Name: Bioprinted蜂窝构造的可行性使用三分配器笛卡尔打印机 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-22T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: 学习使用三分配器笛卡尔打印机进行生物打印，制备含人脂肪组织基质细胞的活性细胞负载构建体。该方法通过精确控制细胞 placement，结合氧化RGD偶联海藻酸生物墨水，实现复杂几何结构的组织工程应用，并利用共聚焦显微镜分析细胞活力、增殖和迁移特性。

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本工作获得了以下资助：美国国家科学基金会授予的 EPS-0903795 号基金、美国国立卫生研究院国家牙科与颅面研究所 R01-DE019355 基金（项目负责人：MJY）以及 8P20 GM103444 号基金（项目负责人：YM）。

1. 用于海藻酸盐水凝胶三维生物打印的明胶基底制备
<ol>
	<li>按照 Pataky et al11 所述的钙/明胶基底方法制备钙/明胶基底，以避免高含量导致的细胞活力降低。钙/明胶基底方法如下所列。
	<ol>
		<li>将氯化钙二水合物（1.5 wt%）、氯化钠（0.9 wt%）和猪明胶（2 wt%）溶于蒸馏水中，煮沸 2 min，制成 100 mM 的明胶溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 5 ml 明胶/钙溶液倒入 100 mm 标准培养皿中，轻轻旋转使溶液在表面形成均匀涂层，然后置于冰箱中过夜凝胶化（使用前至少静置凝胶 8 小时）。</li>
	<li>为提高基底表面的不透明度，向明胶/CaCl2 溶液中加入二氧化钛（0.3 wt%），搅拌 10 分钟。将明胶/TiO2 溶液在液体循环模式下高压灭菌 30 分钟以实现灭菌。
	<ol>
		<li>将 3 ml 明胶/TiO2 溶液加至先前制备的明胶板表面，轻轻旋转混合物以确保其在表面均匀分布。在 4 °C 冰箱中过夜静置凝胶（使用前至少凝胶 8 小时）。基底必须在 3 天内使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 藻酸盐氧化
<ol>
	<li>按照Bouhadir的部分氧化海藻酸盐方法，对海藻酸钠生物墨水进行氧化 等30 如下所述。
	<ol>
		<li>配制5%氧化海藻酸钠溶液：将1 g海藻酸钠溶解于100 ml蒸馏水中。加入高碘酸钠水溶液（0.25 M，0.25 mmol）作为氧化剂，制备成5%氧化溶液。室温下搅拌19小时。24小时后向溶液中加入40 ml乙二醇以终止反应。</li>
		<li>将2.5 g氯化钠溶解于溶液中。加入过量乙醇（体积比2:1）以沉淀氧化海藻酸盐。在1,000 x g离心收集沉淀物，并将其重新溶解于蒸馏水中。重复乙醇洗涤步骤。</li>
		<li>冷冻干燥氧化海藻酸盐小球，并于 -20 °C 直至使用前</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过测定乙二醇终止前消耗的过碘酸钠百分比来确定氧化程度。
	<ol>
		<li>配制碘化钾溶液（20% w/v，pH 7.0 磷酸钠缓冲液）和硫代二丙酸溶液（10% w/v，p pH 7.0 磷酸钠缓冲液）。在室温下将两种溶液与氧化海藻酸钠混合。</li>
		<li>将反应后的海藻酸钠与高碘酸钠溶液逐滴加入碘化钾和硫堇溶液的混合液中。在426 nm处用分光光度法测定混合液的吸光度。当吸光度达到最大值时，记录所用的海藻酸钠与高碘酸钠溶液的体积为V1.</li>
		<li>反应是 <img alt="Redox reaction equation involving iodate and iodide ions; symbolic chemical formula." fo:content-width="0.8in" src="/files/ftp_upload/53156/53156eq1.jpg" width="120" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation 1">未反应的高碘酸钠的量是 <img alt="Dilution equation w/v percentage calculation, formula for concentration adjustment in volumetric analysis." fo:content-width="1.2in" src="/files/ftp_upload/53156/53156eq1.5.jpg" width="150" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation 1.5"></li>
		<li>从初始浓度中减去未反应的高碘酸钠的量，以确定所消耗的高碘酸钠的量。利用前述公式，计算海藻酸钠的最终氧化程度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 藻酸盐-多肽偶联
<ol>
	<li>按照 Rowley et al31 所述的 RGD-海藻酸盐偶联方法，将具有暴露的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列（RGD 肽）的配体与先前制备的氧化海藻酸盐进行偶联，以促进细胞黏附和铺展。</li>
	<li>采用水相碳二亚胺化学法，使用 G4RGDSP 进行偶联31。</li>
	<li>将 1 g 5% 氧化的海藻酸盐溶解于 0.1 M 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）缓冲液中，pH = 4。加入 1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺（EDC，0.54 mmol）和 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS，0.27 mmol），按 2:1 的比例生成酰胺中间体。</li>
	<li>加入 0.28 mmol 肽，通过其末端氨基与海藻酸盐聚合物主链发生偶联。在室温下搅拌过夜。</li>
	<li>向溶液中加入 2.5 g 氯化钠以终止偶联反应。加入过量乙醇（2:1 比例）使氧化海藻酸盐沉淀。在 4,000 × g 下离心 5 分钟以收集沉淀物。在细胞培养超净台中吸除上清液，并将沉淀物重新溶解于蒸馏水中。重复乙醇洗涤步骤。</li>
	<li>将沉淀物冷冻干燥至完全干燥（呈现为白色粉末状），并于 -20 °C 冰箱中保存以备后续使用。</li>
</ol>
4. 人脂肪组织基质细胞（hADSCs）的培养
<ol>
	<li>在经处理的 75 cm² 细胞培养瓶（T75 培养瓶）中培养人脂肪组织基质细胞（hADSCs），加入 15 ml 低糖 DMEM 培养基，含 10% 胎牛血清、1% 青霉素-链霉素、1% 谷氨酰胺和 1% 抗真菌素。在细胞培养超净台中每两天更换一次培养基，直至细胞达到汇合状态（80–90% 汇合度）。</li>
	<li>待细胞汇合后，将 T75 培养瓶转移至细胞培养超净台，采用胰蛋白酶消化法使 hADSCs 悬浮。
	<ol>
		<li>在超净台中，吸除所有细胞培养液。用 5 ml 含钙镁的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS ++）冲洗细胞，随后吸除 DPBS++。</li>
		<li>在超净台内，将 1 ml 胰蛋白酶与 4 ml DPBS++ 混合，配制胰蛋白酶/DPBS++ 溶液。每瓶需加入 5 ml 该溶液，因此根据汇合培养瓶的数量配制相应体积。向每个培养瓶中加入 5 ml 胰蛋白酶/DPBS++ 溶液，并将培养瓶放入培养箱中孵育 2 分钟。</li>
		<li>2 分钟后取出培养瓶，轻轻敲击瓶壁使细胞从瓶底脱落。在显微镜下观察每个培养瓶，确认细胞已悬浮。将培养瓶放回超净台，向每瓶中加入 3 ml 适当的细胞培养基以终止胰蛋白酶反应。</li>
		<li>将各瓶中的含细胞培养液转移至 50 ml 锥形离心管中，在 1,000 × g 条件下离心 5 分钟。细胞应形成位于管底的小白色沉淀。将离心管转移回超净台，吸除上清液，用 2 ml 细胞培养基重悬细胞。</li>
		<li>在显微镜下使用血细胞计数板对细胞进行计数。计数完成后，在超净台中分装含有约 130 万细胞的培养液体积至 15 ml 锥形离心管中。将含细胞的 15 ml 离心管再次在 1,000 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
		<li>在超净台中，将剩余细胞重新接种至多个 T-75 培养瓶中，每瓶接种约 35 万细胞。每瓶加入 15 ml DMEM 培养基，并放回培养箱中继续培养至再次汇合。</li>
		<li>离心程序完成后，将 15 ml 离心管转移回细胞培养超净台。吸除细胞沉淀中的上清液，将细胞重悬于水相海藻酸盐溶液中，终浓度为每毫升生物墨中含 130 万细胞，在重悬过程中频繁混匀，以确保细胞在生物墨中均匀分布。将含细胞的溶液装入无菌、适用于打印机的 3 ml 注射器中，并拧上无菌 22 G 塑料喷嘴。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 生物打印机设置
<ol>
	<li>开启生物打印机、每个分配器的计算机以及循环水浴装置。
	<ol>
		<li>手动将循环水浴的温度设置为适用于凝胶化机制的温度。</li>
		<li>在对应的分配器计算机上手动设置每个分配器的打印参数。设定分配体积为 230 nl，回退步数为 0，分配速率为 10 μl/sec。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>打开设计软件以及用于在计算机上查看USB摄像头显示画面的程序。
	<ol>
		<li>使用软件手动输入一个 5 × 5 点阵的坐标，液滴间距为 2.4 mm。</li>
		<li>设置打印参数如下：针尖末端与基底表面之间的距离 = 0.1 mm；每次沉积后注射器抬升高度 = 20 mm；每次沉积持续时间 = 1 秒。</li>
		<li>保存程序并将其发送至机器人系统。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将含有明胶/TiO2 的培养皿放置在 4 °C 的打印机载物台上。关闭并锁紧舱门。</li>
	<li>使用PLC启动紫外光源，对打印舱内进行 90 秒的灭菌处理。</li>
	<li>灭菌完成后，打开舱门，将装有悬浮在海藻酸盐中的hADSCs的注射器装入1号打印枪中。关闭并锁紧舱门。</li>
	<li>使用PLC开启风扇系统，等待30秒以达到内部压力平衡。</li>
	<li>在计算机上运行包含几何路径和打印参数的程序。</li>
	<li>在整个打印过程中，通过计算机监视USB摄像头的显示画面，以确认打印的准确性和均匀性。</li>
	<li>打印完成后，让构建物在原位凝胶化 40 分钟。</li>
</ol>
6. 细胞活力评估
<ol>
	<li>对于打印后不立即进行成像的构建物，用DMEM覆盖，并在培养箱中保存至成像时。</li>
	<li>为定量分析构建物的细胞活力，使用基于荧光的活力/细胞毒性检测试剂进行染色，并通过共聚焦显微镜成像。
	<ol>
		<li>根据试剂盒说明书，配制含有钙黄绿素AM（calcein AM）和碘化乙啶同型二聚体-1（ethidium homodimer-1）的染色溶液。配制10 ml染色溶液时，将20 μl碘化乙啶同型二聚体-1和5 μl钙黄绿素AM加入10 ml无菌的组织培养级杜氏磷酸盐缓冲液（含镁、含钙；DPBS++）中。</li>
		<li>将生物打印的构建物浸入染色液中，在避光条件下孵育15分钟。</li>
		<li>在第0天和第8天，使用共聚焦显微镜系统对染色后的构建物进行成像。对每个生物打印构建物采集多张图像，采用Z轴堆叠参数：300 μm深度内共30个光学切片，并手动计数细胞。若细胞呈黄色或绿色，则计为活细胞；若呈红色，则计为死细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算构建物中细胞活力百分比，即活细胞数量除以构建物中总细胞数量；细胞活力 =（活细胞数（绿色+黄色）/ 总细胞数（绿色+黄色+红色））× 100%。</li>
	<li>计算每个样本的细胞增殖量，即第8天的细胞数除以第0天的细胞数；细胞增殖 =（第8天活细胞数 / 第0天活细胞数）× 100%。</li>
</ol>
7. RGD 肽偶联分析
<ol>
	<li>为分析RGD肽在海藻酸盐上的偶联效果，比较RGD偶联海藻酸盐与未偶联海藻酸盐。为此，使用（4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐）（DAPI）和鬼笔环肽染色对打印的结构进行成像。
	<ol>
		<li>通过将5 μl 甲醇储存液稀释于200 μl DPBS++中，配制鬼笔环肽工作液。保存于-20 °C，待用。</li>
		<li>根据公式：(0.10509 g/L)/(350.3 g/mol)=3 × 10-4 M=0.0003 M=0.300 mM=300 μM，配制DAPI染色剂300 μM的储存液。通过将储存液以1:100比例稀释于DPBS++中，配制DAPI工作液，获得3 μM溶液。保存于-20 °C，待用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将样品完全浸入4%多聚甲醛中，在室温下孵育1小时。用DPBS++洗涤三次，每次静置5分钟。将凝胶样品从孔中转移至载玻片，过程中将凝胶翻转。将凝胶浸入含0.1% Triton X-100（0.1 g/100 ml）的DPBS++中，孵育10分钟。再用DPBS++洗涤三次，每次静置5分钟。</li>
	<li>将打印结构浸入鬼笔环肽工作液中进行染色。用铝箔覆盖，孵育4小时。去除鬼笔环肽染色液，用DPBS++洗涤三次。第一次洗涤应快速，后续每次洗涤静置5分钟。</li>
	<li>将打印结构浸入DAPI工作液中进行染色。用铝箔覆盖，在室温下孵育30分钟。用DPBS++洗涤三次，每次静置5分钟。在共聚焦显微镜系统上观察并成像样品。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

组织工程的主要目标是通过开发能够恢复、维持或改善天然组织功能的生物替代物，来弥补器官短缺与移植需求之间的差距。这推动了具有复杂且解剖学上精确的外部几何结构的支架的直接制造，并实现了对内部结构的精确控制。三维生物打印是一种基于数字模型，通过逐层堆积的方法，生成各种尺寸和形状的三维结构的技术。三维仿生结构的构建在组织工程的发展中起着至关重要的作用。
设计过程中的若干关键方面会影响所生成结构的仿生功能。控制生物材料和基底温度的能力对于水凝胶的凝胶化机制及其力学性能的维持至关重要，从而影响细胞在水凝胶内的分布、增殖和分化。由于器官由多种细胞类型组成，多个分配装置对于构建异质性、类组织结构至关重要。对外部结构进行计算机辅助设计，可实现针对不同创面或组织定制化组织替代物的制造，这对于开发患者特异性替代物至关重要。内部结构同样重要，因为它通过将适当的细胞紧密接触地定位在一起，影响结构内的细胞-细胞相互关系，并允许细胞形成 体内-样细胞间连接。细胞的精确定位决定了它们之间如何相互通讯并形成网络，从而构建血管网络，并模拟其在天然组织中的生物活性。三维生物打印可实现细胞在生物墨水中的...

组织工程结合生物学与工程学原理，致力于开发功能性替代物，以维持、修复或增强天然组织。按需生成三维仿生结构的能力，将推动组织工程以及基于细胞的传感器、药物/毒性筛选、组织或肿瘤模型等领域的科学与技术进步。对于组织工程构建物而言，其三维结构是制备方法中的基本要素，因为必须紧密模拟天然组织中细胞与细胞外基质之间高度有序的相互作用。
可生物降解且可塑形的三维支架是构建新型组织结构的关键因素，因为细胞会迁移并形成二维细胞层，但缺乏在理想的三维环境中生长的能力。支架可作为细胞黏附和增殖的临时基底，因此必须由具有可控孔隙率和可生物降解性且具备足够力学完整性的材料制成。支架材料不应具有细胞毒性，也不应引起宿主的不良反应。水凝胶已广泛应用于组织工程技术中，由于其亲水性，水凝胶允许液体和气体在整个结构中进行交换。通过组合不同的水凝胶，可调节合成水凝胶的性能，以满足特定应用需求。
传统的组织工程方法涉及制造无细胞的多孔牺牲支架，然后在支架制备完成后接种细胞。已采用多种技术，如纤维键合、溶剂浇铸和熔融成型，但这些方法在组织工程应用中均收效甚微。纤维键合方法可使纤维按特定形状排列，但仅能制备非常薄的支架。溶剂浇铸法虽可制得高孔隙率的结构，但所制备的最大膜厚度仅为3 mm。因此，使用这些技术无法制备三维结构。熔融成型技术虽能成功制备三维支架，但所需温度过高，导致在生产过程中无法掺入生物材料。在制备完成后接种细胞的支架难以满足组织工程对具有预定义或可控微结构的三维支架的要求。固体支架接种技术的另一主要问题是缺乏血管化以及力学性能差。
生物打印技术现已通过使用无毒、可生物降解、热可逆凝胶扩展到三维层面，以克服传统方法的缺点。目前采用的一些无模成型制造技术包括激光辅助生物打印和喷墨打印。激光辅助生物打印技术利用脉冲激光源、靶板和接收基底来生成三维结构。然而，该技术存在通量低、细胞存活率低等局限性，且只能产生有限排列的制造结构，因为仅能使用光交联预聚物形成交联水凝胶。喷墨打印是一种非接触式方法，通过在基底上沉积皮升级墨滴来重现数字图像数据。然而，喷墨打印无法产生高分辨率的结构，所构建的结构易发生蛋白质快速变性，且在沉积过程中许多细胞会发生裂解。
目前，已开发出新的增材制造生物打印技术。在这些系统中，细胞、蛋白质、生长因子和仿生水凝胶通常在制造过程中被整合到基质材料中，并通过计算机控制的执行器同时沉积，以生成三维支架结构，该结构负载细胞并紧密模拟天然组织的微结构。负载细胞的水凝胶构成生物墨水，其可以是异质的（包含多种细胞类型），也可以是均质的。增材制造系统通过一次性注射器和喷头，将生物墨水逐滴或逐层沉积到可在x、y和z方向移动的计算机控制平台上。通过计算机软件，可根据具体应用需求灵活调控所打印支架的结构。与传统技术不同，三维医学影像技术（如磁共振成像、计算机断层扫描）可被整合至设计中，从而生成患者特异性的构建体。这些方法还为制造具有血管化的替代组织提供了可能，因为所构建的组织具有更高的局部细胞密度，有利于细胞间的相互作用，并提高植入后的存活率。
Palmetto 打印机是一种定制的三维多分配系统，采用可编程的机器人制造方法来生成三维异质组织结构（图1）。该系统可将多种材料以独特组合方式使用，从而制造出异质结构。生物打印机的初始化是生物打印过程中最关键的步骤之一，因为它允许设置多种参数，以优化所打印生物结构的可打印性。
生物打印机采用批次式工艺，其启动、运行和关闭流程由可编程逻辑控制器（PLC）控制，用户通过交互式触摸屏控制面板进行操作（图1，&#160;A）。为防止生物材料污染，生物打印机被封闭在正压聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）腔室内，并配备高效微粒空气（HEPA）过滤空气循环系统（图1，B,C）。打印机内部可通过内置紫外光源进行灭菌（图1，D）。生物打印机的核心部件是一个完全可编程的定位机器人，能够以10微米的精度重复定位分配喷头（图1，E）。设备配备三个分配器，利用旋转螺杆可分配低至230 nl的体积（图1，F）。每个分配器由独立计算机控制，可分别编程设定其打印参数（图1，G）。旋转螺杆分配技术通过电机驱动螺杆旋转，推动生物墨水沿注射器下行并从针尖排出。这些分配器安装在气动控制的工具架（Tool Nest）上（图2A，B），可在程序控制下使机器人切换安装于Z轴机械臂上的分配器（图1，H）。
XYZ 机器人从运行设计软件的计算机接收打印指令（图 1，I）。每个程序包含分配位置、校准程序以及分配器更换协议。所生成结构的设计主要由每个分配器将材料沉积的位置的 XYZ 坐标构成。生物打印机包含两个光学传感器（图 2C），用于确定注射器尖端末端的 XYZ 坐标。这些传感器将坐标信息发送给机器人，机器人利用这些信息计算分配器尖端末端的位置。另有一个位移激光器（图 2D），可投射波长为 633 nm、光斑尺寸为 30 × 100 微米的红色二极管激光束，测量精度达 0.1 微米。当光束高度聚焦时，机器人可确定打印表面的 Z 距离。该测量值与光学传感器对尖端末端在 Z 方向的测量结果相结合，可用于计算准确的 Z 坐标，从而精确定位分配器尖端相对于打印表面的位置。分配器尖端通过 X 轴方向的光学传感器进行横向和垂直移动，以确定 Y 和 Z 中心，并通过 Y 轴传感器进行横向移动，以确定 X 轴的中心。打印表面通过三维空间中平面方程 ax + by + cz = d 进行映射，以确定表面相对于分配器尖端末端位置的空间关系。打印机载物台（图 1，J）可容纳直径最大为 80 mm 的样品培养皿，并通过循环水浴维持设定温度（图 1，K）。载物台温度可在 -20 范围内设定，并保持稳定。机器人 Z 臂上安装有一个 USB 摄像头，可在打印过程中提供分配器尖端的放大视图（图 1，L）。在腔室内部顶部还安装有第二个摄像头，可在打印过程中提供生物打印机的完整视野（图 1，L）。
计算机辅助设计绘图软件可确定沉积模式，并允许用户生成间距递增的液滴和复杂结构（图3）。三维路径可手动编码至与打印机兼容的设计软件中，或从其他计算机辅助设计绘图软件导入（图4，表1）。与打印机兼容的软件可调节多种打印参数，例如沉积方式（单液滴沉积或连续路径沉积）、路径的三维几何形状、沉积速率、注射器尖端与基底打印表面之间的距离、单个液滴沉积所需时间，以及液滴沉积之间注射器抬升的高度和速度。每个程序均包含XYZ方向的分配位置、探针校准程序和分配器更换协议，可在打印过程中提供无需操作者干预的无菌环境。机器人的可编程逻辑控制器（PLC）接收运行设计软件的计算机发出的指令，并控制来自外部控制器（例如，&#160;分配器）的事件时序。为此，PLC采用循环机制来控制分配器、机器人定位装置以及环境因素。
利用旋转螺杆液体分配系统进行三维直接书写式生物打印，使得细胞沉积过程比以往方法更高效、更精确且更简便。本研究表明，该定制生物打印机能够生成具有高细胞活性的含细胞水凝胶结构。

<table><tbody><tr><td>定位机器人 (JR2000 XYZ)</td><td>Janome&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>分配器：SDAV 线性驱动 SmartDispensers</td><td>Fishman Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光学传感器：&amp;nbsp;</td><td>Keyensce</td><td></td><td></td></tr><tr><td>位移激光器：OD Mini</td><td>SICK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>循环水浴：Polystat</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-12122-02</td><td></td></tr><tr><td>USB 相机：Dino-Lite Premier 5MP</td><td>AnMo Electrionics/YSC Technologies</td><td>AD7013MT</td><td></td></tr><tr><td>打印机兼容的计算机设计软件：JR-C Points</td><td>Janome</td><td></td><td>随 Janome 机器人购买附赠</td></tr><tr><td>计算机辅助设计绘图软件：Visual PathBuilder</td><td>RatioServ</td><td></td><td>可从以下网址下载：www.ratioserv.com/index.php/downloads</td></tr><tr><td>打印机用 3 cc 注射器：&amp;nbsp;</td><td>Fishman Corporation</td><td>122051</td><td></td></tr><tr><td>22 G 分配器吸头</td><td>Fishman Corporation</td><td>Z520122&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10035-04-8</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>猪明胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9000-70-8</td><td></td></tr><tr><td>二氧化钛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13462-67-7</td><td></td></tr><tr><td>Protanal LF 20/40 海藻酸盐（海藻酸钠）</td><td>FMC BioPolymer</td><td>9005-38-3</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>乙二醇</td><td>Mallinckrodt Baker, Inc</td><td>9300-01</td><td></td></tr><tr><td>高碘酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7790-28-5</td><td></td></tr><tr><td>hADSC</td><td>Lonza</td><td>PT-5006</td><td>使用前保存于液氮中。</td></tr><tr><td>杜氏改良伊格尔培养基</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热。</td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA</td><td>Lonza</td><td>CC-5012</td><td>使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热。</td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>C3100MP</td><td>使用前避光保存于 -80 &amp;deg;C。</td></tr><tr><td>活/死哺乳动物细胞活力检测试剂盒</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>L-3224</td><td>使用前避光保存于 -80 &amp;deg;C。</td></tr><tr><td>MES 水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2933</td><td></td></tr><tr><td>N-羟基琥珀酰亚胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>130672</td><td></td></tr><tr><td>1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺 (EDC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1769&amp;nbsp;</td><td>10 G</td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液，含钙，含镁</td><td>Life Technologies</td><td>14040133</td><td>使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热。</td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液，无钙，无镁</td><td>Life Technologies</td><td>14190144</td><td>使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热。</td></tr><tr><td>RGD 肽</td><td>International Peptides</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 鬼笔环肽染色剂</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>A22283</td><td>使用前保存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>(4&amp;rsquo;,6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐) (DAPI) 染色剂</td><td>Life Technologies</td><td>R37606</td><td>使用前保存于 -20 &amp;deg;C</td></tr></tbody></table>

使用三喷头笛卡尔打印机进行细胞构建物生物打印的活性研究

Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

组织工程已将研究重点集中于构建用于替代功能失常或受损组织的仿生结构。三维生物打印技术在组织工程中的应用，为细胞与基质的打印提供了构建仿生组织的新方法。为实现三维生物打印而开发的实体自由成形制造（SFF）技术，采用增材制造策略，通过逐层沉积细胞液滴与水凝胶的方式进行构建。生物打印的制造过程依赖于将生物材料精确地定位至三维结构中，所打印的构建物应能高度模拟天然组织中细胞与细胞外基质的复杂空间组织。本文重点介绍帕尔梅托打印机（Palmetto Printer）——一种笛卡尔式生物打印机——在制备空间有序、具有活性的构建物中的应用，同时实现对环境因素的可控调节。该方法利用计算机辅助设计与计算机辅助制造技术，以生成特定且复杂的几何结构。最终，该策略可通过可调控的打印参数，实现构建物的可重复、优化生产。

结果表明，该生物打印机能够利用计算机辅助软件，准确且一致地将含细胞水凝胶沉积到特定的三维位置。这些软件可确定每个液滴的放置位置，并控制分配过程中的多个参数（图3,4）。生物打印机在组织工程应用中能否成功，其关键在于对生物材料进行精确沉积的可重复性。
细胞活性是成功生物打印技术所需满足的条件之一，在打印后1小时和8天进行了分析。高细胞活性对于构建仿生结构至关重要，也是生物墨水性能良好的直接体现。RGD肽的偶联可通过促进细胞铺展，从而在较长时间内提高细胞活性。采用荧光显微镜对打印后结构中的细胞活性进行定量分析。浓度为15%、氧化度为5%的海藻酸盐生物墨水在第0天的细胞活性为98%，第4天为96%，第8天为95%（图5）。这些结果表明，直接书写式生物打印机的沉积技术能够温和地挤出细胞，从而生成在打印过程中及打印后均保持活性的结构（图1、2）。高细胞活性说明氧化度5%、浓度15%的海藻酸盐生物墨水是适合细胞沉积的载体，为细胞存活提供了适宜的环境。各区域中相似的细胞数量表明海藻酸盐生物墨水中...

设计并制造了一种笛卡尔式生物打印机，可实现多种材料在精确且可重复的几何形状中的沉积，同时允许对环境因素进行控制。利用该三维生物打印机，可打印出复杂且具有活性的结构，并能够轻松实现重复制备。

组织工程已将研究重点集中于构建用于替代功能失常或受损组织的替代物。通过利用……

本实验的总体目标是利用3D生物打印机生成具有复杂几何结构且含存活细胞的构建物。首先从培养物中分离人脂肪组织基质细胞，然后将细胞与新配制的氧化RGD偶联海藻酸盐生物墨水混合，从而实现这一目标。在最后一步中，通过生物打印将生物材料中的细胞LA挤出。最终，使用共聚焦显微镜分析生物打印细胞的活性、增殖和迁移情况。与现有的支架成型和细胞接种等方法相比，本方法的主要优势在于，能够直接将细胞和细胞聚集体精确地放置在形成组织所需的位置。今天由我实验室的研究生 Sarah Grace Dennis 演示该实验步骤。首先，在 T75 培养瓶中加入 350,000 个人类脂肪组织基质细胞，并加入 15 毫升低糖 TMEM 培养基，在细胞培养箱中进行扩增培养。当细胞融合度达到 80% 时，移除培养基，并用 5 毫升不含钙和镁的 DPBS 缓冲液冲洗细胞。然后，当细胞脱落时，在37摄氏度下用5毫升胰蛋白酶和DPBS孵育细胞2分钟，加入3毫升细胞培养基以终止酶反应，并将细胞转移至50毫升锥形管中。接下来，离心细胞，并将沉淀重悬于2毫升细胞培养基中。随后对细胞进行计数，取1.3 × 10⁶个细胞分装至15毫升锥形管中，再次离心收集细胞。将沉淀物悬浮于1 mL新鲜配制的生物墨中，注意将细胞均匀分散至整个海藻酸盐水溶液中。然后将细胞转移至无菌、适用于打印机的3 mL注射器中，并拧上无菌的22号塑料喷嘴。现在打开生物打印机、各分配器计算机以及循环水浴装置。手动将浴槽温度设置为四摄氏度，以调节作用机制以及在相应的分配器计算机上设置每个分配器的打印参数。将分配体积设为 230 纳升，回退步数设为零，分配速率为 10 微升每秒。然后打开设计软件以及用于在计算机上查看 USB 相机显示的程序。接下来，手动输入一个 5×5 点阵的坐标，液滴之间的间距为 2.4 毫米。保存程序并将程序发送至机器人。然后将含有明胶二氧化钛的培养皿放置在 4°C 的打印平台，关闭并锁紧腔室门。使用可编程逻辑控制器启动紫外光源，对腔室进行消毒。90秒后，打开腔室，将装有 人脂肪组织基质细胞悬液的注射器装入一号枪中，关闭并锁紧腔室门，然后使用可编程逻辑控制器启动风扇系统。等待30秒，使内部压力达到平衡，随后在整个打印过程中运行包含几何路径和打印参数的程序。观察计算机上的USB摄像头显示，以确认打印的准确性和均匀性。为了定量分析生物打印结构的存活率，将其浸入新配制的染色液中。然后将结构置于冰箱中避光冷藏15分钟，使染色充分固定。然后使用共聚焦显微镜图像，观察染色后的细胞结构：若细胞呈黄色或绿色，则判定为活细胞；若呈红色，则判定为死细胞。如这些结果所示，生物打印技术能够借助计算机软件，精确且一致地将细胞悬液和水凝胶沉积到特定的三维位置。计算机软件可确定每个液滴的定位，并控制分配过程中的多项参数。成功生物打印技术的要求之一是细胞在此过程中保持活性。如上所述，使用海藻酸生物墨水打印的细胞在打印后一小时和第八天进行了分析，结果显示第零天时98%的细胞呈绿色且具有活性，第八天时仍保持95%的活性。由于红色染色表明在两个时间点观察到的死亡细胞均很少，这证实了该替代墨水适用于生物打印。此外，RGD偶联的海藻酸盐墨水可增强细胞在打印结构上的黏附，从而促进细胞铺展和增殖，该效应通过在水凝胶的三个独立区域于第0天和第8天进行定量分析得以证实。在此，比较了第8天时RGD肽在Ginnet生物墨水中偶联质量与单独使用Ginnet生物墨水的情况。在RGD偶联的Ginnet染色样品中观察到的细胞铺展表明该肽已成功整合至Ginnet中，而这一现象在未偶联的生物打印样品中则明显缺失。该技术为组织工程领域的研究人员探索利用增材制造来构建活体工程化结构开辟了道路。

viability-bioprinted-cellular-constructs-using-three-dispenser

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

Bioprinted蜂窝构造的可行性使用三分配器笛卡尔打印机

本文所述方法展示了如何将商用喷墨打印机改装为具有同步紫外光聚合功能的生物打印机。该打印机能够利用细胞和生物材料构建三维组织结构。本研究成功构建了三维新生软骨。...

利用三维喷墨打印技术制备人类软骨组织

我们描述了一组联合使用的方案，可共同制备出具有组织模拟特性的水凝胶生物墨水，用于生物打印功能完整且存活的三维组织结构 体外...

使用组织特异性水凝胶生物墨水打印细胞化结构

本方案描述了一种使用自动化机器人沉积系统的生物打印方法，该方法结合了刻蚀的拓扑引导线索与承载细胞的水凝胶生物墨水的精确沉积。打印的细胞被直接递送至刻蚀结构中，并能够感知并沿其定向排列。...

用于细胞表面引导与生物打印的自动化机器人分配技术

本方案描述了无需使用生物材料的三维心脏组织生物打印技术。三维生物打印的心脏补片表现出组分球状体之间的机械整合，在心脏组织再生及作为心脏疾病的三维模型方面具有广阔的应用前景。...

利用3D生物打印技术构建表现出类球体机械整合的心脏组织

我们提供一种基于微流控生物打印策略的通用方案，用于构建微纤维血管床，其中可进一步将第二种细胞类型接种于该微纤维结构的间隙空间，以生成带血管化的组织和类器官。...

用于构建血管化组织和类器官的微流控生物打印技术

使用基于纳米纤维素-海藻酸盐的生物墨水对软骨和皮肤类似物进行生物打印。打印前通过单步被动混合装置对生物墨水进行细胞接种。结果显示，所构建的组织结构细胞分布均匀，细胞活力高，并表现出良好的分化标志物。...

利用新型被动混合单元技术实现生物墨水预细胞化的软骨与皮肤组织类似物生物打印

我们开发了一种异质性乳腺癌模型，该模型由永生化的肿瘤细胞和成纤维细胞嵌入可生物打印的海藻酸盐/明胶生物墨水中构成。该模型可重现 体内...

可生物打印的海藻酸盐/明胶水凝胶3D 体外 模型系统诱导细胞球体形成

工程化皮瓣需要整合功能性血管网络。在本方案中，我们介绍一种制造包含分级血管网络的3D打印组织皮瓣的方法，并将其直接与大鼠股动脉进行显微外科吻合。...

利用3D打印技术制备工程化血管皮瓣

水凝胶形成过程中的剪切处理可产生微凝胶悬浮液，该悬浮液具有剪切变稀特性，但在去除剪切力后能迅速重构。此类材料已被用作生物打印复杂、含细胞结构的支撑基质。本文描述了用于制备支撑床及相容性生物墨水的方法。...

通过凝胶化过程中剪切处理形成琼脂糖流体凝胶用于悬浮3D生物打印

利用κ-卡拉胶亚微凝胶介质嵌入式生物打印类组织结构

可溶性基底膜提取物是癌症研究中最常用的生物基质，但其复杂的流变行为使得在商业化的生物打印系统上进行生物打印十分困难。本研究提出了一种定制化的生物打印策略，能够以良好的形状保真度制备出单层和多层的纯基质结构。...

用于转化研究中可溶性基底膜提取物生物打印的容积式挤出生物打印机的设计与验证

学习使用三分配器笛卡尔打印机进行生物打印，制备含人脂肪组织基质细胞的活性细胞负载构建体。该方法通过精确控制细胞 placement，结合氧化RGD偶联海藻酸生物墨水，实现复杂几何结构的组织工程应用，并利用共聚焦显微镜分析细胞活力、增殖和迁移特性。

使用三喷头笛卡尔打印机进行细胞构建物生物打印的活性研究

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