成年小鼠侧脑室下区神经干细胞与前体细胞的分选及细胞周期动态的活体成像

本实验的总体目标是追踪从转基因荧光泛素化细胞周期小鼠（简称FCI小鼠）的脑室下区分离并分选得到的神经干细胞及其子代细胞的细胞周期进程。该目标首先通过解剖转基因成年小鼠脑的脑室下区来实现；第二步是采用木瓜蛋白酶处理将神经组织解离为单细胞悬液。

接下来，使用抗体标记脑室下区不同的神经发生细胞群体，以鉴定静息态神经干细胞、激活态神经干细胞、过渡性扩增细胞以及未成熟且正在迁移的成神经细胞。最后一步是利用流式细胞分选技术将细胞直接分选至新鲜培养基中，随后将其接种于聚-D-赖氨酸包被的培养板上。最终，通过连续的活细胞延时视频显微镜观察，研究接种后细胞的细胞周期进程，其中各类转基因细胞在细胞周期的不同时间点会发出荧光。

将细胞分选技术与富士技术相结合，可实现对脑室下区不同细胞群体的可视化及分离，从而有助于研究成年大脑运动过程中细胞的特性与动态变化。该方法有助于解答与衰老及脑部病理相关的关键科学问题。实验前一天，向无菌黑色壁96孔板的每孔中加入约200微升浓度为10微克/毫升的多聚D-赖氨酸溶液，以包被孔底；盖好后于37摄氏度孵育过夜。

移除聚-D-赖氨酸溶液，用无菌蒸馏水清洗孔板三次，然后在层流罩中干燥至少两小时。若不立即使用，可将干燥后的包被板在4°C保存最多七天。

接下来，制备木瓜蛋白酶解离溶液，并通过0.2微米滤器过滤以实现灭菌。使用前将溶液预热至37摄氏度。同时，通过向TM F12培养基（无菌）中加入0.7毫克/毫升的胰蛋白酶抑制剂II型，制备蛋白酶抑制剂溶液。

使用0.2微米滤器过滤溶液，并在使用前将溶液预热至37摄氏度。将成年fucci红色小鼠脑中新鲜解剖的室下区组织放入含有0.6%葡萄糖的PBS的培养皿中，将组织切碎至无大块残留。然后将所有组织转移至15毫升离心管中，在200 × g下离心5分钟。

组织沉淀后，弃去上清液并重悬。将组织悬浮于1毫升预热的木瓜蛋白酶溶液中，该溶液添加有0.01毫克/毫升的DNA酶I。将混合物在37摄氏度水浴中孵育10分钟。

然后在200 × g下再次离心5分钟，并弃去上清液。加入1毫升预热的OVO MOID溶液以终止酶消化反应。接下来，使用P1000微量移液器吸头轻轻吹打20次，通过机械方式将剪碎的组织解离成单细胞悬液，同时进行移液操作。

避免将气泡引入混合物中，以免对细胞造成额外应力。将细胞悬液通过一个无菌的20微米滤器，收集到新的15毫升离心管中。用2毫升含0.15% BSA的PBS洗涤细胞滤器，以避免细胞损失。

然后以200 × g离心细胞悬液10分钟。弃去上清液。进行表面染色时，先将每只小鼠的细胞重悬于100 µL含有0.15% BSA的PBS中。

使用一只小鼠细胞的十分之一，按照随附的文字方案制备四个对照样品。将此处列出的初级抗体分别加入用于细胞分选的各管中，在4°C避光孵育20分钟。初级抗体孵育结束后，用1毫升含0.15% BSA的PBS洗涤细胞，然后在200 × g离心10分钟。

将细胞重悬于每只小鼠脑组织200微升含0.15% BSA的PBS中，并转移至相应的分选管中。将细胞分选管置于冰上，并在细胞分选前立即向细胞中加入终浓度为2微克/毫升的Hoechst 33258等活体染料，以区分活细胞与死细胞。

接下来，对阴性对照管中的细胞进行流式分析，使用侧向散射和前向散射参数圈选细胞。通过圈选阴性组分中的单细胞群体排除死细胞，同时通过选择阴性组分中的脉冲信号排除双联体。运行单色对照，并在必要时调整光电倍增管电压。

在软件的补偿窗口中进行颜色补偿。运行三项减去一项荧光对照，绘制分选门。所有门设置完毕后，直接将标记的细胞分选至100微升培养液中。

将 freshly sorted 的细胞以每孔 1000 至 3000 个细胞的密度接种到含 300 微升培养基的多聚赖氨酸包被的 96 孔板中。将培养板置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳环境中孵育至少 1 小时。

为了促进细胞贴壁，将共聚焦激光扫描显微镜的附带温控腔室在5%二氧化碳气氛下预热至37摄氏度，以准备成像。将96孔板放入预热的显微镜腔室内，并将第一孔调至焦点。然后打开成像软件，在主窗口中右键单击，选择“采集控制”和“DEAC采集”。

为了打开 TI 载物台并选择 Plan A PO VC 20 XDIC 物镜，请依次点击“采集”控制按钮，然后打开延时成像选项。将每个孔的中心设置为载物台位置，并选择“大图像”选项，设定为 7×7 毫米平方。观察每个孔中心周围的拼接图像。

设置大拼接图像的重叠率为5%，并设置频率，使每20分钟拍摄一次图像，持续24小时。在“一加”设置下，从菜单栏中选择每种荧光对应的光电倍增管电压水平。选择使用高速共振扫描仪以512×512像素的格式采集图像，并使用微分干涉差（DIC）显微技术观察细胞。

然后选择一个文件夹以保存数据文件。在ND采集窗口中点击“立即运行”按钮以开始采集。在至少一个循环期间跟随计算机操作，确保所有设备正常工作。

使用Fuji红小鼠，通过延时视频显微镜利用红色荧光追踪G1期。分离的细胞在第一个生长期呈红色荧光，而在合成期、第二个生长期及有丝分裂期间则失去荧光。Lex阳性eeg FR阳性及eeg。

通过显微镜对年轻成年和中年小鼠的FR阳性细胞进行铺板并追踪观察。在年轻或中年小鼠中，Lex阳性EGFR阳性细胞与EGFR阳性细胞之间的S期和G2/M期时长均无差异。然而，由于G1期时长增加，导致在较年老的细胞中，从第一次分裂开始至红色荧光关闭的下一个生长期持续时间更长。

从较年老小鼠中获得的Lex阳性EGFR阳性细胞在接种后第五天形成的神经球较小。在处理12只小鼠时，整个操作流程的解剖和组织固定准备时间不应超过三小时，细胞分选时间另需三小时。请注意，同一天处理过多小鼠将导致细胞分选时间延长，可能引起细胞死亡或细胞分化增加。