室的研究生 Sarah Grace Dennis 演示该实验步骤。首先，在 T75 培养瓶中加入 350,000 个人类脂肪组织基质细胞，并加入 15 毫升低糖 TMEM 培养基，在细胞培养箱中进行扩增培养。当细胞融合度达到 80% 时，移除培养基，并用 5 毫升不含钙和镁的 DPBS 缓冲液冲洗细胞。

然后，当细胞脱落时，在37摄氏度下用5毫升胰蛋白酶和DPBS孵育细胞2分钟，加入3毫升细胞培养基以终止酶反应，并将细胞转移至50毫升锥形管中。接下来，离心细胞，并将沉淀重悬于2毫升细胞培养基中。随后对细胞进行计数，取1.3 × 10⁶个细胞分装至15毫升锥形管中，再次离心收集细胞。

将沉淀物悬浮于1 mL新鲜配制的生物墨中，注意将细胞均匀分散至整个海藻酸盐水溶液中。然后将细胞转移至无菌、适用于打印机的3 mL注射器中，并拧上无菌的22号塑料喷嘴。现在打开生物打印机、各分配器计算机以及循环水浴装置。

手动将浴槽温度设置为四摄氏度，以调节作用机制以及在相应的分配器计算机上设置每个分配器的打印参数。将分配体积设为 230 纳升，回退步数设为零，分配速率为 10 微升每秒。然后打开设计软件以及用于在计算机上查看 USB 相机显示的程序。

接下来，手动输入一个 5×5 点阵的坐标，液滴之间的间距为 2.4 毫米。保存程序并将程序发送至机器人。然后将含有明胶二氧化钛的培养皿放置在 4°C 的打印平台，关闭并锁紧腔室门。

使用可编程逻辑控制器启动紫外光源，对腔室进行消毒。90秒后，打开腔室，将装有 人脂肪组织基质细胞悬液的注射器装入一号枪中，关闭并锁紧腔室门，然后使用可编程逻辑控制器启动风扇系统。等待30秒，使内部压力达到平衡，随后在整个打印过程中运行包含几何路径和打印参数的程序。

观察计算机上的USB摄像头显示，以确认打印的准确性和均匀性。为了定量分析生物打印结构的存活率，将其浸入新配制的染色液中。然后将结构置于冰箱中避光冷藏15分钟，使染色充分固定。

然后使用共聚焦显微镜图像，观察染色后的细胞结构：若细胞呈黄色或绿色，则判定为活细胞；若呈红色，则判定为死细胞。如这些结果所示，生物打印技术能够借助计算机软件，精确且一致地将细胞悬液和水凝胶沉积到特定的三维位置。计算机软件可确定每个液滴的定位，并控制分配过程中的多项参数。

成功生物打印技术的要求之一是细胞在此过程中保持活性。如上所述，使用海藻酸生物墨水打印的细胞在打印后一小时和第八天进行了分析，结果显示第零天时98%的细胞呈绿色且具有活性，第八天时仍保持95%的活性。由于红色染色表明在两个时间点观察到的死亡细胞均很少，这证实了该替代墨水适用于生物打印。

此外，RGD偶联的海藻酸盐墨水可增强细胞在打印结构上的黏附，从而促进细胞铺展和增殖，该效应通过在水凝胶的三个独立区域于第0天和第8天进行定量分析得以证实。在此，比较了第8天时RGD肽在Ginnet生物墨水中偶联质量与单独使用Ginnet生物墨水的情况。在RGD偶联的Ginnet染色样品中观察到的细胞铺展表明该肽已成功整合至Ginnet中，而这一现象在未偶联的生物打印样品中则明显缺失。

该技术为组织工程领域的研究人员探索利用增材制造来构建活体工程化结构开辟了道路。