激酶底物对鉴定使用高通量筛选

该程序的总体目标是使用高通量筛选方法鉴定磷酸化目标底物的激酶。这是通过首先用表达激酶 FU 的质粒横切细胞来实现的，这些激酶 FU 作为转移酶或 GST 转化为谷胱甘肽。第二步是执行 A GST 激酶下拉。

接下来，将样品加载到凝胶中，然后进行电泳并用 kumasi 亮蓝染料染色。最后一步是干燥凝胶并将它们暴露在自动射线照相胶片中。最终，通过显影和解释所得的薄膜，人们能够识别激酶底物对，因为每个泳道都代表不同的激酶测定。

鉴定已知磷酸化底物的激酶的现有方法包括使用生物信息学方法在底物中搜索共有位点，使用生化技术和试错法检测激酶和底物之间的复合物，根据已知的生物学功能搜索 conte 共有底物。这些方法非常耗时，而且并不总是能取得成功。我们的方法允许根据功能结果快速识别激酶底物对。

当我们第一次想到这种方法时，我们担心体外特异性不足。事实证明，底物特异性非常好，我们经常发现只有家族成员激酶能够在筛选中磷酸化给定的底物。当我们在每个筛选中使用多种底物进行多重检测时，这一点尤其明显，演示该程序将是我实验室的技术人员 按照文本方案中的描述从准备试剂、板和细胞开始程序。

如果含有激酶质粒的板已被冷冻，请在室温下解冻，并以 1900 倍 G 离心 3 分钟，以收集孔底的任何水分。将 8.6 mL 减血清培养基与 312.7 μL 脂质体转染试剂混合，让混合物在每个孔中静置 5 分钟。在 96 孔板中，含有 10 μL 还原血清培养基的激酶质粒。

使用装有小容量凝胶盒的自动液体分配器，然后每孔添加 10 μL 还原血清培养基转染试剂混合物，使用装有小体积凝胶盒的自动液体分配器，让板静置 20 至 45 分钟。接下来，复苏以每毫升 75 万个细胞的速度悬浮 2 个 T 细胞，溶于 80 毫升完全 delcos 修饰等于培养基或 DMEM 中，每孔 100 微升细胞悬液。使用配有标准体积盒的自动液体分配器，在显微镜下检查孔是否均匀分布，然后将板放回 37 摄氏度培养箱中 24 小时。

开始 GST 激酶下拉实验。将 60 微升 0.2 摩尔钒酸钠与 540 微升水混合在第二根管中，混合 2.7 微升 30% 过氧化物和 1.4 毫升磷酸盐缓冲盐水或 PBS，制成每钒酸盐 4 毫摩尔溶液。将两种溶液一起加入，让混合物静置 15 分钟后再使用。

使用多通道移液器，在每个孔中分配 2 微升 0.25 摩尔氯化钙，然后分配 2.5 微升经过验证的椰枣溶液。将每个板在 37 摄氏度下孵育 10 分钟，然后放在冰上，将板保持在冰上。从每个孔中取出培养基，立即使用每孔 50 μL 的冰冷裂解缓冲液的真空。

使用配有标准分液盒的自动液体分配器，让板在冰上静置 30 分钟以去除虱子。在 4 摄氏度下以 1900 倍 G 离心板 3 分钟后，使用多通道移液器从每个孔中刮取细胞，并将所有内容物转移到适当标记的 vbo 中。96 孔板在旋转过程中以 1900 倍 G 在 4 摄氏度下旋转板 10 分钟，离心填充谷胱甘肽包被板/孔 100 μL 的冰冷裂解缓冲液。

冲洗时，将板子放在冰上。离心底板后，将谷胱甘肽板倒置在水槽上，以抖出裂解缓冲液并在纸巾上吸干。通过倾斜板并使用多通道移液器将裂解缓冲液从 V 底板转移到谷胱甘肽板，注意不要干扰底部的沉淀。

然后盖上盘子，在冰上放置至少两个小时。为了在接近两小时结合步骤结束时结合，请准备一个放射性工作站，确保为放射性工作采取了必要的安全预防措施。将杂交炉设置为 30 摄氏度。

将谷胱甘肽板倒置在水槽上，以抖出裂解缓冲液，并在纸巾上吸干。用 100 微升不含 PMSF 的裂解缓冲液冲洗孔 3 次。不要让井保持干燥。

将它们放在冲洗液中，直到准备好继续。接下来，按照文本方案中的说明制备 55 毫升 1 X 激酶缓冲液或 1 x kb。使用装有标准体积盒的自动液体分配器向板的每个孔中加入 50 微升 1 x kb。

然后通过制备含有目标底物和髓鞘碱性蛋白或 MVP 的溶液来制备溶液 A，如文本方案中所述，一次一个。将板倒置在水槽上，去除纸巾上的一个 XKB 冲洗图，并立即加入 30 微升溶液 A.使用装有小容量盒的自动液体分配器。将盘子放在冰上。

接下来，按照文本方案中的说明，在放射性工作区域以每孔 20 微升溶液 B 制备溶液 B。使用连续移液器，由于顶出力而有助于混合，盖上盖子，并将板在 30 摄氏度的杂交炉中孵育 30 分钟。30 分钟后，将板放回冰块中。

然后使用多通道移液器向每个孔中加入 50 微升 2 x 乙酸钠或 SDS 裂解缓冲液。本节中的所有工作都应在指定用于无线电活动的区域进行。打开杂交炉并将其设置为 85 摄氏度。

柱温箱达到温度后，将板转移到柱温箱中并孵育 10 分钟以使样品变性。下一次加载。26 孔预制胶，每个反应 15 μL。

使用多通道移液器一次填充多个孔，必须注意所有吸头与相应的孔对齐。在添加样品之前，请在 150 V 电压下运行凝胶。不要让蓝线从凝胶底部流出，因为它含有未掺入的 A TP。然后拆解凝胶并去除未掺入的 TP，因为它会使胶片上的凝胶曝光变暗。

将凝胶放入贴有标签的容器中，用 kumasi 染色剂覆盖 15 分钟。接下来，去除 kumasi 染色剂。用水短暂冲洗凝胶并加入滞留液。

保留凝胶，直到蛋白质清晰可见。每个样品都应该可以看到 MVP 条带和底物条带。要干燥凝胶，请剪下一大张滤纸并将其放在干燥机上。

用蒸馏水润湿玻璃纸，直到它光滑无皱，然后将其放在纸上。将凝胶放在玻璃纸片的顶部，记下凝胶的顺序。弄湿第二张玻璃纸片，放在凝胶上。

擀开所有气泡以获得漂亮均匀的表面。关闭翻盖，打开真空吸尘器，在 80 摄氏度下驱动凝胶 3 小时。凝胶干燥后，使用屏幕将它们暴露在剂自动射线照相胶片中以增强信号。

用 saran 包装或塑料袋包裹盒并用胶带密封以防止霜冻，然后在零下 80 摄氏度下将盒存放过夜。第二天，从冰箱中取出凝胶盒，在室温下解冻。根据所示的制造商说明，使用胶片处理器在暗室中显影胶片。

以下是筛选 180 种激酶的代表性结果，使用对应于 kreb 调节转录共激活因子 2 或 C RTC 2 的氨基酸 268 至 283 的 GST 标记肽底物筛选，以及经典激酶测定底物髓鞘碱性蛋白或 MBP 仅 2。激酶标记 2 和高度相关的激酶标记 3 磷酸化。CRTC 双肽 MBP 作为内部对照包含在所有分析中，因为它包含许多磷酸基相关残基，并以 18 道尔顿的速度向凝胶底部运行。

这允许对特异性进行解释。一些激酶会强烈磷酸化底物和 MVP。值得注意的是，单独含有 GST 的孔总是纯化一些内源性激酶活性。

因此，检测中始终存在背景磷酸化。虽然这并不排除底物的磷酸化是真实的，但它确实表明在体外环境中，激酶的选择性可能较低。包括不同分子量的多种底物以得出有关激酶底物特异性的结论特别有用。

由于筛选是在体外进行的，并且在体内存在额外的复杂性，因此必须在细胞中验证候选激酶。例如，候选激酶可能具有在体外磷酸化底物的能力，但它不在与底物相同的细胞类型或隔室的相同亚细胞中表达。这通常是使用 RNAi 介导的候选物沉默来完成的。

也可以使用底物的非磷酸基相关突变体进行二次筛选，以确认特异性。