利用配体差异径向毛细管作用分析法（DRaCALA）鉴定小分子配体的结合蛋白

小分子信号分子可靶向多种效应蛋白，以调控细菌毒力和人类生物学过程。然而，这些效应蛋白的鉴定具有挑战性。作为一种系统生物学工具，DRaCALA 利用 OVium 文库，能够以可行、快速且高度灵敏的方式鉴定未知的效应蛋白。

只要能够用放射性同位素或荧光染料进行标记，DRaCALA 可用于研究任何小分子信号分子。首先将大肠杆菌接种至 96 孔深孔板的每个孔中，每孔含 1.5 毫升 LB 培养基，并添加 25 微克/毫升氯霉素，在 30 摄氏度、160 转/分钟条件下过夜培养。次日早晨，用 500 微摩尔 IPTG 在 30 摄氏度处理过夜培养物 6 小时，以诱导蛋白表达。

孵育结束后，通过离心收集细胞沉淀，弃去上清液，并将样品在零下80摄氏度冷冻。为启动裂解，将沉淀重悬于150 µL裂解缓冲液中，每孔加入150 µL，在零下80摄氏度孵育30分钟，随后在37摄氏度解冻细胞20分钟。裂解液在使用前应保存在零下80摄氏度。

为了充分裂解过表达蛋白的细胞，将样品重悬于40毫升预冷的裂解缓冲液二中，并在60%的超声功率下，以开启2秒、关闭4秒的循环模式超声处理8分钟，随后通过离心澄清裂解液。在样品离心的同时，向直立的聚丙烯层析柱中加入500微升均质化的镍-NTA树脂。离心15分钟后，用15毫升超纯水洗涤沉淀的树脂两次，再用15毫升裂解缓冲液二洗涤一次。

离心结束后，将澄清的裂解液上清加到层析柱上。当所有裂解液流经层析柱后，用30毫升洗涤缓冲液洗涤层析柱。为洗脱蛋白质，向层析柱中加入400 µL洗脱缓冲液，并重复洗脱三次。

再加入 300 微升洗脱缓冲液，重复洗脱三次，并将洗脱出的蛋白质合并至终体积为 700 微升。对洗脱样品进行凝胶过滤时，先用 25 毫升新配制的凝胶过滤缓冲液洗涤尺寸排阻柱，然后使用 500 微升定量环将全部洗脱蛋白样品上样至层析柱。以 500 微升/分钟的流速运行，并分别收集 2 至 3 个 500 微升体积的组分，对应各目标蛋白质。

然后使用单独的离心柱浓缩每种蛋白质，并根据标准操作流程使用Bradford法蛋白浓度检测试剂盒测定蛋白浓度。为合成磷-32标记的鸟苷五磷酸，按照表格中所述在带螺旋盖的离心管中配制小规模Relseq反应体系，在37°C的ThermoMixer中孵育1小时，随后在95°C孵育5分钟，再置于冰上5分钟。孵育结束后，通过离心沉淀蛋白质，将含有合成的磷-32标记鸟苷五磷酸的上清液转移至新的带螺旋盖离心管中。

在进行磷-32标记的鸟苷四磷酸合成时，取一微摩尔的GppA加入到新的带螺帽试管中，与一半的磷-32标记鸟苷五磷酸产物混合，于37摄氏度孵育10分钟，95摄氏度孵育5分钟，再在冰上孵育5分钟。孵育结束后，通过离心沉淀反应物，并将含有磷-32标记鸟苷四磷酸的上清液转移至新试管中。为分析分离的目标蛋白，使用1.5摩尔的磷酸二氢钾作为流动相，在薄层色谱板上点样一微升各样品进行分析。

分析结束后，将干燥的平板放入透明塑料文件夹中，并将其暴露于存储磷屏上5分钟，然后在磷屏成像仪上进行数据可视化和定量。对于目标蛋白的DRaCALA筛选，将20 µL解冻后的大量裂解液分别加入96孔V型底微孔板的各个孔中，并向每孔加入2.5单位的粘质沙雷氏菌核酸内切酶。在37°C孵育15分钟后，将裂解液置于冰上20分钟。

接下来，取等体积的磷-32标记的鸟苷五磷酸和鸟苷四磷酸混合，并向该混合物中加入1X裂解缓冲液一，以获得4纳摩尔的鸟苷五磷酸溶液。使用多通道移液器和带滤芯的移液器吸头，将10微升的鸟苷五磷酸混合物与细胞裂解液混合，在室温下孵育5分钟。孵育结束后，将96孔针工具在0.01%的非离子型去污剂溶液中清洗3次，每次30秒，每次清洗后在纸巾上干燥30秒，然后将针工具放入96孔样品板中。

30秒后，将点样针工具垂直向上提起，并垂直向下插入硝酸纤维素膜中，持续30秒。干燥5分钟后，将硝酸纤维素膜放入透明塑料文件夹中，用于储存，并进行磷屏曝光，通过磷光成像系统进行检测，操作如图所示。为了定量分析并鉴定潜在的目标蛋白，在磷光成像仪配套的分析软件中打开已成像平板的凝胶文件。

为了确定待分析的斑点，使用阵列分析功能设置一个12列8行的网格。为圈定孔状斑点的外缘，定义较大的圆，将所定义大圆的体积加背景以及面积导出至电子表格。为圈定内部较小的点，缩小所定义的圆，导出所定义小圆的体积加背景以及面积，并将所有数据保存在电子表格中。

根据需要调整圆圈位置以与斑点重叠，并将圆圈大小调整为略大于实际斑点。使用公式在电子表格中计算结合分数并绘制数据。随后，在结合分数明显高于大多数其他孔的孔中鉴定潜在的结合蛋白。

在此代表性分析中，可观察到大多数孔的背景结合信号相对较低的酶标板。由于鸟苷五磷酸结合蛋白 Hpt 过表达，H3 孔中的阳性结合信号表现出远高于其他孔的结合比例。在代表性酶标板中，多个孔显示出相对较高的背景结合信号，这体现在许多孔中观察到的相对明显的内部斑点，以及定量后观察到的持续较高的结合比例。

值得注意的是，某些靶标也表现出可变的结合比例，例如假阳性结果。为了进一步澄清，研究人员使用纯化的蛋白质重新检测结合情况。一旦鉴定出靶标蛋白质，即可将其纯化至均一，并通过 DRaCALA、等温滴定 calorimetry 或其他方法验证相互作用的强度和特异性。

鉴定小信号分子的作用靶蛋白，有助于深入理解这些分子在细菌毒力乃至人类生物学功能中所起的作用。