蛋白质 - 配体相互作用采用差示扫描荧​​光法测定

差示扫描荧光测定法是一种广泛使用的方法，用于筛选小分子文库与蛋白质的相互作用。在这里，我们提出了一种简单的方法来扩展这些分析，以提供小分子与其蛋白质伴侣之间的解离常数的估计。

该程序的总体目标是估计蛋白质配体相互作用的解离常数。这是通过首先制备具有不同浓度配体的蛋白质混合物以及指示剂染料来实现的。第二步是加热这些样品，同时记录指示剂的荧光，以监测蛋白质的去折叠。

接下来，蛋白质去折叠曲线被转换为一系列熔解温度。最后一步是将这些数据拟合到适当的模型中，以估计解离常数。最终，差示扫描荧光法用于更好地了解蛋白质与其配体的相互作用。

与等温、滴定、量热和表面等离子体共振等现有方法相比，该技术的主要优点是，该方法可以在大多数研究所已有的仪器中仅使用适量样品在几个小时内完成。这种方法可以帮助回答蛋白质化学领域的关键问题，例如配体对蛋白质的亲和力和相互作用的相对强度。一般来说，刚接触这种方法的人会很困难，因为选择要使用的样本和数据分析都可能很困难。

在开始此过程之前，请准备以下解决方案。包含本表中详述的试剂和最高可用浓度的目标配体储备液，以及该浓度的 6 个 10 倍稀释液的混合物。如果从先前的数据中已知近似解离常数，则至少准备高于和低于 kd 的两个浓度。

此处显示了一个示例表。将 18 μL 混合物分装到 8 个孔中。在 A-Q-P-C-R 板中，向其余 7 个孔中的第一个孔中加入 2 微升溶剂，加入配体稀释系列的每个成员 2 微升。

将 A-Q-P-C-R 密封放在板上，以实现板的良好密封。将手动涂抹器放在板的中间，将密封剂抹平到一侧，然后在板的另一半上重复。将板以 500 倍 G 离心 2 分钟以去除气泡。

接下来，将板放入第一步 QPCR 仪器中。选择岩石过滤的熔融曲线选项，然后选择快速的斜坡速度。在仪器运行结束时运行热变性。

单击屏幕上的分析按钮。保存结果文件。打开 protein thermal shift 软件。

在 properties 选项卡中创建新研究。为其命名，然后在 conditions 选项卡中详细说明配体。移动到 experiment files 选项卡并导入保存的结果文件。

设置每个 Cookie 的内容。好吧，移动到 分析 选项卡并按下 分析 按钮来分析结果。检查蛋白质在单独存在溶剂的情况下是否产生与下图所示相似的结果。

接下来，检查在复制疼痛的结果中观察到的熔化温度。确保这显示随着配体浓度的增加，熔解温度明显升高。这些数据将用于提供随附论文中描述的解离常数的近似值。

这些溶液是确定解离常数的程序所必需的，下表中详述的 A 预混液和 15 种不同浓度的配体储备液，将被稀释 10 倍。在最后的实验中。理想情况下，包括配体浓度，至少比估计的 kd 高和低两个数量级，并将浓度集中在估计的 kd 上。

此处显示了一个示例稀释系列。专注于估计 KD 数量级内的 7 个点，另外 4 个点位于其两侧。如果可以选择，请在饱和值处包含更多点。

将 120 μL 预混液添加到 U 形底 96 孔板的 8 个孔中，以用作储液器，以便于分配预混液。然后使用八通道移液器将 18 μL 预混液分配到 PCR 板的一列中。重复另外 5 列，在板上以 6 x 8 的模式提供总共 48 个填充孔。

接下来，向 8 个孔中的每个孔中加入 20 微升配体茎或溶剂。在另一个 U 形底的 96 孔板中，使用八通道移液器吸出 2 微升 8 种不同的配体原液或溶剂，并将它们添加到填充有预混液的 PCR 板的一列中。使用相同的 8 种配体或溶剂储备液重复上述步骤。

对于另外两根色谱柱，吸出剩余 8 种配体或溶剂储备液的 2 μL，并将其添加到板的第四根色谱柱中。对另外两列重复此作。这将为所有 16 个配体和溶剂样品提供一式三份样品。

将 A-Q-P-C-R 密封放在板上。将板以 500 倍 G 离心 2 分钟。将板放入 QPCR 仪器中，并使用之前在仪器运行结束时指定的参数进行热变性。

单击屏幕上的分析按钮。保存结果文件。打开 protein thermal shift 软件。

在 properties 选项卡创建一个新研究。为其命名，然后在 conditions 选项卡中详细说明配体。移动到 experiment files 选项卡，导入保存的结果文件并设置每个结果文件的内容。

好吧，移动到 analysis 选项卡并按下 analyze 按钮。从屏幕左侧的菜单中选择 replicates （重复） 选项卡以显示结果。一式三份。

根据一式三份的紧密程度评估数据的可靠性。如果一式三份显示可重复性差。仔细检查原始数据。

使用 boltman 或导数方法分析数据。要评估熔解温度，请选择"重复结果"选项卡，然后在"重复结果"图中，在 tm、boltzmann 和 TM derivative 之间切换绘图依据按钮。选择对样品具有更高重现性的方法。

对于显示多个跃迁的样品，在多次熔解模式下使用导数方法几乎总是最好的。使用 export （导出） 选项卡导出结果，以便使用 Excel 进行进一步调查。通过在 Excel 中创建一个配体浓度和熔解温度的表格来开始此分析。

打开 GraphPad prism 软件并创建一个 XY 表。使用 X 列输入数据以获得配体浓度，使用 Y 列输入熔解温度结果。在 analysis （分析） 选项卡中，选择 nonlinear regression curve fit （非线性回归曲线拟合） 选项。

要输入正确的模型，请选择 new 并创建新方程。插入适当的方程式作为单位点配体结合。选中 rules for initial values 框，然后输入初始值的规则。

将参数 P 约束为等于 Constant 以输入蛋白质的最终浓度。选择 analyze 以执行分析，选择 additional analysis 以将数据拟合到协作模型或将数据拟合到曲线。显示熔解温度的二进制偏移在随附的协议文本中进行了描述。

该方法用于测量己糖激酶与葡萄糖的相互作用。初步筛查提示 KD 可能在 0.2 至 1.7 毫摩尔之间。较大屏幕的结果显示，对于 KD 为 1.2 正负 0.1 毫摩尔的单个结合事件，与模型拟合良好，推定的 HETO SQUA L 转移酶 WCBM 在与 GTP 结合时显示出强烈的热转移。

初步筛查显示 KD 为 200 至 500 微摩尔。一项详细的实验表明，表观 KD 为 120 正负 20 微摩尔。然而，当 X 轴使用对数刻度时，模型与相同数据的数据分析之间存在显着差异，合作模型显示与数据拟合良好，这意味着 WCBM 在与 GTPA 的结合方面是反合作的，而不是在推定的 GDP 60 中观察到不寻常的结果， oxy Beta D mano， Heur two oh， ACE WCBI.

在没有配体的情况下，在高配体浓度下，可以观察到简单的单相熔融模式。然而，在中等配体浓度下，观察到两个不同的熔解峰。两组峰之间的转变在双相熔融的整个浓度建模范围内是剂量依赖性的。

作为配体比例的总和，游离和高配体结果对数据具有良好的拟合。通过将高配基浓度观察到的结果外推到完全占据，可以改善这种拟合。获得的 WCBI 与配体结合的比例数据显示与简单结合模型极好拟合。

KD 为 58 加或负 2 微摩尔 一旦掌握，这项技术可以在四到五个小时内完成，如果执行得当，包括重复 遵循此程序。可以执行其他方法，如 tiptop 静脉荧光和等温滴定量热法，以回答其他问题，如温度依赖性和 STA 几何形状。观看此视频后，您应该对如何使用差示扫描流感确定交互作用的解离常数的估计值有一个很好的了解。