Name: 激酶底物对鉴定使用高通量筛选 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: 了解高通量筛选鉴定激酶底物对的方法，使用GST激酶pull-down和凝胶电泳技术。该方法可快速分析激酶活性，有助于研究细胞信号传导中的蛋白质磷酸化机制。

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本工作由NSERC资助项目 386634支持。我们感谢Screaton实验室成员提供的有益讨论。

1. 试剂、培养板和细胞的准备
<ol>
	<li>配制500 ml裂解缓冲液：25 mM Tris（pH 7.5）、150 mM NaCl、50 mM NaF、0.5 mM EDTA（pH 8.0）、0.5% Triton X-100、5 mM β-甘油磷酸钠、5%甘油。4 °C保存。使用前立即加入1 mM二硫苏糖醇（DTT）、1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）和1 mM钒酸钠。此步骤后，任何洗涤缓冲液中均无需再添加PMSF。</li>
	<li>配制20 ml 10×激酶缓冲液：200 mM Tris（pH 7.5）、50 mM β-甘油磷酸钠（分子量216）、2 mM钒酸钠。分装至1 ml离心管中，-20 °C保存。使用前立即加入5 mM DTT。</li>
	<li>配制20 ml 10× M-ATP缓冲液：300 µM三磷酸腺苷（ATP）、66 mM MgCl2、33 mM MnCl2。分装至1 ml离心管中，-20 °C保存。</li>
	<li>配制100 ml 2×十二烷基硫酸钠（SDS）裂解缓冲液：1.5 g TRIS碱、20 ml甘油、30 ml H2O。溶解后用HCl调节pH至6.8。加入40 ml 10% SDS，定容至100 ml。加入25 mg溴酚蓝。</li>
	<li>在96孔板中每孔点样4 µl浓度为25 ng/µl的编码GST-激酶的哺乳动物表达质粒14，每块板标记清楚。密封后于-20 °C冷冻保存，直至使用。</li>
	<li>转染前1-2天，在含10%胎牛血清（FBS）和抗生素的完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养HEK293T细胞，置于37 °C、含CO2（终浓度5%）的培养箱中。用胰酶传代，扩增过程中避免细胞融合度超过&#62;80%。筛选实验至少需要6 × 107个细胞（约相当于3个15 cm培养皿中80%融合度的HEK293T细胞）。</li>
</ol>
2. 转染
注意：整个实验方案的流程图见图1。
<ol>
	<li>若含有激酶质粒的培养板已被冷冻，请在室温下解冻，并以 1,900 × g 离心 3 分钟，使孔底部的冷凝液聚集到底部。</li>
	<li>将 8.6 ml 的低血清培养基（例如，OPTI-MEM）与 312.7 µl 脂质转染试剂混合。静置 5 分钟。</li>
	<li>使用配备小体积卡匣的自动液体分配器，向每孔加入 10 µl 低血清培养基。</li>
	<li>使用配备小体积卡匣的自动液体分配器，向每孔加入 10 µl 步骤 2.2 中的低血清培养基/转染试剂混合液。静置 20 至 45 分钟。</li>
	<li>将 293T 细胞以 7.5 × 105 个细胞/ml 的浓度重悬于 80 ml 完全 DMEM 培养基中。使用配备标准体积卡匣的自动液体分配器，每孔加入 100 µl 细胞悬液（即 7.5 × 104 个细胞）。</li>
	<li>在显微镜下检查各孔细胞分布是否均匀，并将培养板放回培养箱中孵育 24 小时。</li>
</ol>
3. GST-激酶下拉实验
<ol>
	<li>现配：将60 µl的0.2 M钒酸钠与540 µl的H2O混合，制备4 mM过钒酸盐溶液。在另一管中，将2.7 µl的30%过氧化氢与1.4 ml PBS混合。将两种溶液混合后，室温静置15分钟后再使用。</li>
	<li>使用多通道移液器（请勿使用自动液体分配器，因其会在孔中产生过多湍流）向每孔加入2 µl的0.25 M CaCl2，随后加入2.5 µl步骤3.1中制备的过钒酸盐溶液。将每块板在37 °C孵育10分钟，然后置于冰上。</li>
	<li>按照第1节（试剂制备）中的说明，加入DTT、PMSF和钒酸钠，制备35 ml裂解缓冲液。</li>
	<li>保持板在冰上，使用真空抽吸装置从每孔中移除培养基。立即使用配备标准卡匣的自动液体分配器向每孔加入50 µl预冷的裂解缓冲液。在冰上静置30分钟以完成裂解（可选：如需暂停，可密封板并储存于-80 °C；继续实验时，在冰上解冻）。</li>
	<li>在4 °C下以1,900 × g离心3分钟。</li>
	<li>使用多通道移液器刮下每孔中的细胞，并将全部内容物转移至相应标记的V型底96孔板中。在4 °C下以1,900 × g离心10分钟。</li>
	<li>在离心过程中，向谷胱甘肽包被的板（每块96孔板对应一块）中每孔加入100 µl预冷的裂解缓冲液（不含PMSF）进行冲洗。保持板在冰上。</li>
	<li>将V型底板从离心机中取出。逐块将谷胱甘肽板倒置在水槽上方，轻轻摇晃以去除裂解缓冲液，并在纸巾上轻拍吸干。通过倾斜V型底板，使用多通道移液器将裂解液转移至谷胱甘肽板中，注意不要扰动底部的沉淀。盖上板盖，置于冰上至少2小时以完成结合。</li>
	<li>在2小时结合步骤接近结束时，准备放射性工作站，确保已采取必要的放射性操作安全防护措施。将杂交炉温度设定为30 °C。</li>
	<li>按照第1节中的说明，加入DTT和钒酸钠，制备200 ml裂解缓冲液。此阶段无需添加PMSF。</li>
	<li>将谷胱甘肽板倒置在水槽上方，摇晃去除裂解缓冲液，并在纸巾上轻拍吸干。用100 µl裂解缓冲液（不含PMSF）清洗各孔3次。切勿让孔干燥——应保持在冲洗液中直至下一步操作。</li>
	<li>按照第1节中的说明，通过稀释10倍储存液并加入DTT，制备55 ml 1×激酶缓冲液（KB）。使用配备标准体积卡匣的自动液体分配器，用50 µl 1× KB清洗板一次。将1× KB保留在孔中，直至溶液A准备就绪：
	<ol>
		<li>通过加入500至530 µg目标底物、500 µg髓鞘碱性蛋白（MBP）、2.65 ml 10× KB、13.25 µl 1 M DTT，并加H2O至总体积15.9 ml，制备溶液A。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>逐块将板倒置在水槽上方，去除1× KB冲洗液，在纸巾上轻拍吸干，立即使用配备小体积卡匣的自动液体分配器向每孔加入30 µl溶液A。保持板在冰上。</li>
	<li>在放射性工作区中，通过加入2.5 ml 10× M-ATP、500 µCi γ-32P ATP，并加H2O至10 ml，制备溶液B。
	<ol>
		<li>使用重复移液器每孔加入20 µl溶液B（其喷出力有助于混合）。盖上板盖，在30 °C杂交炉中孵育30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>30分钟后，将板移回冰上。使用多通道移液器向每孔加入50 µl 2× SDS裂解缓冲液。此时可继续下一步操作，或用铝箔密封板后于-20 °C保存至方便时再处理。</li>
</ol>
4. 凝胶的电泳、染色与干燥
注意：所有操作均应在指定的放射性工作区域进行。
<ol>
	<li>打开杂交炉并设置温度为 85 °C。将样品板在室温下解冻。待炉温达到设定值后，将样品板转移至炉中，孵育 10 分钟以使样品变性。</li>
	<li>使用多通道移液器将每个反应的 15 µl 产物同时加入 26 孔预制胶中，以填充多个孔。加样前必须确保所有吸头与对应的加样孔对齐。在 150 V 条件下电泳运行凝胶。切勿让示踪染料（蓝色条带）跑出凝胶底部，因为其中含有未掺入的 ATP。</li>
	<li>拆卸凝胶后，用手术刀或直边工具切去含有未掺入 ATP 的部分（蓝色条带），以避免过度曝光胶片。将凝胶放入标记好的容器中，加入考马斯亮蓝染色液，染色 15 分钟。</li>
	<li>移除考马斯亮蓝染色液，用清水短暂漂洗凝胶，然后加入脱色液。脱色至蛋白质条带清晰可见为止。每个样品应可见 MBP 条带和底物条带。</li>
	<li>凝胶干燥步骤如下：
	<ol>
		<li>裁剪一张较大的滤纸，平铺于干燥器上。</li>
		<li>将一张玻璃纸用蒸馏水润湿至平滑无皱，覆盖在滤纸上。</li>
		<li>将凝胶置于玻璃纸上，并记录凝胶的排列顺序。用第二张润湿的玻璃纸覆盖在凝胶上方。</li>
		<li>用滚轮（如封板器滚轮）滚压排出所有气泡，以获得均匀平整的表面。合上盖板，开启真空，于 80 °C 干燥 3 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>凝胶干燥后，将其置于增感屏上，用 XAR 胶片进行曝光。用保鲜膜或塑料袋包裹暗盒，并用胶带密封，以防霜冻。将暗盒于 -80 °C 保存过夜。</li>
</ol>
5. 制备XAR薄膜
<ol>
	<li>次日，将盒式装置从冷冻箱中取出，在室温下解冻。根据制造商说明书，在暗室中使用胶片处理器显影胶片。 
	注意：检查胶片上是否存在激酶-底物配对的证据。进行第二次较长时间的曝光也有助于检测较弱的磷酸化事件。</li>
</ol>

<ol><li>Meisenhelder, J., Hunter, T., van der Geer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphopeptide+mapping+and+identification+of+phosphorylation+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Phosphopeptide mapping and identification of phosphorylation sites.</a> Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18 19(2001).</li>
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<li>Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+kinase+complement+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The protein kinase complement of the human genome.</a> Science. 298, 1912-1934 (2002).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

自最初描述该方法的文献发表以来14,15，最初的180种GST激酶文库已扩展至420种，约占人类蛋白激酶组的80%。借助扩展后的文库，本方案的实验周期为4至5天，随后根据需要再用1至4天进行膜显影；若采用磷屏成像和数字信号增强技术，可进一步缩短时间。在多个关键步骤中需格外注意（实验流程概览见图1）。第一步是确保细胞储备状态良好（无支原体污染、扩增过程中从未达到完全汇合状态，且每次传代均使用胰蛋白酶处理），无论是在批量扩增阶段，还是在转染时的96孔板中。细胞接种应均匀，转染时汇合度应达到约80%（步骤1.5）。
其次，在转染过程中最好使用自动液体分液器，以尽量减少体积转移误差，从而降低各孔之间的变异系数（“CVs”）。对于小体积操作，为分液器配备较小体积的加样卡匣可减少死体积导致的试剂损耗，并提高加样准确性。使用钒酸钠（一种广谱酪氨酸磷酸酶抑制剂）处理步骤作为通用刺激手段，以提高目标激酶的磷酸化水平。在此步骤中加入钙离子可增强细胞与基质的黏附，防止因长时间钒酸钠处理引起的细胞变圆而导致细胞脱落。该步骤应严格遵循10分钟的孵育时间...

蛋白质翻译后修饰（PTM）对于细胞内通讯至关重要。在所有已知的翻译后修饰中，研究最为深入的是由蛋白激酶催化的磷酸化修饰，该修饰可调控多种蛋白质功能，包括其生物化学活性、亚细胞定位、构象以及稳定性。靶蛋白上磷酸化位点的鉴定可通过胰蛋白酶磷酸肽图谱法，或目前标准的蛋白质组学技术实现，后者使用富集了磷酸化肽段的样品进行分析1,2。尽管预计四分之三的表达蛋白组可能发生磷酸化3，目前已鉴定的磷酸化位点达20万个5，甚至估计可达100万个6，但其中许多位点尚未明确其生物学功能、信号通路或对应的蛋白激酶。
尽管鉴定磷酸化位点相对直接，但更具挑战性的是鉴定靶向这些位点的对应激酶，这一过程我们称之为激酶：底物配对关系的映射。已有多种方法用于鉴定激酶：底物配对关系，这些方法要么从感兴趣的激酶出发寻找其底物，要么从感兴趣的底物出发，通过实验7-11或计算方法12寻找修饰该底物的激酶。为了鉴定已知磷酸化底物对应的激酶，可利用生物信息学方法识别包含磷酸化残基侧翼短保守氨基酸序列（即共有序列位点）的蛋白质，也可识别能与该底物形成可沉淀复合物的激酶。然而，这些方法耗时较长，且常常难以成功。
我们开发了一种系统的功能方法，以快速鉴定能够磷酸化特定底物的激酶 13该筛选实验具有优异的特异性，能够清晰地筛选出潜在的对应激酶。鉴于磷酸化在生物信号传导中的核心作用，该筛选方法几乎适用于所有细胞信号通路中的新发现。 14-16该筛选涉及使用人蛋白激酶文库进行大规模激酶活性检测。这些激酶带有细菌谷胱甘肽S-转移酶（GST）标签，并从哺乳动物细胞提取物中纯化获得，因此这些重组酶——与从细菌表达系统制备的重组酶不同——是在上游蛋白激酶存在的条件下生成的，而这些上游激酶通常对于重组酶获得活性至关重要。 体外确实，尽管酵母中存在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸激酶活性，这些活性对于下游激酶的激活是必需的 10，酵母基因组编码122种蛋白激酶，表明哺乳动物激酶组包含500多个基因 17，为了调控高等生物特有的生命过程，其复杂性已显著增加。此外，细胞生物学和人类疾病相关不同刺激物（如小分子、生长因子、激素）的影响 等等。) 可用于 14,15在适当的情境下调节激酶活性。

<table><tbody><tr><td>裂解缓冲液</td><td>实验室自制</td><td></td><td>参见实验方案步骤 1.1</td></tr><tr><td>10x 激酶缓冲液</td><td>实验室自制</td><td></td><td>参见实验方案步骤 1.2</td></tr><tr><td>10x M-ATP</td><td>实验室自制</td><td></td><td>参见实验方案步骤 1.3</td></tr><tr><td>人源激酶质粒</td><td>Orfeome, Invitrogen, Origene</td><td></td><td>实验室中进行 GST 标签修饰</td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Fisher Scientific</td><td>CS003595</td><td></td></tr><tr><td>293T 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002201</td><td>添加 100&amp;nbsp;U/ml 青霉素、100&amp;nbsp;&amp;#956;g/ml 链霉素和 10% 胎牛血清。</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Sanyo</td><td>MCO-17AIC</td><td></td></tr><tr><td>15 cm 细胞培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>877224</td><td></td></tr><tr><td>低血清培养基</td><td>Invitrogen</td><td>22600-050</td><td></td></tr><tr><td>脂质转染试剂</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>自动液体分配仪</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>小型卡匣附件</td><td>Thermo Scientific</td><td>24073295</td><td></td></tr><tr><td>标准卡匣附件</td><td>Thermo Scientific</td><td>14072670</td><td></td></tr><tr><td>4 mM 过钒酸盐</td><td>实验室自制</td><td></td><td>参见实验方案步骤 3.1</td></tr><tr><td>0.25 M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>实验室自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>多通道移液器（20–200 &amp;#956;l）</td><td>Labnet</td><td>p4812-200</td><td></td></tr><tr><td>多通道移液器（1–10 &amp;#956;l）</td><td>Thermo Scientific</td><td>4661040</td><td></td></tr><tr><td>V 型底 6 孔板</td><td>Evergreen Scientific</td><td>290-8116-01V</td><td></td></tr><tr><td>谷胱甘肽包被的 96 孔板</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-15240</td><td></td></tr><tr><td>杂交炉</td><td>Biostad</td><td>350355</td><td></td></tr><tr><td>带有 GST 标签的底物</td><td>实验室自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>髓鞘碱性蛋白（MBP）</td><td>Sigma</td><td>M1891</td><td></td></tr><tr><td>重复移液器（1 ml）</td><td>Eppendorf</td><td>22266209</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P γ-ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU502Z500UC</td><td></td></tr><tr><td>2x SDS 裂解缓冲液（100&amp;nbsp;ml）</td><td>实验室自制</td><td></td><td>参见实验方案步骤 1.4</td></tr><tr><td>26 孔预制 TGX 凝胶</td><td>BioRad</td><td>567-1045</td><td>所需凝胶浓度取决于目标底物的分子量</td></tr><tr><td>考马斯亮蓝染色液</td><td>实验室自制</td><td></td><td>0.1% 考马斯亮蓝 R250，10% 乙酸，40% 甲醇</td></tr><tr><td>考马斯亮蓝脱色液</td><td>实验室自制</td><td></td><td>10% 乙酸，20% 甲醇</td></tr><tr><td>标记的凝胶容器</td><td>实验室自制</td><td></td><td>使用空移液枪头盒上的塑料盖，大小刚好可容纳一块凝胶</td></tr><tr><td>Whatman 滤纸</td><td>Fisher Scientific</td><td>57144</td><td></td></tr><tr><td>玻璃纸片（2 张）</td><td>BioRad</td><td>165-0963</td><td></td></tr><tr><td>凝胶干燥仪</td><td>Labconco</td><td>4330150</td><td></td></tr><tr><td>双乳胶放射自显影胶片</td><td>VWR</td><td>IB1651454</td><td></td></tr><tr><td>胶片暗盒</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBAC-1417</td><td></td></tr><tr><td>增感屏</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBIS-1417</td><td></td></tr><tr><td>板封橡胶滚轮</td><td>Sigma</td><td>R1275</td><td></td></tr></tbody></table>

利用高通量筛选鉴定激酶-底物配对

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

我们开发了一种筛选平台，用于鉴定特异性作用于磷酸化底物的人源蛋白激酶，该平台可用于阐明新的信号转导通路。本方法采用包含纯化的GST标签人源蛋白激酶文库以及目标重组蛋白底物。我们已利用该技术鉴定出MAP/微管亲和力调节激酶2（MARK2）是CREB调节转录共激活因子2（CRTC2）上一个受葡萄糖调控位点的激酶，CRTC2是β细胞增殖所必需的蛋白；同时还鉴定出Axl家族酪氨酸激酶通过磷酸化衔接蛋白ELMO来调控细胞转移。本文描述了该技术，并讨论其如何帮助建立细胞响应环境刺激的全面图谱。

筛选实验的代表性结果如图2所示。使用GST标签的肽段底物（对应CRTC2蛋白的268-283位氨基酸）以及经典的激酶检测底物髓鞘碱性蛋白（MBP），对180种激酶进行了筛选。仅有两种激酶——MARK2以及与其高度同源的MARK3——能够磷酸化CRTC2肽段。所有实验中均包含MBP作为内参对照，因其含有多个可磷酸化残基，且在凝胶中迁移至约18 kDa位置（靠近凝胶底部）。这有助于判断激酶的特异性：某些激酶可同时高效磷酸化目标底物和MBP。值得注意的是，仅含有GST蛋白的孔（即无激酶对照）总会纯化出一定内源性激酶活性，因此实验中始终存在一定背景磷酸化信号。尽管这并不排除底物磷酸化的真实性，但提示在体外实验条件下，激酶的底物选择性可能较低。为准确判断激酶与底物之间的特异性关系，建议同时使用多个分子量不同的底物进行对照分析。
<img alt="激酶活性检测工作流程；质粒转染、结合和孵育步骤示意图。" src="/files/ftp_upload...

蛋白质磷酸化是细胞解读和响应胞外环境信息的核心机制。本文介绍一种高通量筛选方案，利用从哺乳动物细胞中纯化的激酶，快速鉴定能够磷酸化特定底物（或底物群）的激酶。

我们开发了一种筛选平台，用于鉴定特异性作用于磷酸化底物的人源蛋白激酶，该平台可用于阐明新的……

本实验的总体目标是利用高通量筛选方法，鉴定能够磷酸化特定底物的激酶。首先，将表达激酶融合谷胱甘肽S-转移酶（GST）的质粒转染细胞；第二步是进行GST激酶下拉实验。接下来，将样品上样至凝胶中，电泳分离后用考马斯亮蓝染色。最后一步是将凝胶干燥并曝光于放射自显影胶片。通过显影和分析所得胶片，可鉴定激酶-底物配对关系，因为每条泳道代表一个独立的激酶活性检测。目前用于鉴定已知磷酸化底物的激酶的方法包括：利用生物信息学方法在底物中搜索共有序列位点，通过生化技术检测激酶与底物之间的复合物并结合试错法，或基于底物已知的生物学功能寻找共有的底物特征。这些方法耗时较长，且并不总能成功。我们的方法能够基于功能结果实现激酶-底物配对的快速鉴定。当我们最初提出这一方法时，我们担心在体外实验中可能缺乏足够的特异性。但事实证明，底物特异性非常优异，我们经常发现，在筛选中只有同一家族的激酶能够磷酸化特定的底物。当我们在每次筛选中多重使用多个底物时，这一特性尤为明显。该操作步骤将由本实验室的技术员 Courtney 开始，首先按照文本方案中所述准备试剂、培养板和细胞。若含有激酶质粒的板已冷冻，请在室温下解冻，并在1900 × g条件下离心3分钟，以收集孔底部的任何冷凝液。将8.6毫升低血清培养基与312.7微升脂质转染试剂混合，静置5分钟，然后每孔加入10微升该混合物至含有激酶质粒的96孔板中。使用配备小体积盒的自动液体分液器，每孔加入 10 µL 减血清培养基-转染试剂混合物，然后将培养板静置 20 至 45 分钟。接着，将 293T 细胞重悬于 80 mL 完全 DMEM 培养基中，使细胞浓度为 75 万个细胞/毫升，并向每孔加入 100 µL 细胞悬液。使用配备标准体积盒的自动液体分液器加样后，在显微镜下检查各孔细胞分布是否均匀，随后将培养板放回 37°C 培养箱中继续培养 24 小时。开始 GST 激酶下拉实验。取 60 µL 0.2 M 钒酸钠与 540 µL 水混合，配制 4 mM 钒酸盐溶液；在另一管中，将 2.7 µL 30% 过氧化氢与 1.4 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）混合。将两种溶液合并，室温静置 15 分钟后使用。使用多通道移液器，向每个孔中加入 2 µL 的 0.25 M 氯化钙，随后加入 2.5 µL 经验证的日期溶液。将每块板在 37°C 下孵育 10 分钟，然后置于冰上，保持板始终处于冰上。使用真空装置从每个孔中吸除培养基，并立即向每孔加入 50 µL 冰冷裂解缓冲液。使用配备标准盒的自动液体分配器，将酶标板置于冰上静置30分钟以进行裂解。在4°C条件下以1900 × g离心3分钟后，用多通道移液器刮下每个孔中的细胞，并将所有内容物转移至相应标记的vbo中。对于96孔板，在4°C条件下以1900 × g离心10分钟的同时，向每孔中加入100 µL预冷的裂解缓冲液，填充经谷胱甘肽包被的酶标板。作为清洗步骤，将平板置于冰上。对深孔板进行离心后，将谷胱甘肽平板倒置在水槽上方，轻轻晃动以弃去裂解缓冲液，然后用纸巾吸除残留液滴。通过倾斜深孔板并使用多通道移液器，将裂解缓冲液从V型底板转移至谷胱甘肽平板，注意不要扰动底部的沉淀物。然后盖上培养皿，置于冰上至少两小时。在接近两小时结合步骤结束前，准备放射性工作站，确保已采取必要的安全防护措施以进行放射性操作。将杂交炉温度设置为30摄氏度。将谷胱甘肽包被板倒置于水槽上方，轻轻摇晃以倒出裂解缓冲液，并用纸巾吸干。用不含PMSF的裂解缓冲液每孔100 µL洗涤3次。切勿让孔板干燥。在准备进行下一步前，将其保留在清洗液中。接下来，按照文本方案中的描述，准备 55 毫升的 1× 激酶缓冲液（1× KB）。使用配备标准体积盒的自动液体分配器，向板的每个孔中加入 50 微升 1× KB。然后，按照文本方案中的说明，依次配制含有目标底物以及髓鞘碱蛋白或MVP的溶液A。将培养板倒置在水槽上方，用纸巾吸去一次XKB洗涤液，立即使用配备小体积盒的自动液体分配器向每孔加入30 µL溶液A。保持培养板置于冰上。接下来，在放射性工作区域按照文本方案中每孔20 µL溶液B的量配制溶液B。使用多通道移液器，借助其排液力充分混匀，然后将酶标板置于30 °C杂交炉中孵育30分钟。30分钟后，将酶标板转移回冰上。然后使用多通道移液器向每个孔中加入 50 µL 的 2× 柠檬酸钠-十二烷基硫酸钠（SDS）裂解缓冲液。本部分所有操作均应在指定的放射性工作区域进行。打开杂交炉并将其温度设置为 85 °C。当烤箱达到设定温度后，将培养皿转移至烤箱中，孵育10分钟以使样品变性。随后，将每个反应的15微升样品上样至26孔预制胶中。使用多通道移液器同时填充多个孔时，必须确保所有吸头与对应的孔对齐。在加样前，以150伏电压预电泳运行凝胶。切勿让蓝色条带跑出凝胶底部，因为该条带含有未掺入的ATP。然后拆卸凝胶，并去除未掺入的ATP，否则会在胶片曝光时使凝胶背景变深。将凝胶放入已标记的容器中，加入考马斯亮蓝染色液，染色15分钟。随后，去除考马斯亮蓝染色液，用清水短暂漂洗凝胶，然后加入脱色液。等待凝胶中的蛋白质清晰可见。每个样品应显示出MVP条带和底物条带。为干燥凝胶，裁剪一张较大的滤纸并将其放置在干燥器上。将玻璃纸片浸入蒸馏水中，直至其变得平滑且无皱褶，然后将其放置在纸张上方。将凝胶依次放置在玻璃纸片上，并记录凝胶的排列顺序。用另一张玻璃纸片浸湿后覆盖在凝胶上方。排出所有气泡，以获得平整均匀的表面。合上盖板，开启真空，于80摄氏度下电泳运行凝胶3小时。待凝胶干燥后，使用增感屏将其暴露于双乳化自显影胶片中以增强信号。用保鲜膜或塑料袋包裹胶片盒，并用胶带密封，以防止结霜，然后在 −80 °C 下过夜保存。次日，从冷冻箱中取出胶片盒，在室温下解冻。按照所示的制造商说明书，在暗室中使用胶片处理器显影胶片。以下是筛选结果的代表性示例：使用 GST 标记的肽段底物对 180 种激酶进行了筛选，该肽段对应于由 Kreb 调控的转录共激活因子 2（CRTC2）的第 268 至 283 位氨基酸，同时还使用了经典的激酶检测底物——髓鞘碱性蛋白（MBP）。结果显示，MARK2 激酶以及与其高度同源的 MARK3 激酶均能磷酸化 CRTC2 肽段。在所有实验中，MBP 作为内参对照，因其含有多个可磷酸化的残基，并且在凝胶中迁移至底部附近，分子量约为 18 千道尔顿。这有助于对特异性的解读。某些激酶会强烈地磷酸化底物和MVP。值得注意的是，仅含有GST的孔始终会纯化出一些内源性激酶活性。因此，该检测中始终存在背景磷酸化。尽管这并不排除底物磷酸化的可能性，但它提示在体外条件下，激酶的选择性可能较低。包含多种不同分子量的底物对于判断激酶底物特异性尤为有意义。由于该筛选是在体外进行的，而在体内存在更复杂的因素，因此必须在细胞中对候选激酶进行验证。例如，某种候选激酶可能在体外具有磷酸化底物的能力，但在体内可能并不在与底物相同的细胞类型或相同亚细胞区域中表达。这一验证通常通过RNAi介导的候选基因沉默来实现。还可以使用与磷酸化无关的底物突变体进行二次筛选，以确认特异性。

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