神经干细胞和祖细胞来自成年小鼠脑室下区细胞分选和实时成像的细胞周期动力学

该程序的总体目标是跟踪从转基因荧光泛素化细胞周期的脑室下区分离的分选神经干细胞及其后代的细胞周期进程，称为 FCI 小鼠。这是通过首先解剖转基因成年小鼠大脑的脑室下区来实现的。第二步是使用木瓜处理将神经元组织解离成单细胞悬液。

接下来，使用抗体标记脑室下区的不同神经源性细胞群，以识别静止神经干细胞、活化神经干细胞、过境扩增细胞以及未成熟和迁移的神经母细胞。最后一步是使用 FACTS 将细胞直接分选到新鲜培养基中，然后再将它们接种在聚 D 赖氨酸包被的板上。最终，连续延时视频显微镜用于研究铺板细胞的细胞周期进程，因为各种转基因细胞在其细胞周期中的不同时间点发出荧光。

将细胞分选技术与 Fuji 技术相结合，可以从脑室下区可视化和分离不同的细胞群，从而能够研究成人运动大脑的特性和动力学。这种方法可以帮助回答衰老和大脑病理学背景下的关键问题 实验前一天.将每毫升 10 微克的聚 D 赖氨酸溶液加入无菌黑壁 96 孔板的每个孔中，以涂覆孔底部，盖上盖子，并在第二天在 37 摄氏度下孵育板过夜。

取出聚 D 赖氨酸溶液，用无菌蒸馏水冲洗孔 3 次，然后让板在层流下在通风橱中干燥至少两小时。如果不立即使用。将干燥的涂层板在 4 摄氏度下存放长达 7 天。

接下来，制备木瓜蛋白酶解离溶液，并通过使混合物通过 0.2 微米过滤器对其进行消毒。使用前将溶液预热至 37 摄氏度。此外，通过在 TM F 12 无菌培养基中加入 0.7 毫克/毫升 2 型抑制剂胰蛋白酶来制备蛋白酶抑制剂溶液。

使用 0.2 微米过滤器过滤溶液，并在使用前将溶液预热至 37 摄氏度。将来自成年 fucci 红鼠大脑的新鲜解剖的脑室下区放入含有 0.6% 葡萄糖的 PBS 培养皿中，将组织切碎，直到没有大块残留。然后将所有物质转移到 15 毫升试管中，以 200 倍 G 离心 5 分钟。

沉淀后，丢弃 snat 和 resus。将组织悬浮在一毫升预热的木瓜蛋白酶中，每毫升补充 0.01 毫克 DNA。一。将混合物在 10 摄氏度的水浴中孵育 37 分钟。

然后再次以 200 倍 G 离心 5 分钟，弃去 snat。加入 1 毫升 Prewarm OVO MOID 溶液以停止酶消化。接下来，使用 P 1000 微量移液器吸头轻轻上下移液 20 次，以便在移液时将切碎的组织机械解离成单细胞悬液。

避免在混合物中引入任何气泡，这会对细胞造成额外的压力。将细胞悬液通过新的 15 mL 试管中的无菌 20 微米过滤器。用两毫升含有 0.15% BSA 的 PBS 洗涤细胞过滤器，以避免细胞丢失。

然后将细胞悬液以 200 倍 G 离心 10 分钟。丢弃上清液。首先将每只小鼠的细胞悬浮到 100 微升含有 0.15% BSA 的 PBS 中，进行事实染色。

使用来自其中一只小鼠的十分之一细胞来制备四个对照中的每一个，如随附的文本方案中所述。将此处列出的一抗添加到用于细胞分选的每个试管中，并在 4 摄氏度的黑暗中孵育混合物 20 分钟。与一抗孵育后，用 1 毫升含 0.15% BS、A 的 PBS 洗涤细胞，然后以 200 倍 G 离心细胞 10 分钟。

将细胞重新悬浮在每个大脑中 200 微升含有 0.15% BSA 的 PBS 中，并将它们转移到适当的效果中。分拣管。将细胞分选管放在冰上，并在细胞分选前立即向细胞中添加重要染料，例如每毫升 2 微克的钩状 3 3 2 5 8 染色剂，以区分活细胞和死细胞。

接下来，通过事实运行阴性对照管中的细胞，并使用侧向散射和前向散射参数选择细胞。通过仅将钩子设通到负分数来排除死细胞，并通过选择具有负分数的脉冲来排除双峰。运行单色控件并在必要时调整光电倍增管电压。

在软件的补偿窗口中执行颜色补偿。运行三个荧光减一对照并绘制分选门。设置好所有门后，将标记的细胞直接分选到 100 μL 培养物中。

将新鲜分选的细胞以每孔 1000 至 3000 个细胞的密度接种到涂有 poly de lycine 的 96 孔板上。96 孔板，含 300 μL 培养基。将培养板在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育至少一小时。

为了实现细胞粘附，通过在 37% 二氧化碳气氛下将附带的温控室预热至 5 摄氏度来准备共聚焦激光扫描显微镜进行成像。将 96 孔板置于预热的显微镜腔室内，并使第一个孔聚焦。然后打开成像软件并在主窗口中右键单击以选择 acquire acquisition controls 和 DEAC acquisition。

要打开 TI pad 并选择计划 A PO VC 20 XDIC 物镜，请单击 acquire acquisition controls，然后打开延时选项。将每个孔的中心设置为载物台位置，并选择大图像选项为 7 x 7 平方毫米。观察每个图像中心周围的马赛克图像。

将大型马赛克图像的重叠设置为 5%，并设置频率，以便在 24 小时内每 20 分钟拍摄一次照片。在 one plus 设置下，为菜单栏中列出的每种荧光选择光电倍增管电压电平。选择使用高速共振扫描仪以 5 12 x 5 12 像素格式采集图像，并使用 DIC 可视化细胞。

然后选择一个文件夹来保存数据文件。选择 ND 采集窗口上的 run now 按钮开始采集。跟随计算机工作至少一个循环，以确保一切正常。

使用富士红小鼠使用延时视频显微镜用红色荧光跟踪 G 一期。分离的细胞在第一生长期呈红色荧光，在合成、第二生长期和有丝分裂期间呈我们的颜色列表。Lex 阳性、脑电图、FR 阳性和脑电图。

对来自年轻成年和中年小鼠的 FR 阳性细胞进行铺板并通过显微镜跟踪。S 和 G 两个 M 期长度显示 Lex 阳性、EGFR 阳性和 EG FFR 阳性细胞在年轻或中年小鼠中没有差异。然而，由于 G 一相长度的增加，发现在较老的细胞中，从第一次分裂到红色荧光关闭的下一个生长期的长度更长。

接种后 5 天获得的神经球在从老年小鼠获得的 Lex 阳性 EGFR 阳性细胞中较小。当处理 12 只小鼠时，整个方案的解剖和传真准备时间不应超过 3 小时，细胞分选时间不应超过 3 小时。请记住，我们在同一天处理过多的小鼠将导致细胞分选持续时间增加，并可能导致细胞死亡或细胞分化增加。