Name: 神经干细胞和祖细胞来自成年小鼠脑室下区细胞分选和实时成像的细胞周期动力学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-14T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: 了解利用荧光激活细胞分选技术从成年小鼠脑室下区分离神经干细胞及其子代的方法，结合FUCCI实时成像技术追踪细胞周期动态变化，为研究神经发生及脑衰老机制提供重要工具。

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我们感谢C Joubert、V Neuville、V Barroca、J Tilliet以及动物实验设施的所有工作人员；感谢J Baijer和N Dechamps在细胞分选方面的帮助；感谢O. Etienne提供的技术协助，以及A. Gouret在行政事务上的支持。流式细胞术和细胞分选实验在iRCM流式细胞术共享资源平台完成，该平台的设备经费来自DIM-Stem-Pôle、法国国家健康与医学研究院（INSERM）、ARC基金会和法国原子能和替代能源委员会（CEA）的设备资助。本研究工作得到了法国电力公司（EDF）资助项目的支持。M.D. 获得了法国抗癌联盟（La Ligue Contre le Cancer）的博士后资助，L.M. 获得了法兰西岛大区（Région Ile-de-France，DIM Biothérapies）的资助。Marc-André Mouthon和François D. Boussin共同担任本文的通讯作者。&#160;

本方案已根据1986年11月24日欧洲共同体理事会指令（86/609/EEC）制定，并已获得本机构动物福利委员会（CETEA-CEA DSV IdF）批准。
1. 培养与视频显微镜观察前的基本准备
<ol>
	<li>使用带玻璃底的培养板或 µ-板进行共聚焦视频显微镜观察。对于每孔 1 - 5 × 103&#160;个细胞，使用 96 孔板；每孔超过 5 × 103 个细胞时，使用 24 孔板。</li>
	<li>在开始实验前至少一天，制备无菌的多聚-L-赖氨酸（PDL）包被板，用于贴壁单层培养。加入足量 PDL（10 µg/ml 溶于 dH₂O）以覆盖每个孔的底部，并在 37 °C 下孵育过夜。移除 PDL 溶液后，用 dH2O 洗涤三次，然后在超净台中层流条件下干燥至少 2 小时&#160;。若不立即使用，将包被板储存于 -20 °C。</li>
	<li>通过将 NSC 基础培养基与 NSC 增殖添加剂按 9:1 比例混合（见材料表），并加入 2 µg/ml 肝素、20 ng/ml 纯化人重组表皮生长因子（EGF）和 10 ng/ml 人重组成纤维细胞生长因子 2（FGF-2），配制培养基。使用前在水浴中将培养基预热至 37 °C。</li>
	<li>为进行侧脑室下区（SVZ）组织解离，配制木瓜蛋白酶溶液：在含有 0.2 mg/ml L-半胱氨酸、0.2 mg/ml EDTA 和 0.01 mg/ml DNase I 的 PBS 中，用 Earle's 平衡盐溶液（EBSS）配制 1 mg/ml 木瓜蛋白酶（15 UI/ml）。通过 0.2 µm 滤器过滤灭菌，并在使用前平衡至 37 °C。</li>
	<li>为终止酶反应，配制蛋白酶抑制剂溶液（卵黏蛋白）：在 DMEM:F12 培养基中加入 0.7 mg/ml II 型胰蛋白酶抑制剂。使用 0.2 µm 滤器过滤该溶液。</li>
	<li>配制含 0.6% 葡萄糖的 PBS 溶液用于脑组织收集，配制含 0.15% BSA 的 PBS 溶液用于洗涤步骤及抗体染色。</li>
	<li>准备解剖工具：剪刀、解剖镊、结扎镊、手术刀，并将其浸泡于 70% 乙醇中。</li>
</ol>
2. 成年小鼠脑组织的采集及脑室下区显微解剖
<ol>
	<li>根据相关机构指南，通过颈椎脱位法处死成年FUCCI小鼠23（用于衰老研究的2至3月龄和/或12月龄小鼠）。</li>
	<li>用70%乙醇喷洒小鼠，并使用锋利的剪刀剪下头部。</li>
	<li>沿头皮做切口以暴露颅骨。</li>
	<li>使用小型剪刀从颅底开始沿中线向嗅球方向进行纵向剪切，注意避免剪刀刀片损伤下方脑组织。用弯头镊子移除颅骨上部开口部分，以暴露脑组织。</li>
	<li>将脑组织收集至含有PBS加0.6%葡萄糖的15 mm培养皿中。</li>
	<li>解剖去除嗅球。将脑组织背侧朝下放置，使用解剖刀在视交叉处进行冠状切面切割。</li>
	<li>在解剖显微镜下，将脑切片的前部放置，使冠状切面朝上并面向操作者。</li>
	<li>为解剖侧脑室下区（SVZ），先用细弯头镊子去除隔区，然后将细镊子的一端插入紧邻脑室的纹状体部位，将SVZ从周围组织中分离。更多细节请参见Azari et al.24。将分离的SVZ组织置于含有1 ml PBS加0.6%葡萄糖的培养皿中。</li>
</ol>
3. SVZ 组织解离
<ol>
	<li>在培养皿中将解剖得到的脑室下区（SVZ）组织切碎，直至无大块组织残留。</li>
	<li>将切碎的组织连同PBS-0.6%葡萄糖溶液转移至15 ml离心管中，在200 × g条件下离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，加入1 ml预热的木瓜蛋白酶溶液（1 mg/ml，按步骤1.4配制），并添加0.01 mg/ml DNase I。于37 °C水浴中孵育10分钟。每只小鼠使用1 ml木瓜蛋白酶溶液。</li>
	<li>在200 × g条件下离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>加入1 ml预热的卵黏蛋白溶液（0.7 mg/ml，按步骤1.5配制）以终止木瓜蛋白酶活性。通过使用p1000移液器枪头轻柔吹打20次，将组织进一步机械解离成单细胞悬液。避免产生气泡。</li>
	<li>将细胞悬液通过一个新的无菌15 ml离心管中的20 µm滤膜过滤。务必用含0.15% BSA的PBS冲洗滤膜，以防止细胞损失。</li>
	<li>在200 × g条件下离心10分钟，弃去上清液。将细胞重悬于100 µl&#160;含0.15% BSA的PBS中。</li>
</ol>
4. 用于细胞分选的免疫荧光染色
使用FUCCI-红色小鼠进行细胞分选时（图2A），请使用以下抗体：CD24藻红蛋白-花青素7偶联物[PC7]&#160;；CD15/LeX异硫氰酸荧光素[FITC]偶联物以及Ax647偶联的EGF配体。
注意：LeX+EGFR+ 细胞和EGFR+ 成年SVZ中的细胞并不丰富： &#8776; 600 和 1500 个细胞/小鼠，分别9建议将2至3只小鼠的SVZ细胞合并，以获得足够的材料。同一天处理的小鼠数量不要超过12只，以确保细胞分选时间不超过3小时。请注意，同一天处理过多小鼠将导致细胞分选时间延长，可能引起细胞死亡增加和/或细胞发生分化。
<ol>
	<li>每只小鼠使用 100 µl&#160;含 0.15% BSA 的 PBS 进行 FACS 染色（若为 2 至 3 只小鼠的样本组合，使用 200 µl 以获得最佳染色效果）。</li>
	<li>准备对照管。根据制造商说明书，使用补偿微珠制备单色对照&#160;管。取部分细胞（一只小鼠提取细胞的 1/10 即可），分装至 4 个管中，用于制备 1 个阴性对照管（未标记细胞）和 3 个荧光减一（FMO）对照管。每管用 200 µl 含 0.15% BSA 的 PBS 重悬细胞。 
	提示：LeX-FITC 的 FMO 对照，使用 CD24-PC7（1:50）和 Ax647 标记的 EGF 配体（1:200）对细胞进行标记；CD24-PC7 的 FMO 对照，使用 CD15/LeX-FITC（1:50）和 Ax647 标记的 EGF 配体（1:200）进行标记；Ax647 标记的 EGF 配体的 FMO 对照，使用 CD15/LeX-FITC（1:50）和 CD24-PC7（1:50）进行标记。</li>
	<li>对于用于细胞分选的管，使用以下抗体以指定稀释比例加入含 0.15% BSA 的 PBS 中：CD24-PC7（1:50）、CD15/LeX-FITC（1:50）和 Ax647 标记的 EGF 配体（1:200）。</li>
	<li>在 4 °C 避光孵育 20 分钟。加入 1 ml 含 0.15% BSA 的 PBS 洗涤，200 × g 离心 10 分钟。每只小鼠脑组织来源的细胞用 200 µl 含 0.15% BSA 的 PBS 重悬。将用于细胞分选的管置于冰上，并立即进行细胞分选。</li>
	<li>若使用 FUCCI-Green 小鼠，在细胞分选前需使用分离柱分离 LeX 阳性和 LeX 阴性组分，因为 LeX-FITC 抗体的发射波长与 FUCCI-green 荧光相同（图 3A,B）。
	<ol>
		<li>首先，在 100 µl&#160;含 0.15% BSA 的 PBS 中，加入小鼠抗人 LeX 抗体（1:50），4 °C 避光孵育 15 分钟。</li>
		<li>用 1 ml 含 0.15% BSA 的 PBS 洗涤细胞，200 × g 离心 10 分钟，然后在 4 °C 避光条件下加入抗小鼠 IgM 磁珠（1:10）孵育 15 分钟。</li>
		<li>用 1 ml 含 0.15% BSA 的 PBS 洗涤细胞，200 × g 离心 10 分钟。将细胞重悬于 500 µl 含 0.15% BSA 的 PBS 中，并按 图 3 C 所示，在磁场中通过分离柱。用 1 ml 含 0.15% BSA 的 PBS 洗涤柱子，收集 LeX 阴性组分。</li>
		<li>为获得 LeX 阳性组分，将分离柱移出磁场，用 2 ml 含 0.15% BSA 的 PBS 洗脱细胞。</li>
		<li>按照步骤 4.2 所述，进行 CD24-PC7 和 Ax647 标记的 EGF 配体染色。</li>
	</ol>
	 </li>
</ol>
5. 细胞分选
注意：细胞使用流式细胞分选仪进行分选，分选条件为 40 Psi 压力，配备 86 µm 喷嘴。荧光信号采集使用的滤光片组如下：520/35 nm（FITC）、575/26 nm（PE）、670/20 nm（Ax647）和 740LP（PC7）。由于FUCCI-红色荧光与PC7染料的发射光谱存在重叠，必须进行补偿调节，以避免出现假阳性信号。
<ol>
	<li>细胞分选前立即加入活细胞染料以区分活细胞与死细胞。我们使用了HO（见材料表），其工作浓度为2 &#181;g/ml 终浓度。将阴性对照管（未标记细胞）上样至流式细胞分选仪，根据侧向散射（SSC）和前向散射（FSC）参数选择细胞（图1A). 
	注意：通过仅圈选HO阴性部分来排除死细胞（图1A’）随后通过选择脉冲宽度负分数排除双联体（doublets）图1A&#8217;&#8217;).</li>
	<li>运行步骤 4.2 中制备的单色对照，并在必要时调整光电倍增管（PMT）电压（即 阴性群体过高和/或阳性细胞超出量程。在软件的补偿窗口中进行颜色补偿。</li>
	<li>运行第4.2步制备的FMO对照（LeX-FITC FMO对照、CD24-PC7 FMO对照和Ax647偶联EGF配体FMO对照），并绘制分选门图1）。将细胞直接分选至100 &#181;1.5 ml 微管中的培养基</li>
</ol>
6. 显微镜观察用细胞的制备
<ol>
	<li>将 freshly sorted 的细胞以每孔 1 - 3 × 103&#160;个细胞的密度接种于含 300 µl 培养基的 Poly-D-Lysine 包被的 96 孔 µ-板中。</li>
	<li>进行视频显微观察前，将培养板在 37 °C、5% CO2 条件下孵育至少 1 小时，以促进细胞贴壁。</li>
</ol>
7. 显微镜设置与图像采集
<ol>
	<li>使用配备倒置恒温培养室（37℃）的共聚焦激光扫描显微镜系统，结合 Plan Apo VC 20x DIC 物镜（数值孔径：0.75）进行活细胞成像 &#176;C，5% CO条件下2 大气</li>
	<li>将96孔板 &#181;-将培养皿放入预热并平衡好的恒温腔室内，并用恒温盖替换原有盖子。</li>
	<li>打开 NIS-Elements 软件，然后在菜单栏中点击 &#34;获取/采集控制/ND 采集”以选择延时拍摄的选项（时长、载物台位置、共聚焦 z 轴切片，&#8230;), &#34;获取/采集控制/Ti 垫片”以选择物镜 &#34;在菜单栏中选择“采集/采集控制/A1plus 设置”以设定每种荧光的 PMT 水平。选择一个文件夹以保存数据文件。</li>
	<li>使用 ND 采集窗口，将每个孔的中心设为载物台位置，并选择大图像选项为 7 × 7 mm&#178;这将在每个孔的中心周围生成一幅马赛克图像。将大马赛克图像的重叠率设置为5%。每20分钟拍摄一次，持续24小时。在Ti Pad窗口中选择Plan Apo VC 20x DIC物镜（NA：0.75）。</li>
	<li>在 A1plus 设置窗口中，使用高速共振扫描器以 512 × 512 像素的格式采集图像，分辨率为 1.26 &#181;m/像素。使用明场观察细胞形态。对于FUCCI-红小鼠，以561 nm激发红荧光，并使用595/50 nm滤光片采集信号。对于FUCCI-绿小鼠，以488 nm激发绿荧光，并使用530/40 nm滤光片采集信号。针对每个波长，确定最佳的PMT增益、偏移量和激光功率。 
	注意：我们建议为明场通道启用自动对焦功能，以便软件在每次采集前于每个成像位置自动对焦。提示：使用了 Plan Apo VC 20x DIC 物镜（NA：0.75），因其具有优异的分辨率且无需使用镜油。可根据所需的光学分辨率选择其他物镜。</li>
	<li>在 ND 采集窗口中选择“立即运行”按钮以开始采集。 
	提示：先跟随计算机完成一个循环，以确保所有设备正常运行。</li>
</ol>
8. 图像处理与分析
<ol>
	<li>在 NIS-Elements 软件中通过单独追踪细胞直接分析数据。提示：为节省时间，可使用 NIS-Elements 软件将每个位置保存为 .avi 格式，然后使用 ImageJ 分析视频。</li>
	<li>在 ImageJ 软件中，追踪至少经历 2 次分裂的单个细胞（即 一个细胞到四个细胞的菌落）。在细胞周围裁剪一个小区域，然后选择“图像/复制”。</li>
	<li>在菜单栏中选择“图像/堆栈/制作拼接图”以生成拼接图像。指定要包含的帧、图像尺寸，并将拼接图保存为 .tif 文件以获得最佳分辨率。</li>
	<li>计算第一个S-G2M期长度（图2C,D），选择一个红色荧光细胞（处于G1）然后将 t = 0 设定为红荧光关闭时（S 期将在红荧光关闭后开始）。计数至细胞分裂时的帧数，以估算 S-G 期持续时间2/米 长度 
	注意：计算出的时间取决于每帧之间的时间间隔。</li>
	<li>计算以下G1期图2C,D），继续追踪刚刚完成分裂的细胞。如果该分裂后的细胞进入G1期，将出现cdt1红色荧光蛋白的积累。计算每个细胞从荧光出现到红色荧光再次关闭所需的帧数。 
	提示：在G的开始阶段1 红色荧光可能较弱，因此选择G期的起始点1 在细胞分裂的帧上进行相位分析，以避免近似处理。</li>
</ol>

<ol><li>Morshead, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+in+the+adult+mammalian+forebrain+a+relatively+quiescent+subpopulation+of+subependymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells in the adult mammalian forebrain a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells.</a> Neuron. 13, 1071-1082 (1994).</li>
<li>Pastrana, E., Cheng, L. C., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+prospective+purification+of+adult+subventricular+zone+neural+stem+cells+and+their+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Simultaneous prospective purification of adult subventricular zone neural stem cells and their progeny.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 6387-6392 (2009).</li>
<li>Doetsch, F., Caille, I., Lim, D. A., Garcia Verdugo, J. M., Alvarez Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subventricular+zone+astrocytes+are+neural+stem+cells+in+the+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain.</a> Cell. 97, 703-716 (1999).</li>
<li>Kriegstein, A., Alvarez Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).</li>
<li>Lois, C., Garcia Verdugo, J. M., Alvarez Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chain+migration+of+neuronal+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chain migration of neuronal precursors.</a> Science. 271, 978-981 (1996).</li>
<li>Fuentealba, L. C., Obernier, K., Alvarez Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neural+stem+cells+bridge+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Adult neural stem cells bridge their niche.</a> Cell stem cell. 10, 698-708 (2012).</li>
<li>Rietze, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+a+pluripotent+neural+stem+cell+from+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain.</a> Nature. 412, 736-739 (2001).</li>
<li>Fischer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+isolation+of+adult+neural+stem+cells+from+the+mouse+subependymal+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Prospective isolation of adult neural stem cells from the mouse subependymal zone.</a> Nat Protoc. 6, 1981-1989 (2011).</li>
<li>Daynac, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quiescent+neural+stem+cells+exit+dormancy+upon+alteration+of+GABAAR+signaling+following+radiation+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Quiescent neural stem cells exit dormancy upon alteration of GABAAR signaling following radiation damage.</a> Stem Cell Res. 11, 516-528 (2013).</li>
<li>Codega, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+and+purification+of+quiescent+adult+neural+stem+cells+from+their+in+vivo+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Prospective identification and purification of quiescent adult neural stem cells from their in vivo niche.</a> Neuron. 82, 545-559 (2014).</li>
<li>Mich, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+functionally+distinct+stem+cells+and+neurosphere-initiating+cells+in+adult+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain.</a> Elife. 3, e02669(2014).</li>
<li>Capela, A., Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LeX+ssea+1+is+expressed+by+adult+mouse+CNS+stem+cells+identifying+them+as+nonependymal%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">LeX ssea 1 is expressed by adult mouse CNS stem cells identifying them as nonependymal.</a> Neuron. 35, 865-875 (2002).</li>
<li>Calaora, V., Chazal, G., Nielsen, P. J., Rougon, G., Moreau, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mCD24+expression+in+the+developing+mouse+brain+and+in+zones+of+secondary+neurogenesis+in+the+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">mCD24 expression in the developing mouse brain and in zones of secondary neurogenesis in the adult.</a> Neuroscience. 73, 581-594 (1996).</li>
<li>Pineda, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+derived+TGF-beta+increases+in+the+stem+cell+niche+and+perturbs+neurogenesis+during+aging+and+following+irradiation+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Vascular derived TGF-beta increases in the stem cell niche and perturbs neurogenesis during aging and following irradiation in the adult mouse brain.</a> EMBO Mol Med. 5, 548-562 (2013).</li>
<li>Lugert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quiescent+and+active+hippocampal+neural+stem+cells+with+distinct+morphologies+respond+selectively+to+physiological+and+pathological+stimuli+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Quiescent and active hippocampal neural stem cells with distinct morphologies respond selectively to physiological and pathological stimuli and aging.</a> Cell stem cell. 6, 445-456 (2010).</li>
<li>Blackmore, D. G., Golmohammadi, M. G., Large, B., Waters, M. J., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+increases+neural+stem+cell+number+in+a+growth+hormone+dependent+manner++augmenting+the+regenerative+response+in+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Exercise increases neural stem cell number in a growth hormone dependent manner augmenting the regenerative response in aged mice.</a> Stem cells. 27, 2044-2052 (2009).</li>
<li>Bouab, M., Paliouras, G. N., Aumont, A., Forest Berard, K., Fernandes, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+of+the+subventricular+zone+neural+stem+cell+niche+evidence+for+quiescence+associated+changes+between+early+and+mid+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Aging of the subventricular zone neural stem cell niche evidence for quiescence associated changes between early and mid adulthood.</a> Neuroscience. 173, 135-149 (2011).</li>
<li>Enwere, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+results+in+reduced+epidermal+growth+factor+receptor+signaling+diminished+olfactory+neurogenesis+and+deficits+in+fine+olfactory+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Aging results in reduced epidermal growth factor receptor signaling diminished olfactory neurogenesis and deficits in fine olfactory discrimination.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 8354-8365 (2004).</li>
<li>Maslov, A. Y., Barone, T. A., Plunkett, R. J., Pruitt, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+detection+characterization+and+age+related+changes+in+the+subventricular+zone+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell detection characterization and age related changes in the subventricular zone of mice.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 1726-1733 (2004).</li>
<li>Tropepe, V., Craig, C. G., Morshead, C. M., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor+alpha+null+and+senescent+mice+show+decreased+neural+progenitor+cell+proliferation+in+the+forebrain+subependyma%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor alpha null and senescent mice show decreased neural progenitor cell proliferation in the forebrain subependyma.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 17, 7850-7859 (1997).</li>
<li>Costa, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+live+imaging+of+adult+neural+stem+cell+division+and+lineage+progression+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Continuous live imaging of adult neural stem cell division and lineage progression in vitro.</a> Development. 138, 1057-1068 (2011).</li>
<li>Ponti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+and+lineage+progression+of+neural+progenitors+in+the+ventricular-subventricular+zones+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cell cycle and lineage progression of neural progenitors in the ventricular-subventricular zones of adult mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1045-1054 (2013).</li>
<li>Sakaue Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell+cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell cycle progression.</a> Cell. 132, 487-498 (2008).</li>
<li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+expansion+of+the+adult+mouse+neural+stem+cells+using+the+neurosphere+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay.</a> Journal of visualized experiments JoVE. , (2010).</li>
<li>Daynac, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta+lengthens+the+G1+phase+of+stem+cells+in+aged+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">TGFbeta lengthens the G1 phase of stem cells in aged mouse brain.</a> Stem cells. 32, 3257-3265 (2014).</li>
<li>Roccio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+stem+cell+fate+changes+by+differential+cell+cycle+progression+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Predicting stem cell fate changes by differential cell cycle progression patterns.</a> Development. 140, 459-470 (2013).</li>
<li>Walker, T. L., Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+mouse+two+cultures+isolation+and+culture+of+adult+neural+stem+cells+from+the+two+neurogenic+zones+of+individual+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">One mouse two cultures isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice.</a> Journal of visualized experiments JoVE. , e51225(2014).</li>
<li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+and+neurospheres+re+evaluating+the+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells and neurospheres re evaluating the relationship.</a> Nat Methods. 2, 333-336 (2005).</li>
<li>Pastrana, E., Silva Vargas, V., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyes+wide+open+a+critical+review+of+sphere+formation+as+an+assay+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Eyes wide open a critical review of sphere formation as an assay for stem cells.</a> Cell stem cell. 8, 486-498 (2011).</li>
<li>Spella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Licensing+regulators+Geminin+and+Cdt1+identify+progenitor+cells+of+the+mouse+CNS+in+a+specific+phase+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Licensing regulators Geminin and Cdt1 identify progenitor cells of the mouse CNS in a specific phase of the cell cycle.</a> Neuroscience. 147, 373-387 (2007).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

本文所述的细胞分选技术可可靠地区分静息态神经干细胞、激活态神经干细胞及其子代细胞，从而能够研究它们在成年大脑中的特性与动态变化9。结合FUCCI技术（可实现活细胞中细胞周期进程的可视化）23，我们开发了一种快速且高效的方法，用于追踪年轻成年和老年小鼠脑细胞中细胞周期的G1期以及S-G2/M期。
本方案中使用的细胞分选技术是首个经过验证的标志物组合，可实现从侧脑室下区（SVZ）中纯化出五种主要的神经发生细胞群体9它也是首个经过验证的、能够区分静息态与激活态神经干细胞（NSCs）的技术。值得注意的是，该技术无需使用转基因小鼠。 本身，这在应用于FUCCI等转基因小鼠模型时是必要的。此后，Codega 等10 已采用GFAP-GFP/CD133/EGFR三重标记组合来区分静息态神经干细胞与其活化状态的对应细胞，但该方法无法适配于FUCCI技术，因其需使用GFAP-GFP转基因小鼠。Mich 等11 已开发出一种Glast/EGFR/CD24三重标记策略，其结果与本研究中所用技术具有一致性9事实上，已在Daynac中观察到LeX与Glast神经干细胞标志物之间存在高度相关性 等 研究9然而，Mich 所使用的 Glast 抗体 等 该技术与藻红蛋白偶联，因此无法与FUCCI-Red小鼠联合使用。
在分选SVZ细胞之前，有几个重要的技术要点需要注意。首先，解离步骤非常关键，因为需要将脑组织解离为单个细胞，同时保持用于抗体标记策略的蛋白质结构完整性。已有研究表明，0.05%胰蛋白酶-EDTA在解离SVZ组织方面效果显著27，但LeX抗原对此处理极为敏感，几乎完全丧失了LeX-FITC免疫荧光信号（数据未显示）。因此，我们选用木瓜蛋白酶（papain），因其在脑组织解离中比其他蛋白酶更高效且破坏性更小。此外，木瓜蛋白酶处理对LeX、EGFR和CD24均无影响。需要注意的是，若木瓜蛋白酶处理时间超过15分钟，抗体标记效果会受到影响。我们发现，采用10分钟木瓜蛋白酶处理结合机械解离（用移液器吹打20次）可获得最佳结果。
聚-D-赖氨酸包被可支持贴壁细胞的培养，并在培养数天后形成克隆。目前普遍认为，体外实验存在其固有局限性28,29。我们建议仅分析那些至少经历一次后续分裂的细胞的首个细胞周期，以尽可能接近体内细胞表型。
值得注意的是，用于设计FUCCI系统的Geminin（绿色荧光）和Cdt1（红色荧光）蛋白23 此前已发现，在小鼠早期神经发生过程中，神经前体细胞大量表达这些基因30 以及在成年脑组织中9,25尽管本研究主要使用mKO2-hCdt1(30/120)构建体通过红色荧光追踪G1期，但也可设想同时使用两种构建体[mKO2-hCdt1(30/120)和mAG-hGem(1/110)]，以实现细胞周期主要时相（G1 和 S-G2/M）以及 G1S 期转换23双色成像的主要局限在于可用于细胞标记的荧光组合较为有限。一种解决方案是使用分离柱。例如，在细胞分选及活体成像前，我们已成功利用分离柱去除表达CD24的细胞组分，原因是所用的CD24-PE抗体与FUCCI-Red荧光的发射波长相同。25.
很少有研究探讨成年小鼠侧脑室下区（SVZ）细胞群体的细胞周期长度。我们技术所获得的总细胞周期长度接近先前估算的结果 体外 由 Costa 等21，但我们首次能够区分不同的细胞周期阶段。在一项 体内 研究，Ponti 等22 利用胸苷类似物的掺入来确定不同SVZ细胞群体的增殖动态。然而，他们既无法连续监测细胞周期，也无法在单细胞水平上追踪细胞。这可能成为一个问题，因为已有研究表明，在特定的SVZ细胞群体内部存在显著的异质性。22,25我们在此描述一种替代方法 体外 技术简单易行，可在单细胞水平上对不同成年神经发生群体的细胞周期各时相进行活体成像。
理解神经干细胞及其前体细胞周期的调控机制，对于开发针对衰老或脑部疾病的新治疗策略仍是一项挑战。因此，本方案具有广泛的应用前景。在衰老研究背景下，该技术还可用于阐明衰老对神经干细胞（NSCs）分化的影响。事实上，可以通过其明显更高的红色荧光强度来识别进入分化阶段的神经干细胞/前体细胞26。最后，利用单细胞水平的连续活体成像，也有望深入研究成年神经干细胞谱系进展过程中内在和外在的细胞调控机制。

静息态神经干细胞（NSCs）是成体神经发生1的来源，可转化为表达表皮生长因子受体（EGFR）的增殖性“激活”状态（aNSCs）2。一旦被激活，它们会生成过渡性扩增细胞（TACs）3，随后形成神经前体细胞，这些细胞通过星形胶质细胞构成的管道迁移至嗅球（OB），最终分化为神经元4,5。NSCs及其子代细胞沿侧脑室分布，形成特殊的“微环境”结构，涉及多种调控其增殖的因子6。为了阐明这些细胞增殖过程中复杂的分子调控机制，有必要对脑室下区（SVZ）神经发生相关细胞进行分离与纯化；然而，由于缺乏特异性标记物及适配的技术，这一工作长期以来一直面临挑战。
利用流式细胞术的新方法使得从成年小鼠侧脑室下区（SVZ）分离神经干细胞（NSCs）及其子代细胞成为可能2,7-11。我们近期结合干细胞标志物LeX12、神经前体细胞标志物CD2413以及荧光标记的表皮生长因子（EGF）以标记增殖细胞上的EGFR2，建立了一种荧光激活细胞分选（FACS）策略，能够纯化出SVZ区五种主要的神经发生细胞群体：静息态和激活态的NSCs、瞬时扩增细胞（TACs）、未成熟神经前体细胞以及迁移中的神经前体细胞9。本文中，我们将详细描述这一细胞分选技术，并说明LeX/EGFR/CD24三重染色如何首次实现了对静息态和激活态NSCs的同时分离。
尽管成年期神经发生持续存在，但在衰老的大脑中，新神经元的生成显著减少14大多数研究均认为，SGZ和SVZ中增殖的前体细胞数量呈进行性减少15-20其后果并非无害，因为随着年龄增长，侧脑室下区的神经发生能力下降，导致老年大脑嗅球中新生成的神经元减少，最终引起老年小鼠嗅觉分辨能力的受损。18阐明神经前体细胞的细胞周期动力学是理解成体神经发生随衰老演变机制的关键步骤。近期研究已探讨了成体神经干细胞的细胞周期及谱系进展 体外21 和 体内22 但这些方法均未利用细胞分选技术及基因编码的荧光细胞周期探针，在单细胞水平上对分离细胞的细胞周期时相进行可视化观察。
本文介绍了一种利用转基因FUCCI小鼠的实验方案，该小鼠的细胞在细胞周期中具有荧光特性，可区分G1期与S-G2/M期23。该方案展示了如何通过从成年FUCCI小鼠中前瞻性分离神经干细胞（NSCs）及其子代细胞，并结合延时视频显微镜技术，实现对单个细胞水平上细胞周期动态的研究。

<table><tbody><tr><td>96孔无涂层玻璃底培养板&amp;nbsp;</td><td>MatTek Corp.</td><td>P96G-1.5-5-F</td><td></td></tr><tr><td>&amp;micro;-Plates 96孔板</td><td>Ibidi</td><td>89626</td><td></td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸</td><td>Millipore</td><td>A003E</td><td></td></tr><tr><td>NeuroCult NSC 基础培养基</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5700</td><td></td></tr><tr><td>NeuroCult NSC 增殖补充剂&amp;nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5701</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7980</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Millipore</td><td>GF144</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>Millipore</td><td>GF003</td><td></td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶</td><td>Worthington</td><td>LS003119</td><td></td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Invitrogen</td><td>24010-043</td><td></td></tr><tr><td>L-半胱氨酸</td><td>Sigma</td><td>C-7352</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA，pH 8.0</td><td>Promega</td><td>V4231</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>D5025-15KU</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶抑制剂 II 型</td><td>Sigma</td><td>T9128</td><td>卵黏蛋白</td></tr><tr><td>DMEM:F12 培养基</td><td>Life Technologies</td><td>31330-038</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;micro;m 滤膜&amp;nbsp;</td><td>BD Medimachine Filcon</td><td>340622</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 微量离心管 3810X</td><td>Sigma</td><td>Z606340-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A1595</td><td>牛血清白蛋白溶液</td></tr><tr><td>CD24 藻红蛋白-氰基7偶联物 [PC7]</td><td>Life Technologies</td><td>A14776</td><td>小鼠 IgM；克隆 MMA。1:50</td></tr><tr><td>CD15/LeX 异硫氰酸荧光素 [FITC] 偶联抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>332778</td><td>大鼠 IgG2b；克隆 M1/69。&amp;nbsp; 1:50</td></tr><tr><td>小鼠抗人 LeX 抗体</td><td>BD Pharmingen</td><td>559045</td><td>小鼠 IgM；克隆 MAM。&amp;nbsp; 1:50</td></tr><tr><td>Alexa647 偶联 EGF 配体</td><td>Life Technologies</td><td>E35351</td><td>1:200；文中称为 Ax647 偶联 EGF 配体</td></tr><tr><td>CompBeads</td><td>BD Biosciences</td><td>644204</td><td></td></tr><tr><td>MACS LS 分离柱&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>分离柱（文稿中）</td></tr><tr><td>抗小鼠 IgM 磁珠&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-047-301</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma</td><td>861405</td><td>HO（文稿中）</td></tr><tr><td>INFLUX 细胞分选仪</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>FACS 分选仪（文中）</td></tr><tr><td>连接倒置 ECLIPSE Ti 的尼康 A1R 共聚焦激光扫描显微镜系统</td><td>尼康公司</td><td></td><td>共聚焦激光扫描显微镜（文稿中）</td></tr><tr><td>NIS-Elements AR.4.13.01 64位软件</td><td>尼康公司</td><td></td><td>NIS-Elements 软件（文稿中）</td></tr><tr><td>Plan Apo VC 20倍 DIC 物镜（NA：0.75）</td><td>尼康公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ECLIPSE Ti 恒温培养箱</td><td>尼康公司</td><td></td><td>恒温培养箱（文稿中）</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>RBS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>Tree Star, Ashland, OR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FUCCI 小鼠</td><td>RIKEN 生物资源中心，日本</td><td></td><td>Sakaue-Sawano 等，2008</td></tr></tbody></table>

成年小鼠侧脑室下区神经干细胞与前体细胞的分选及细胞周期动态的活体成像

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

侧脑室脑室下区（SVZ）中的神经干细胞（NSCs）在哺乳动物大脑中终生维持嗅觉神经发生。这些干细胞依次产生过渡性扩增细胞（TACs）和神经前体细胞，后者在整合至嗅球后分化为神经元。新兴的荧光激活细胞分选（FACS）技术使得分离神经干细胞及其子代细胞成为可能，并开始揭示成年神经发生微环境中基因调控网络的特征。本文报道了一种细胞分选技术，可通过LeX/EGFR/CD24三重染色方法，对成年SVZ中上述细胞群体的细胞周期动态进行追踪和区分。分离后的细胞以贴壁形式培养，以便通过延时视频显微镜详细研究其细胞周期进程。为此，我们使用了转基因荧光泛素化细胞周期指示剂（FUCCI）小鼠，其中处于G1期的细胞因表达G1期特异性的红色Cdt1报告蛋白而呈现红色荧光。该方法最近发现，增殖中的神经干细胞在衰老过程中其G1期逐渐延长，导致神经发生功能受损。该技术易于推广至其他系统，在研究脑部病理状态下脑细胞的细胞周期动态方面具有重要应用价值。

可靠地区分成年小鼠SVZ干细胞谱系中不同细胞群体的能力，对于研究其功能特性至关重要。为此，我们开发了一种LeX/EGFR/CD24三重标记策略，可用于从成年小鼠SVZ中分离特定的细胞群体：静息态NSCs（LeXbright）、激活态NSCs（LeX+EGFR+）、瞬时扩增细胞（TACs，EGFR+）以及未成熟和迁移的成神经细胞（分别为CD24+EGFR+和CD24+）9（图1）。将该技术应用于FUCCI转基因小鼠，可通过细胞分选实现对不同成神经细胞群体在单细胞水平上细胞周期各时相的活体成像25。使用FUCCI-Red小鼠，可通过延时视频显微镜利用红色荧光追踪G1期（图2A）。FUCCI-Redneg细胞代表处于S-G2/M期的细胞，FUCCI-Redpos细胞为G1期细胞，而FUCCI-Redbright细胞则为退出或处于细胞周期之外的细胞（图2B）23,26。将来自年轻成年鼠（图2C）和中年鼠（图2D）的LeX+EGFR+和EGFR+细胞接种于多聚-D-赖氨酸包被的培养板上，作为贴壁细胞进行培养。通过单个细胞红色荧光消失至细胞分裂的过程，确定其首次进入S-G2/M期。如先前观察结果所示，无论在年轻还是中年小鼠中，LeX+EGFR+细胞与EGFR+细胞之间的S-G2/M期持续时间均无差异。随后，我们计算了从第一次分裂开始至红色荧光消失之间的下一个G1期持续时间。有趣的是，在衰老过程中，LeX+EGFR+细胞的G1期显著延长，而EGFR+细胞则未见此现象25（图2C,D）。因此，如图2E所示，来自老年小鼠的LeX+EGFR+细胞在接种5天后形成的神经球更小。
FUCCI-绿色小鼠也可用于通过绿色荧光可视化S-G2/M期（图3A,B），但由于LeX-FITC抗体的发射波长与FUCCI-绿色荧光相同，因此需要预先使用分离柱对细胞进行分选（图3C）。图3D展示了年轻成年LeX+EGFR+细胞和EGFR+细胞在第一个S-G2/M期的FUCCI-绿色荧光示例。
<img alt="流式细胞术数据分析；CD24/EGFR设门策略。图示形态学特征、死细胞、双联体排除。" src="/files/ftp_upload/53247/53247fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1：通过FACS进行细胞筛选的策略。 (A) 首先根据侧向散射（SSC）与前向散射（FSC）参数，基于细胞形态学特征进行初步筛选。有关形态学设门选择的更多细节，请参见Daynac et al. 9 (A’) 使用HO标记物对死细胞进行标记，并在筛选中予以排除。 (A’’) 利用脉冲宽度参数排除双联体。为设定分选门，使用了CD24-PC7（LeX-FITC/FUCCI-Red/EGF-Ax647标记；B）和LeX-FITC（FUCCI-Red/EGF-Ax647/CD24-PC7标记；B’）的单染减一（FMO）对照。 (C,C’) 随后，在LeX-FITC/FUCCI-Red/EGF-Ax647/CD24-PC7标记的样本管中结合FMO对照确定分选门。门内显示了占总细胞的平均百分比。若筛选CD24+细胞（神经母细胞），需注意在设门时排除表达CD24bright的细胞，因为CD24bright对应于室管膜细胞2,9。 C’ 表示CD24阴性细胞（C中的黑色方框）。本研究仅使用LeX+EGFR+和EGFR+(C’)的分选门。
<img alt="使用FUCCI红色系统进行细胞周期分析；示意图、流式细胞术、延时图像。" src="/files/ftp_upload/53247/53247fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2：利用FUCCI-Red小鼠对细胞周期进行活体分析。(A) FUCCI-Red细胞周期的示意图，其中细胞在G1期呈红色荧光，在S-G2/M期无荧光23。(B) SVZ细胞上FUCCI-Red荧光的FACS图示。(C,D) 对来自年轻(C)和中年(D) FUCCI-Red小鼠的LeX+EGFR+和EGFR+细胞进行视频显微观察，可通过红色荧光追踪G1期，而当红色荧光消失时可推断进入S-G2/M期。连续图像的时间尺度见D。(E) 接种5天后获得的克隆（神经球）代表性图像。比例尺：10 µm (C, D)，30 µm (E)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53247/53247fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的高清版本。</a>
<img alt="使用FUCCI系统进行细胞周期分析、流式细胞术结果及MACS分选柱示意图。" src="/files/ftp_upload/53247/53247fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3：利用FUCCI-Green小鼠进行活细胞周期分析的策略。 (A) FUCCI-Green细胞周期的示意图，其中细胞在S-G2/M期呈绿色，在G1期无色23。 (B) FUCCI-Green荧光的FACS图示：FUCCI-Greenneg细胞代表处于细胞周期G1期的细胞，而FUCCI-Greenpos细胞则处于S-G2/M期23。 (C) 为了追踪LeX+EGFR+和EGFR+细胞中绿色荧光标记的S-G2/M期，需先使用分离柱对SVZ细胞进行预分选。细胞用抗小鼠LeX抗体标记后，利用抗小鼠磁珠将LeX+组分保留在柱上（见方案4）。随后洗脱LeX+和LeX-组分，并用EGF-Ax647和CD24-PC7抗体标记，用于FACS分选。 (D) 从年轻FUCCI-Green小鼠中分选出的LeX+EGFR+和EGFR+细胞的活细胞显微录像，可利用绿色荧光追踪S-G2/M期的动态过程。连续图像的时间尺度在D中显示。比例尺：10 µm (D)。

我们报告了一种基于荧光激活细胞分选（FACS）的方法，用于从成年小鼠脑的脑室下区（SVZ）分离神经干细胞（NSCs）及其子代细胞。该方法应用于荧光泛素化细胞周期指示剂（FUCCI）转基因小鼠时，可实现通过活细胞成像来研究细胞周期进程。

侧脑室室下区（SVZ）的神经干细胞（NSCs）在哺乳动物大脑中终生维持嗅觉神经发生。

本实验的总体目标是追踪从转基因荧光泛素化细胞周期小鼠（简称FCI小鼠）的脑室下区分离并分选得到的神经干细胞及其子代细胞的细胞周期进程。该目标首先通过解剖转基因成年小鼠脑的脑室下区来实现；第二步是采用木瓜蛋白酶处理将神经组织解离为单细胞悬液。接下来，使用抗体标记脑室下区不同的神经发生细胞群体，以鉴定静息态神经干细胞、激活态神经干细胞、过渡性扩增细胞以及未成熟且正在迁移的成神经细胞。最后一步是利用流式细胞分选技术将细胞直接分选至新鲜培养基中，随后将其接种于聚-D-赖氨酸包被的培养板上。最终，通过连续的活细胞延时视频显微镜观察，研究接种后细胞的细胞周期进程，其中各类转基因细胞在细胞周期的不同时间点会发出荧光。将细胞分选技术与富士技术相结合，可实现对脑室下区不同细胞群体的可视化及分离，从而有助于研究成年大脑运动过程中细胞的特性与动态变化。该方法有助于解答与衰老及脑部病理相关的关键科学问题。实验前一天，向无菌黑色壁96孔板的每孔中加入约200微升浓度为10微克/毫升的多聚D-赖氨酸溶液，以包被孔底；盖好后于37摄氏度孵育过夜。移除聚-D-赖氨酸溶液，用无菌蒸馏水清洗孔板三次，然后在层流罩中干燥至少两小时。若不立即使用，可将干燥后的包被板在4°C保存最多七天。接下来，制备木瓜蛋白酶解离溶液，并通过0.2微米滤器过滤以实现灭菌。使用前将溶液预热至37摄氏度。同时，通过向TM F12培养基（无菌）中加入0.7毫克/毫升的胰蛋白酶抑制剂II型，制备蛋白酶抑制剂溶液。使用0.2微米滤器过滤溶液，并在使用前将溶液预热至37摄氏度。将成年fucci红色小鼠脑中新鲜解剖的室下区组织放入含有0.6%葡萄糖的PBS的培养皿中，将组织切碎至无大块残留。然后将所有组织转移至15毫升离心管中，在200 × g下离心5分钟。组织沉淀后，弃去上清液并重悬。将组织悬浮于1毫升预热的木瓜蛋白酶溶液中，该溶液添加有0.01毫克/毫升的DNA酶I。将混合物在37摄氏度水浴中孵育10分钟。然后在200 × g下再次离心5分钟，并弃去上清液。加入1毫升预热的OVO MOID溶液以终止酶消化反应。接下来，使用P1000微量移液器吸头轻轻吹打20次，通过机械方式将剪碎的组织解离成单细胞悬液，同时进行移液操作。避免将气泡引入混合物中，以免对细胞造成额外应力。将细胞悬液通过一个无菌的20微米滤器，收集到新的15毫升离心管中。用2毫升含0.15% BSA的PBS洗涤细胞滤器，以避免细胞损失。然后以200 × g离心细胞悬液10分钟。弃去上清液。进行表面染色时，先将每只小鼠的细胞重悬于100 µL含有0.15% BSA的PBS中。使用一只小鼠细胞的十分之一，按照随附的文字方案制备四个对照样品。将此处列出的初级抗体分别加入用于细胞分选的各管中，在4°C避光孵育20分钟。初级抗体孵育结束后，用1毫升含0.15% BSA的PBS洗涤细胞，然后在200 × g离心10分钟。将细胞重悬于每只小鼠脑组织200微升含0.15% BSA的PBS中，并转移至相应的分选管中。将细胞分选管置于冰上，并在细胞分选前立即向细胞中加入终浓度为2微克/毫升的Hoechst 33258等活体染料，以区分活细胞与死细胞。接下来，对阴性对照管中的细胞进行流式分析，使用侧向散射和前向散射参数圈选细胞。通过圈选阴性组分中的单细胞群体排除死细胞，同时通过选择阴性组分中的脉冲信号排除双联体。运行单色对照，并在必要时调整光电倍增管电压。在软件的补偿窗口中进行颜色补偿。运行三项减去一项荧光对照，绘制分选门。所有门设置完毕后，直接将标记的细胞分选至100微升培养液中。将 freshly sorted 的细胞以每孔 1000 至 3000 个细胞的密度接种到含 300 微升培养基的多聚赖氨酸包被的 96 孔板中。将培养板置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳环境中孵育至少 1 小时。为了促进细胞贴壁，将共聚焦激光扫描显微镜的附带温控腔室在5%二氧化碳气氛下预热至37摄氏度，以准备成像。将96孔板放入预热的显微镜腔室内，并将第一孔调至焦点。然后打开成像软件，在主窗口中右键单击，选择“采集控制”和“DEAC采集”。为了打开 TI 载物台并选择 Plan A PO VC 20 XDIC 物镜，请依次点击“采集”控制按钮，然后打开延时成像选项。将每个孔的中心设置为载物台位置，并选择“大图像”选项，设定为 7×7 毫米平方。观察每个孔中心周围的拼接图像。设置大拼接图像的重叠率为5%，并设置频率，使每20分钟拍摄一次图像，持续24小时。在“一加”设置下，从菜单栏中选择每种荧光对应的光电倍增管电压水平。选择使用高速共振扫描仪以512×512像素的格式采集图像，并使用微分干涉差（DIC）显微技术观察细胞。然后选择一个文件夹以保存数据文件。在ND采集窗口中点击“立即运行”按钮以开始采集。在至少一个循环期间跟随计算机操作，确保所有设备正常工作。使用Fuji红小鼠，通过延时视频显微镜利用红色荧光追踪G1期。分离的细胞在第一个生长期呈红色荧光，而在合成期、第二个生长期及有丝分裂期间则失去荧光。Lex阳性eeg FR阳性及eeg。通过显微镜对年轻成年和中年小鼠的FR阳性细胞进行铺板并追踪观察。在年轻或中年小鼠中，Lex阳性EGFR阳性细胞与EGFR阳性细胞之间的S期和G2/M期时长均无差异。然而，由于G1期时长增加，导致在较年老的细胞中，从第一次分裂开始至红色荧光关闭的下一个生长期持续时间更长。从较年老小鼠中获得的Lex阳性EGFR阳性细胞在接种后第五天形成的神经球较小。在处理12只小鼠时，整个操作流程的解剖和组织固定准备时间不应超过三小时，细胞分选时间另需三小时。请注意，同一天处理过多小鼠将导致细胞分选时间延长，可能引起细胞死亡或细胞分化增加。

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了解利用荧光激活细胞分选技术从成年小鼠脑室下区分离神经干细胞及其子代的方法，结合FUCCI实时成像技术追踪细胞周期动态变化，为研究神经发生及脑衰老机制提供重要工具。

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