利用高通量筛选鉴定激酶-底物配对

本实验的总体目标是利用高通量筛选方法，鉴定能够磷酸化特定底物的激酶。首先，将表达激酶融合谷胱甘肽S-转移酶（GST）的质粒转染细胞；第二步是进行GST激酶下拉实验。

接下来，将样品上样至凝胶中，电泳分离后用考马斯亮蓝染色。最后一步是将凝胶干燥并曝光于放射自显影胶片。通过显影和分析所得胶片，可鉴定激酶-底物配对关系，因为每条泳道代表一个独立的激酶活性检测。

目前用于鉴定已知磷酸化底物的激酶的方法包括：利用生物信息学方法在底物中搜索共有序列位点，通过生化技术检测激酶与底物之间的复合物并结合试错法，或基于底物已知的生物学功能寻找共有的底物特征。这些方法耗时较长，且并不总能成功。我们的方法能够基于功能结果实现激酶-底物配对的快速鉴定。

当我们最初提出这一方法时，我们担心在体外实验中可能缺乏足够的特异性。但事实证明，底物特异性非常优异，我们经常发现，在筛选中只有同一家族的激酶能够磷酸化特定的底物。当我们在每次筛选中多重使用多个底物时，这一特性尤为明显。该操作步骤将由本实验室的技术员 Courtney 开始，首先按照文本方案中所述准备试剂、培养板和细胞。

若含有激酶质粒的板已冷冻，请在室温下解冻，并在1900 × g条件下离心3分钟，以收集孔底部的任何冷凝液。将8.6毫升低血清培养基与312.7微升脂质转染试剂混合，静置5分钟，然后每孔加入10微升该混合物至含有激酶质粒的96孔板中。

使用配备小体积盒的自动液体分液器，每孔加入 10 µL 减血清培养基-转染试剂混合物，然后将培养板静置 20 至 45 分钟。接着，将 293T 细胞重悬于 80 mL 完全 DMEM 培养基中，使细胞浓度为 75 万个细胞/毫升，并向每孔加入 100 µL 细胞悬液。使用配备标准体积盒的自动液体分液器加样后，在显微镜下检查各孔细胞分布是否均匀，随后将培养板放回 37°C 培养箱中继续培养 24 小时。

开始 GST 激酶下拉实验。取 60 µL 0.2 M 钒酸钠与 540 µL 水混合，配制 4 mM 钒酸盐溶液；在另一管中，将 2.7 µL 30% 过氧化氢与 1.4 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）混合。将两种溶液合并，室温静置 15 分钟后使用。

使用多通道移液器，向每个孔中加入 2 µL 的 0.25 M 氯化钙，随后加入 2.5 µL 经验证的日期溶液。将每块板在 37°C 下孵育 10 分钟，然后置于冰上，保持板始终处于冰上。使用真空装置从每个孔中吸除培养基，并立即向每孔加入 50 µL 冰冷裂解缓冲液。

使用配备标准盒的自动液体分配器，将酶标板置于冰上静置30分钟以进行裂解。在4°C条件下以1900 × g离心3分钟后，用多通道移液器刮下每个孔中的细胞，并将所有内容物转移至相应标记的vbo中。对于96孔板，在4°C条件下以1900 × g离心10分钟的同时，向每孔中加入100 µL预冷的裂解缓冲液，填充经谷胱甘肽包被的酶标板。

作为清洗步骤，将平板置于冰上。对深孔板进行离心后，将谷胱甘肽平板倒置在水槽上方，轻轻晃动以弃去裂解缓冲液，然后用纸巾吸除残留液滴。通过倾斜深孔板并使用多通道移液器，将裂解缓冲液从V型底板转移至谷胱甘肽平板，注意不要扰动底部的沉淀物。

然后盖上培养皿，置于冰上至少两小时。在接近两小时结合步骤结束前，准备放射性工作站，确保已采取必要的安全防护措施以进行放射性操作。将杂交炉温度设置为30摄氏度。

将谷胱甘肽包被板倒置于水槽上方，轻轻摇晃以倒出裂解缓冲液，并用纸巾吸干。用不含PMSF的裂解缓冲液每孔100 µL洗涤3次。切勿让孔板干燥。

在准备进行下一步前，将其保留在清洗液中。接下来，按照文本方案中的描述，准备 55 毫升的 1× 激酶缓冲液（1× KB）。使用配备标准体积盒的自动液体分配器，向板的每个孔中加入 50 微升 1× KB。

然后，按照文本方案中的说明，依次配制含有目标底物以及髓鞘碱蛋白或MVP的溶液A。将培养板倒置在水槽上方，用纸巾吸去一次XKB洗涤液，立即使用配备小体积盒的自动液体分配器向每孔加入30 µL溶液A。保持培养板置于冰上。

接下来，在放射性工作区域按照文本方案中每孔20 µL溶液B的量配制溶液B。使用多通道移液器，借助其排液力充分混匀，然后将酶标板置于30 °C杂交炉中孵育30分钟。30分钟后，将酶标板转移回冰上。

然后使用多通道移液器向每个孔中加入 50 µL 的 2× 柠檬酸钠-十二烷基硫酸钠（SDS）裂解缓冲液。本部分所有操作均应在指定的放射性工作区域进行。打开杂交炉并将其温度设置为 85 °C。

当烤箱达到设定温度后，将培养皿转移至烤箱中，孵育10分钟以使样品变性。随后，将每个反应的15微升样品上样至26孔预制胶中。

使用多通道移液器同时填充多个孔时，必须确保所有吸头与对应的孔对齐。在加样前，以150伏电压预电泳运行凝胶。切勿让蓝色条带跑出凝胶底部，因为该条带含有未掺入的ATP。然后拆卸凝胶，并去除未掺入的ATP，否则会在胶片曝光时使凝胶背景变深。

将凝胶放入已标记的容器中，加入考马斯亮蓝染色液，染色15分钟。随后，去除考马斯亮蓝染色液，用清水短暂漂洗凝胶，然后加入脱色液。

等待凝胶中的蛋白质清晰可见。每个样品应显示出MVP条带和底物条带。为干燥凝胶，裁剪一张较大的滤纸并将其放置在干燥器上。

将玻璃纸片浸入蒸馏水中，直至其变得平滑且无皱褶，然后将其放置在纸张上方。将凝胶依次放置在玻璃纸片上，并记录凝胶的排列顺序。用另一张玻璃纸片浸湿后覆盖在凝胶上方。

排出所有气泡，以获得平整均匀的表面。合上盖板，开启真空，于80摄氏度下电泳运行凝胶3小时。待凝胶干燥后，使用增感屏将其暴露于双乳化自显影胶片中以增强信号。

用保鲜膜或塑料袋包裹胶片盒，并用胶带密封，以防止结霜，然后在 −80 °C 下过夜保存。次日，从冷冻箱中取出胶片盒，在室温下解冻。按照所示的制造商说明书，在暗室中使用胶片处理器显影胶片。

以下是筛选结果的代表性示例：使用 GST 标记的肽段底物对 180 种激酶进行了筛选，该肽段对应于由 Kreb 调控的转录共激活因子 2（CRTC2）的第 268 至 283 位氨基酸，同时还使用了经典的激酶检测底物——髓鞘碱性蛋白（MBP）。结果显示，MARK2 激酶以及与其高度同源的 MARK3 激酶均能磷酸化 CRTC2 肽段。在所有实验中，MBP 作为内参对照，因其含有多个可磷酸化的残基，并且在凝胶中迁移至底部附近，分子量约为 18 千道尔顿。

这有助于对特异性的解读。某些激酶会强烈地磷酸化底物和MVP。值得注意的是，仅含有GST的孔始终会纯化出一些内源性激酶活性。

因此，该检测中始终存在背景磷酸化。尽管这并不排除底物磷酸化的可能性，但它提示在体外条件下，激酶的选择性可能较低。包含多种不同分子量的底物对于判断激酶底物特异性尤为有意义。

由于该筛选是在体外进行的，而在体内存在更复杂的因素，因此必须在细胞中对候选激酶进行验证。例如，某种候选激酶可能在体外具有磷酸化底物的能力，但在体内可能并不在与底物相同的细胞类型或相同亚细胞区域中表达。这一验证通常通过RNAi介导的候选基因沉默来实现。

还可以使用与磷酸化无关的底物突变体进行二次筛选，以确认特异性。