方法细胞或DNA的精确本地化转移到着床后早期小鼠胚胎

这些程序的总体目标是展示如何将细胞或 DNA 精确地转移到植入后的早期小鼠胚胎中。这些方法可以帮助回答发育生物学中的关键问题，例如测试体外培养细胞的体内潜力和特定胚胎阶段某些基因的功能。这些技术的主要优点是它们不需要任何专门的设备，并且可以对早期摆姿势的种植园小鼠进行实验作。根据文本方案，在第 E 7.5 或 E 8.5 天处死怀孕的雌性后，使用剪刀和镊子分离子宫，并将其放入一个 30 毫米的培养皿中，其中装有 M 两种培养基和两对细镊子。

小心地撕开子宫肌层，然后剥去蜕膜，小心不要刺穿多余的胚胎腔。用镊子捏住 riker 膜，慢慢将其与胚胎分离。然后在立体解剖显微镜下，检查胚胎，确保卵黄囊羊膜和胎盘锥完整。然后用移液管将胚胎转移到干净的 M 2 培养皿中，并放在冰上或冰平台上的 30 毫米塑料培养皿盖上，以部分冷却胚胎。

根据文本方案准备培养基和培养胚胎，以将培养的细胞移植到小鼠胚胎中。首先使用 200 微升移液器吸头物理刮除原始细胞干细胞，这些细胞普遍从六孔培养板中表达 GFP。将细胞转移到含有胚胎的培养皿中。

将手拉的接枝毛细管连接到抽吸管上，使口腔移液器轻轻吸吮口腔移液器，将一个或多个大于 20 个细胞的细胞团块吸入接枝毛细管。然后轻轻吹出细胞以分散大块。选择一个包含约 10 至 20 个细胞的团块，并将其吸入接枝毛细管中。

同样，用一对镊子将团块保持在靠近毛细血管开口的位置。将胚胎松散地固定到位，并将嫁接毛细管插入感兴趣的区域。创建洞口。

团块从嫁接毛细血管中排出，留下 10 到 20 个细胞的短串留在胚胎中。将胚胎留在 M 2 培养基的同一培养皿中，并使用荧光化合物解剖显微镜和相机对嫁接的胚胎进行成像。将成像时间保持在最低限度，以避免胚胎暴露在过多的光和热下。

使用糊剂成像后，立即将最小体积为 M 两种培养基的胚胎转移到预平衡的培养基中，并在进行电穿孔实验之前根据文本方案中的指南进行培养，使用水平微量移液器极拉动具有细尖端和小于 10 微米开口的 DNA 注射移液器，以避免组织损伤。对于玻璃毛细管电穿孔，使用微型锻造将 DNA 注射移液管的开口切成 20 或 30 微米的内径，尖端干净且无破损边缘。将每个铂电极连接到一根细绝缘丝上，然后将其插入覆盖有绝缘胶带的显微注射针架中。

为了制备手工制作的毛细管电极，将直径为 0.2 毫米的铂丝插入直径为 20 或 30 微米的固定开口的电穿孔玻璃毛细管中。聚焦电流并将血浆 DNA 输送到胚胎中的一小块感兴趣区域。使 L 形电极弯曲直径为 0.2 毫米的铂丝，形成 L 形，L 的水平部分长度约为 1 毫米。

将持针器安装在标准显微作仪器支架上。将毛细管电极连接到电源的阳极。将 L 形电极连接到万用表的阳极。

然后将万用表的阴极连接到电源的阴极。用 PBS 填充电穿孔玻璃毛细管，使其距离顶部 1 到 2 毫米，然后将直铂电极插入玻璃毛细管，直到到达毛细管底部。将 L 形电极固定在装满 PBS 的 30 毫米培养皿的表面上。

使用气动 pico 泵进行 DNA 注射。将注射针从侧胚层插入胚胎的羊膜腔，并将大约 5 微升 DNA 溶液注入腔中或直到腔完全充满。注意不要使胚胎破裂。

然后小心地将胚胎放置在电极之间，并将毛细管电极移动到要输送 DNA 的精确位置。使用 200 伏特的电压，分 6 个脉冲，每个脉冲的持续时间为 50 毫秒，对胚胎进行电穿孔，每个脉冲之间间隔一秒。立即将胚胎转移到预平衡的培养基中，然后对下一个胚胎重复电穿孔。

电穿孔后 2 小时检测电穿孔的活细胞或死细胞。根据此处显示的文本方案，一个具有普遍表达 EGFP 的 epi PSCs 的胚胎，移植在 E 7.5 上并在离体培养 24 小时。当 10 至 16 个 fscs 嫁接到 E 7.5 胚胎中时，它们在宿主胚胎内很好地结合和增殖。

然而，嫁接更多的细胞并不会导致更好的嵌合体，实际上会导致未掺入的团块，如此处所示。如表达 GFP 的质粒的电穿孔所示。电穿孔后 1 至 2 小时检测到 GFP 阳性细胞。

当原始条纹期胚胎中的远端 eblast 细胞被电穿孔时，标记细胞在培养 24 小时后有助于神经真皮，这与胃期胚胎中 eblast 细胞的已知命运图相符。该图显示，与使用其他类型的电极进行电穿孔类似，毛细管电极也会导致目标区域出现一定程度的细胞死亡。由于与相邻区域相比，该区域的颜色更深，因此用膜不渗透的远红外荧光死亡细胞核标记。

证实毛细管电穿孔技术仅在电穿孔位点附近产生少量死细胞。在尝试这些程序时，重要的是在两小时内开始培养胚胎。在培养结束时将子宫与小鼠分离后，可以固定胚胎。

可以执行其他方法，如切片染色，以回答其他问题，例如供体或电编织细胞对宿主胚胎的贡献。看完这个视频，我们应该对如何将细胞我们的 DNA 精确地转移到植入后早期的小鼠胚胎有一个很好的了解。